UNIVERSIDAD SIMÓN BOLÍVAR DECANATO DE ESTUDIOS PROFESIONALES COORDINACIÓN DE LICENCIATURA EN QUÍMICA

UNIVERSIDAD SIMÓN BOLÍVAR DECANATO DE ESTUDIOS PROFESIONALES COORDINACIÓN DE LICENCIATURA EN QUÍMICA ESTUDIO COMPARATIVO DE LA ACTIVIDAD CISTEÍN PROTEASA EN AISLADOS VENEZOLANOS DE Trypanosoma vivax. Por: María Abelarda de la Concepción Díaz Araque PROYECTO DE GRADO Presentado ante la Ilustre Universidad Simón Bolívar como requisito parcial para optar al título de Licenciada en Química Sartenejas, Enero de 2010

UNIVERSIDAD SIMÓN BOLÍVAR DECANATO DE ESTUDIOS PROFESIONALES COORDINACIÓN DE LICENCIATURA EN QUÍMICA ESTUDIO COMPARATIVO DE LA ACTIVIDAD DE CITEÍN PROTEASA EN AISLADOS DE VENEZOLANOS DE Trypanosoma vivax. Por: María Abelarda de la Concepción Díaz Araque Realizado con la asesoría de: Dra. Mary Isabel Gonzatti PROYECTO DE GRADO Presentado ante la Ilustre Universidad Simón Bolívar como requisito parcial para optar al título de Licenciada en Química Sartenejas, Enero de 2010 i

Acta de evaluación ii

ESTUDIO COMPARATIVO DE LA ACTIVIDAD DE CITEÍN PROTEASA EN AISLADOS DE VENEZOLANOS DE Trypanosoma vivax. Por: María Abelarda de la Concepción Díaz Araque RESUMEN El Trypanosoma vivax es el agente causal de la tripanosomiasis, enfermedad conocida como secadera en Venezuela, la cual afecta a la ganadería bovina, ovina y caprina, produciendo anemia, pérdida de peso, abortos, reducción de la leche y eventualmente, la muerte. Las cisteín proteasas de tripanosomas son enzimas claves para su supervivencia. En el presente trabajo se compararon los perfiles proteicos y la actividad de la cisteín proteasa de dos aislados venezolanos de T. vivax de diferente grado de virulencia, TvAA1 y TvLiem76. Se realizaron cuatro infecciones experimentales de ovinos con los aislados TvLiem76 y TvAA1, obteniendo máximos de parasitemia de 3,02 x 10 7 y 1,92 x 10 7 parásitos/ml a los 9 y 6 días, respectivamente. Usando el método de PCR con los cebadores ITS, se detectó la presencia de tripanosomas en el torrente sanguíneo de los ovinos en la etapa prepatente de la infección. Los perfiles proteicos de los extractos de TvAA1 y TvLiem76, purificados mediante gradiente de Percoll o cromatografía de intercambio iónico, no mostraron diferencias significativas en electroforesis en geles de poliacrilamida con SDS. En ensayos de zimografía, la cisteín proteasa de TvLiem76 se evidenció como un polipéptido de 49 KDa. En zimogramas y en ensayos fluorimétricos, esta peptidasa mostró mayor actividad que la de TvAA1, lo cual concuerda con la estimación de los parámetros cinéticos con el dipéptido Phe-Arg-AMC. Los valores de Vmax de ambas peptidasas fueron similares: 0,012 0,002 nmoles/min (TvAA1) y 0,01 0,01nmoles/min (TvLiem76), mientras que los valores de Km mostraron una diferencia de 5x, 6,0 0,04 M (TvLiem76) y 31,1 0,03 M (TvAA1). iv

