Técnicas moleculares. DMTV Carolina Acevedo Curso de Microbiología 2015 SÍNTESIS IN VITRO DE UNA GRAN CANTIDAD DE COPIAS DE UN SEGMENTO DE ADN EXISTENTE EN UNA MUESTRA. O sea. Amplificamos en forma exponencial el numero de moléculas de ADN a partir de una molécula blanco (template o molde) la que esta delimitada por primers o cebadores. Es una proceso automatizado. TÉCNICAS MOLECULARES??? PARA QUE SE USAN DETECTAR E IDENTIFICAR GENOMA Amplificar una región de ADN en una enorme cantidad de moléculas secuenciarlas (SECUENCIACIÓN) Cortar una determinada región con enzimas de restricción para ver si por una mutación se gana o se pierde un sitio de restricción (RFLP) separa el ADN, visualizarlo pegarlo (HIBRIDACIÓN) Etc,etc,etc.. Dr Kar Mullis Primer-directed enzmatic amplification of DNA with a thermostable DNA polmerase. Science. 1988, 239(4839):487-91 Thermus aquaticus (Gram - termófila) (Taq) 1988: polmerase chain reaction ADN polimerasa - Taq: Máxima actividad catalítica sobre 75-80 ºC. (Taq polimerasa sólo 10% activ. a 37 ºC) Parque Nacional de Yellowstone. DETECCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS MATERIALES A UTILIZAR : SECRECIONES (leche, saliva, secreciones nasales, etc) TEJIDOS SANGRE DESCAMACIONES CUTÁNEAS Región blanco (secuencia a amplificar) Primers o cebadores Sentido (F) antisentido (R) Los primers son oligonucletodios sinteticos (20 nuct) que hibridan en los extremos de mi secuencia blanco Que está faltando????? Para que amplifique???? La Taq polimerasa.. 1
ETAPAS DE LA PCR ETAPAS DE LA PCR EXTRACCIÓN DEL ACIDO NUCLEICO. PARA LA TÉCNICA DE PCR ES NECESARIO PARTIR DE UN ADN O ARN RELATIVAMENTE PURIFICADO AMPLIFICACIÓN EXTRACCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS. Químicos : proteinasa K detergentes Físicos: temperatura agitación centrifugación PCR ÁCIDOS NUCLEICO: ADN o ARN PURIFICACIÓN: PRECIPITACIÓN: alcohol sales MEZCLA DE REACTIVOS MIX TERMOCICLADOR COMPONENTES DE LA REACCIÓN ETAPAS DE LA PCR EN EL PROCESO DE AMPLIFICACIÓN A D N nucleótidos Primers o cebadores Taq polimerasa 2
Interpretemos resultado Carril 1: el fragmento de PCR es de aproximadamente 1850 pb. Carriles 2 4 : los fragmentos son de aproximadamente 800pb. Carril 3: no ha producto; el PCR falló. Carril 5 : se obtuvieron múltiples bandas porque uno de los iniciadores se une a varias regiones. REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA ADAPTACIONES DE LA TÉCNICA DE PCR Secuencia blanco Reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR) PCR Anidado o Nested In situ PCR PCR Múltiple PCR en tiempo real ( cuantitativa) Corrida electroforética PCR en Tiempo Real (RT-PCR o qpcr) Cuantifica el ADN mediante la detección de una señal fluorescente, la que se incrementa directamente a la cantidad de amplicones producidos en cada ciclo de pcr Preparamos gel Cargamos el producto de PCR Transilminador de UV 3
APLICACIONES PCR en Tiempo Real DETECCIÓN CUANTIFICACIÓN VIRAL EN CADA CICLO. CUANTIFICACIÓN DE EXPRESIÓN DE GENES. MEDIDA DEL ADN DAÑADO CONTROL DE CALIDAD Y VALIDACIÓN DE ENSAYOS. ETC ETC ETC SECUENCIACIÓN Conjunto de métodos técnicas bioquímicas cua finalidad es la determinación del orden de los nucleótidos (A, C, G Y T) en una secuencia blanco (gen). IMPORTANTE PARA: Detectar variabilidad genética Permite estudios de parentesco entre cepas aislamientos. Estudios de epidemiología molecular PCR standard Detección del producto final en gel electroforesis. Cualitativo (cuantitativa) PCR en tiempo Real Análisis de la cinética de la reacción. Detección en cada ciclo. Cuantitativo. SECUENCIACIÓN EPIDEMIOLOGÍA MOLECULAR Es un área de la epidemiología que mide variaciones nucleotidicas. Determina la relación cepas agrupando los diferentes aislamientos en función de sus relaciones genéticas en los árboles filogenéticos. establece vínculos epidemiológicos aislamientos virales, movimiento geográfico de cepas facilita la identificación de la fuente de las cepas de Virus REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA ETAPAS DE LA PCR FILOGENÉTICO DE FIEBRE AFTOSA TIPO O EN SUR AMÉRICA. URUGUAY Y PAÍSES LIMÍTROFES 90% SIMILARIDAD REGIÓN ANDINA VACUNA PAN- ASIA MaliratV (2007) 4
TÉCNICAS DE HIBRIDACIÓN ETAPAS DE LA PCR DETECTA ÁCIDOS NUCLEICOS VIRALES (ADN O ARN) CON EL USO DE SONDAS MARCADAS CON ISOTOPOS RADIOACTIVOS O ENZIMAS Sonda marcadas??? Fragmento de ácido nucleico marcado que es empleado para detectar una secuencia complementaria por hibridación molecular. Southern blot --- detecta ADN Northern blot --- detecta ARN ARN ALTA SENSIBILIDAD Y ESPECIFICIDAD IMPORTANTE EN DIAGNOSTICO ADN Restricción (RFLP). SON LOS FRAGMENTOS DE ADN RESULTANTES DEL CORTE MEDIANTE ENZIMAS DE RESTRICCIÓN (ENDONUCLEASAS). TÉCNICAS DE HIBRIDACIÓN Enzimas de restricción??? son enzimas que reconocen cortan secuencias específicas (4-5 nucleotidos)presentes en el ADN. PCR ETAPAS DE LA PCR 5