Dedicatoria: A la Virgen del Valle. v

AGRADECIMIENTOS. A Dios y a la Virgen del Valle por darme la sabiduría para tomar las mejores decisiones e indicarme el mejor camino que podía tomar. A mi papá y a mi mamá por ser tan comprensivos y apoyarme en todo. Ustedes me enseñaron a ser en quien me he convertido y me dieron los valores con los que rijo mi vida. Los mejores padres que se puede tener y los amo. Gracias. A loqui por graduarse conmigo. Esta tesis también es tuya enano. A mi hermana, por no dejar que me vea fea. Por escucharme aun cuando no entendías lo que te decía, por brindarme tu ayuda y compañía. También por no dejar que me quejara si podía hacer algo al respecto. Gracias Marian. Te quiero mucho. A Luis Alejandro, quien me ha acompañado y apoyado con todo lo que me he propuesto hacer, y en especial en este trabajo. Amor, gracias por ser tan comprensivo y por alegrarme los días. A Marisa por tenerme tanta paciencia, por enseñarme lecciones muy valiosas para mi vida y mi carrera que apenas está comenzando. Por brindarme un buen consejo cuando más los necesitaba. Gracias por haberme ofrecido la oportunidad de aprender bioquímica. Eres la mejor tutora. A la gente que forma parte del laboratorio: Prof. Pedro, Prof. Henry, Vane, Maru, Gladinex, Gianni, Adolfo y Erika. Gracias por enseñarme cosas nuevas, por la paciencia y por permitirme formar parte del grupo. A Francia y a Bernardo, por estar ahí cada vez que los llamaba. Sin ustedes creo que no estaría cuerda. Gracias a los dos por la GRAN colaboración que me dieron para que este trabajo fuese posible. A Loly por toda la ayuda que me brindaste y todo lo que me enseñaste, estaré siempre agradecida contigo. A Prof. Armando Reynas y a Lucy por toda su colaboración y apoyo en las infecciones y purificaciones. Gracias también al Prof. Reynas y a Eli Gómez por habernos dado el aislado apure para poder hacer este trabajo. También gracias Iralis por haberme ayudado en la purificación en el IDECYT. vi

Al equipo del bioterio, por haberme brindado todo el apoyo necesario en las infecciones y no dejar que ninguno de los ovejitos se muriera ni sufriera. A Jorgito, Alexis: De verdad no saben lo mucho que les agradezco todo lo que hicieron por mi este año de trabajo. Ustedes son los mejores. Los quiero mucho mucho. A todos los que me ayudaron y me brindaron su compañía durante este trabajo, a los que formaron parte de mi vida durante mi carrera. A todos, MUCHAS GRACIAS vii

ÍNDICE GENERAL INTRODUCCIÓN... 1 Objetivo General... 3 Objetivos Específicos.... 4 MARCO TEORICO... 5 Trypanosoma vivax y la Tripanosomiasis Animal.... 5 PCR.... 7 Cisteín proteasas.... 9 Cinética de la catálisis enzimática.... 11 MARCO METODOLOGICO... 14 Material Biológico.... 14 Inmunosupresión de los ovinos.... 14 Contaje de parásitos por el método de Brener [23] (modificado)... 15 Extracción de ADN genómico de alto peso molecular a partir de sangre total.... 16 Determinación de la presencia de Trypanosoma vivax usando el método de PCR con cebadores ITS [13]... 16 Purificación de Trypanosoma vivax.... 17 Por Cromatografía de Intercambio Iónico... 17 Por gradiente de Percoll... 18 Obtención de las proteínas.... 19 Determinación de la concentración de proteínas.... 19 Comparación del perfil proteico: Electroforesis en SDS-PAGE.... 20 Determinación de actividad peptidasa mediante zimogramas copolimerizados con gelatina... 21 Determinación de actividad peptidasa mediante fluorimetría [31]... 22 RESULTADOS Y DISCUSIÓN.... 24 Infección experimental de ovinos con Trypanosoma vivax.... 24 Extracción de ADN genómico de alto peso molecular a partir de sangre total.... 27 viii

Determinación de la presencia de Trypanosoma vivax usando el método de PCR con cebadores ITS:... 28 Purificación de Trypanosoma vivax.... 30 Por cromatografía de intercambio iónico:... 30 Determinación de la concentración de proteínas.... 32 Comparación del perfil proteico: Electroforesis en SDS-PAGE.... 34 Determinación de actividad peptidasa mediante zimogramas copolimerizados con gelatina:.. 37 Determinación de actividad peptidasa mediante fluorimetría.... 41 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES... 50 BIBLIOGRAFÍA... 52 ix

ÍNDICE DE TABLAS Tabla 1. Parasitemia e índice de hematocrito de cada aislado inoculado en ovejos... 3 Tabla 2.1. Cebadores utilizados para la determinación de la presencia de T. vivax por el método de PCR... 17 Tabla 3.1. Datos de la infección experimental con el aislado TvLiem76 de tres ovinos juveniles.... 24 Tabla 3.2. Datos de la infección experimental con el aislado TvAA1 de un ovino juvenil macho.... 25 Tabla 3.3. Condiciones de las muestras de sangre obtenidas y purificadas por cromatografía de intercambio iónico.... 30 Tabla 3.4. Condiciones de las muestras de sangre obtenida y purificadas por gradiente de Percoll.... 31 Tabla 3.5. Concentración de proteínas totales de los extractos crudos de T. evansi.... 32 Tabla 3.6. Concentración de proteínas totales de los extractos crudos de T. vivax.... 34 Tabla 3.7. Pesos moleculares de las bandas en los extractos crudos de TvLiem y TvAA1. 36 Tabla 3.8. Micromoles de AMC liberados en el tiempo en la fluorimetría con extracto crudo del aislado TeAp-El Frio.... 42 Tabla 3.9. Fluorescencia medida en U.R.F y convertida a micromoles de AMC liberado, para tres concentraciones de ZFR-AMC para el aislado TvLiem76... 44 Tabla 3.10. Fluorescencia medida en U.R.F y convertida a micromoles de AMC liberado, para tres concentraciones de ZFR-AMC para el aislado TvAA1...46 x

ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1. Secuencia aminoacídicas de la Vivaxpaína proveniente de un clon de TvLiem76 2 Figura 1.1. Esquema de la morfología típica de un tripanosoma.... 5 Figura 1.2. Esquema de la reacción de PCR... 8 Figura 1.3. Mecanismo de reacción de la hidrólisis de un enlace péptido por parte de una cisteín proteasa.... 9 Figura 1.4. Esquema del modelo de Berger y Schechter.... 11 Figura 1.5. Ecuación de catálisis enzimática.... 12 Figura 1.6. Representación de Lineweaver-Burk para la determinación de Km y Vmax.... 13 Figura 2.1. Gradiente de Percoll formado.... 18 Figura 2.2. Esquema de reacción de iodoacetamida como inhibidor irreversible de las cisteín proteasas.... 22 Figura 3.1. Variación de la temperatura de cada ovino durante el tiempo de la infección.. 26 Figura 3.2. Variación del hematocrito (%) de cada ovino durante el tiempo de la infección.26 Figura 3.3. Gel de Agarosa 0,8% que muestra la integridad de los ADNs extraídos de la sangre infectada experimentalmente de ovinos con T. vivax... 27 Figura 3.4. Gel de agarosa 2% con los productos de PCR obtenidos usando cebadores ITS. Se usó un marcador de peso molecular de 100pb (DNA ladder, Promega).... 29 Figura 3.5. Curva de calibración con BSA para la determinación de la concentración de proteínas de TeAp-El Frio por el método de Lowry... 32 Figura 3.6. Curva de calibración con BSA para la determinación de la concentración de proteínas de T.vivax por el método de Lowry... 33 Figura 3.7. Perfil proteico de los extractos crudos de T. evansi y T. vivax.... 35 Figura 3.8. Relación entre el peso molecular del estandar vs. La movilidad relativa.... 36 Figura 3.9. Zimograma copolimerizado con gelatina 1% m/v de T. evansi y T. vivax.... 38 Figura 3.10. Zimograma copolimerizado con gelatina 1% m/v de T. evansi y T. vivax aislado TvLiem76.... 40 Figura 3.11. Curva de calibración del ensayo fluorimétrico usando AMC.... 42 xi

Figura 3.12. Actividad peptidasa en el ensayo fluorimétrico mostrada por el extracto crudo de TeAp-El Frio... 43 Figura 3.13. Obtención de las velocidades iniciales para la cisteín proteasa del aislado TvLiem76... 45 Figura 3.14. Representación gráfica de Lineweaver-Burk para la determinación de Vmax y Km la cisteín proteasa de TvLiem76.... 46 Figura 3.15. Obtención de las velocidades iniciales para la cisteín proteasa del aislado TvAA1.... 47 Figura 3.16. Representación grafica de Lineweaver-Burk para la determinación de Vmax y Km de la cisteín proteasa de TvAA1 48 xii

LISTA DE SIMBOLOS [E] [ES] [S] Concentración de enzima Concentración del complejo enzima-sustrato Concentración de sustrato g Unidad de masa (10-6 g) M (10-6 M). C1 CA Fm H Km sustrato Unidad de concentración química. Cantidad de moles que hay en 1L de solución Familia del clan CA de las cistín proteasas tipo catepsina B y L Clan de las cisteín proteasas tipo papaína Factor del microscopio Unidad de tiempo (Hora) Parámetro de la cinetica enzimatica que indica afinidad de una protease por un ml Unidad de volume (10-3 L) nmoles/min Oc Unidad de velocidad enzimática. Organismos contados Pn Según la notación de Berger- Schetcher, es un conjunto de aminoácidos que son reconocidos por el bolsillo Sn de la enzima Pn Según la notación de Berger- Schetcher, es un conjunto de aminoácidos que son reconocidos por el bolsillo Sn de la enzima Sn Según la notación de Berger- Schetcher, es el primer bolsillo catalítico de la enzima contado hacia C-termial. Sn Según la notación de Berger- Schetcher, es el primer bolsillo catalítico de la enzima contado hacia N-termial. xiii

trip/ml Vmax nmoles/min V o Unidad de parasitemia. Es la cantidad de tripanosomas por ml Es la velocidad maxima que alcanza una reacción enzimática. Tiene unidades de Velocidad inicial de la enzima en una reacción catalítica. xiv

LISTA DE ABREVIATURAS aa AMC BSA DEAE-celulosa pb aminoacido Aminometilcumarina (7-amino-4-metil cumarina). Albumina de suero bovino ( bovine serum albumin ). Dietilaminoetil celulosa. pares de base SDS-PAGE Electroforesis en gel de poliacrilalmida con dodecilsulfato de sodio ( sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis ). TeAp-El Frio Frio en Venezuela. TvAA1 TvLiem76 Venezuela. U.R.F aislado de Trypanosoma evansi proveniente del estado Apure, del hato El aislado de Trypanosoma vivax proveniente del estado Apure en Venezuela. aislado de Trypanosoma vivax proveniente del estado Trujillo en Unidades relativas de fluorescencia. xv

INTRODUCCIÓN Existe gran cantidad de parásitos que afectan a la ganadería en nuestro país, entre los que se encuentran los Tripanosomas, hemoparásitos que se desarrollan en la sangre de los hospedadores, produciendo así la tripanosomiasis [1]. Entre los tripanosomas que afectan a la ganadería en nuestro país se encuentran el T. vivax, que afecta a ovinos y a bovinos, Trypanosoma evansi que afecta a equinos, bovinos y a cabras, y el Trypanosoma equiperdum que afecta a equinos. El Trypanosoma vivax (T. vivax) será el objeto de estudio en esta investigación. Ensayos realizados en el Laboratorio de Bioquímica e Inmunología de Hemoparásitos han demostrado la presencia de actividad cisteín peptidasa de los extractos de parásitos T. vivax (Liem76). El gen que codifica a la Vivaxpaína ha sido clonado y su secuencia aminoacídicas (figura 2.) ha sido deducida de su secuencia nucleotídica y su peso molecular y punto isoeléctrico calculados usando los programas TRANSLATE TOOL (http://www.expasy.ch/cgibin/dna_aa) y Compute pi/mw tool (http://www.expasy.ch/cgi-bin/pi_tool). Los valores para el peso molecular van de 46,5-49,2 KDa y el punto isoeléctrico va de 5,25 6,27 (M. Gonzatti, comunicación personal; B. González, comunicación personal).

2 10 20 30 40 50 60 METHAHALVT LLAAAVSVAP AAMETAVLRA DGPVEPLFAA FKQKYGRSYG TAAEEAFRLR 70 80 90 100 110 120 VFEDNMETRR SRMETYAAAN PHATFGVTPF SDLTPEEFRT RYHNGERHFE AARGRVRTLV 130 140 150 160 170 180 QVPPGKAPAA VDWRRKGAVT PVKDQGTCGS CWSFSAIGNI EGQWAAAGNP LTSLSEQMET 190 200 210 220 230 240 LVSCDFKDNG CGGGFMETDN AFEWIVKENS GKVYTEKSYP YVSEDGSKPF CIPYGHEVGA 250 260 270 280 290 300 TITGHVDIPH DEDAIAKYLA DNGPVAVAVD ATTFMETSYS GGVVTSCTSE ALNHGVLLVG 310 320 330 340 350 360 YNDSSKPPYW IIKNSWSSSW GEKGYIRIEK GTNQCLVAQL ASSAVVGGPG PTPTPTPTPT 370 380 390 400 410 420 TTTTTTAPGP SSSFTKTLCS GDDCADNCSV TLYRTNMETC IRLGALGSME TVATCGAGVL 430 440 450 460 ELKAYMETQN EQCTGTPERL SLPLDKCLAS LSVSATYHCN Figura 1. Secuencia aminoacídica de la Vivaxpaína proveniente de un clon de TvLiem76 (M. Gonzatti, comunicación personal) Adicionalmente, Gómez y cols. (comunicación personal) han obtenido varios aislados de T. vivax, en las regiones de Guárico (TvGP1 y TvZ), Apure (TvAA1), Monagas (TvMT1), y Trujillo (TvLiem76). Se realizaron infecciones experimentales con ovinos y se han medido parámetros tales como la parasitemia y el hematocrito de los animales infectados. El bajo índice de hematocrito es indicativo de anemia en el animal (Brener, 1962; Klemba & Golberg, 2002). De aquí se obtuvo que cuatro de los aislados produjeran en los animales altas parasitemias e índices de hematocritos bajos; sólo el aislado de TvGP1 presentó una menor parasitemia en el ovejo y menor caída de hematocrito. Los aislados que mayor parasitemia y mayor caída del índice de hematocrito produjeron fueron TvLiem76 y TvMT1.

3 Tabla 1. Parasitemia e índice de hematocrito de cada aislado inoculado en ovejos Parasitemia: TvLiem76 > TvAA1 > TvMT1 > TvGZ1 > TvGP1 Índice de Hematocrito TvAA1 < TvMT1 < TvLiem76 < TvGZ1 < TvGP1 Lo antes expuesto produce la interrogante de por qué los distintos aislados del mismo parásito producen diferentes niveles de parasitemia y caídas de hematocrito. En este proyecto se plantea analizar los niveles de actividad cisteín proteasa en dos de los distintos aislados venezolanos de T. vivax como una aproximación a la posible relación entre esta enzima y la virulencia o patogenicidad del parásito. La investigación de la cisteín proteasa de T. vivax permitirá proponer a mediano-largo plazo, posibles mecanismos de control de la parasitosis y enfermedad causada por este parásito. Esto es importante por las limitaciones en la producción de carne y leche que producen las infecciones con tripanosomas a nivel mundial. Además, los animales infectados con tripanosomas tienen mayores tasas de abortos y problemas de fertilidad, lo cual disminuye la productividad de proteínas de origen animal [2]. Objetivo General. Caracterizar dos aislados geográficos diferentes de Trypanosoma vivax en relación a su capacidad de infección de ovinos, perfil proteico y actividad proteolítica.

4 Objetivos Específicos. Expandir y purificar dos aislados geográficos de Trypanosoma vivax a partir de ovinos infectados experimentalmente. Determinar la presencia de Trypanosoma vivax en la etapa temprana de la infección experimental por el método de PCR usando cebadores ITS. Determinar el perfil proteico de los diferentes aislados de T. vivax. Determinar la actividad proteasa de los aislados de T. vivax. mediante zimogramas copolimerizados con gelatina. Determinar la actividad proteasa mediante ensayos fluorométricos usando el sustrato Phe- Arg-aminometilcumarina.

CAPITULO 1. MARCO TEORICO Trypanosoma vivax y la Tripanosomiasis Animal. El T. vivax es un kinetoplastida de la familia de los Trypanosomatidae y del subgénero Dutonella [3]. Los kinetoplastidas se caracterizan por poseer en su estructura morfología un kinetoplasto. El kinetoplasto es una estructura especializada que forma parte del aparato mitocondrial; aquí se puede encontrar ADN circular (ADNk) en altas concentraciones [4]. El kinetoplasto, en el Trypanosoma vivax (T. vivax) se caracteriza por ser largo y estar situado en la parte redonda posterior [5]. En la figura 1.1 vemos un esquema de la morfología típica de un tripanosoma. Figura 1.1. Esquema de la morfología típica de un tripanosoma. (Tomado y modificado de http://herenciageneticayenfermedad.blogspot.com/2009/07/el-tripanosoma-rompesu-adn-como.html)

6 La tripanosomiasis causada por T. vivax se denomina en Venezuela secadera, huequera o caucho seco [6]. Afecta al ganado vacuno principalmente, pero también infecta ganado caprino y ovino. Se caracteriza por producir un cuadro de anemia, pérdida de peso, el pelo del animal se pone muy áspero, abortos, reducción de la leche y eventualmente, la muerte. De pasar a una etapa más crónica, se puede producir anemia, caquexia (estado de desnutrición, atrofia muscular, fatiga y debilidad) baja productividad e infertilidad y por lo general termina en muerte [2]. El T. vivax es primordialmente un parasito vascular, sin embargo se ha encontrado en locaciones extravasculares como en el humor acuoso del ojo [7]. En las etapas tempranas de la infección los animales infectados desarrollan altas parasitemias. El momento en que la parasitemia es mayor en la sangre del hospedador (pico de parasitemia) esta caracterizado por presentar un cuadro de fiebre muy alta y un índice de hematocrito bajo (que indica anemia). Luego de que pasa el pico la temperatura tiende a fluctuar pero la anemia persiste. En esta etapa la enfermedad es aguda; sin embargo si el animal no muere en esta etapa, puede pasar a una tripanosomiasis crónica (después de 6-8 semanas) [7]. La transmisión de los T. vivax en Sur América ocurre de manera mecánica, no cíclica. Esto se debe a que el tripanosoma es generalmente monomórfico, aunque se han observado formas esbeltas y rechonchas en algunas etapas de las infecciones [5]. Algunas moscas picadoras, como Tabanus, Haematopota y Chrysops, pueden transmitir sangre que contenga tripomastigotes a mamíferos. Los tripomastigotes son la forma infectiva de los tripanosomas. Esto ha permitido que estos parásitos se propaguen en África, Asia y América Latina. Ha sido reportado la dispersión de la tripanosomiasis a lo largo de la costa atlántica, en Venezuela, Colombia, Panamá, Surinam y en dos islas de las Antillas: Martinica y Guadalupe. El T. vivax se ha encontrado además en El Salvador, Costa Rica, Colombia, Ecuador, Perú, Brasil y Paraguay [2]. Para el diagnóstico de la tripanosomiasis existen distintos métodos. Se utiliza el examen de una monocapa homogénea entre láminas porta y cubre objetos en el microscopio. Sin embargo, este método no es suficientemente sensible cuando se tiene una infección en etapa crónica, en donde se tienen bajos niveles de parasitemia [8]. La técnica descrita por Woo [9] es notablemente más sensible. Consiste en la centrifugación de la sangre utilizando una microcentrifuga para determinar hematocrito, concentrando los parásitos presentes en la interfaz plasma-glóbulos blancos seguida de observación bajo microscopio. Ambas técnicas antes

7 descritas tienen la desventaja de estar limitadas por la capacidad del examinador de distinguir los tripanosomas [10]. Los ensayos inmunológicos como los ELISAs también han sido usados, pero son de baja especificidad. Para el caso de la detección de T. vivax, la producción de antígeno constituye un contratiempo, pues no es un proceso económico ni sencillo. Los ensayos de PCR se han venido desarrollando como una herramienta útil para el diagnóstico de la tripanosomiasis y han probado ser muy efectivos [11]. PCR. PCR es la abreviatura en ingles para reacción en cadena de la polimerasa ( Polymerase chain reaction ). Esta técnica permite la amplificación in vitro de un fragmento pequeño de ADN sin tener que transferir a una célula viva previamente [12]. El método incluye varios pasos: a) Paso de iniciación, en donde el ADN se desnaturaliza mediante calor. b) Paso de hibridación, en donde las cadenas nucleotídicas se alinean con los cebadores que deben encontrarse en exceso en el medio de reacción. c) Paso de extensión, en donde la polimerasa comienza a extender la cadena partiendo del extremo 5. Para poder realizar una PCR se debe tener conocimiento de la composición nucleotídica de los fragmentos que rodean la región que se quiere amplificar. Esto es necesario porque de esta manera se pueden diseñar los cebadores apropiados para la reacción. Además, se usa polimerasa que proviene de bacterias que viven en ambientes de temperaturas altas, lo que hace que sea resistente al calor (Taq polimerasa) [12]. En la figura 1.2 se muestra un esquema de la PCR.

8 Figura 1.2. Esquema de la reacción de PCR. (Tomada y modificada de http://www.bio.miami.edu/~cmallery/150/gene/taq.htm) La PCR como herramienta de diagnóstico de la tripanosomiasis ha despertado un creciente interés desde que se encontró que existen regiones únicas y altamente repetitivas dentro del ADN genómico de estos parásitos. Son estas regiones un buen blanco para las PCRs. Este método es muy sensible y se puede utilizar en etapas tempranas de la infección [8]. En el 2005, Njiru y cols. [13], reportaron el uso de unos cebadores diseñados para la región ITS que sirve para la identificación de varios tipos de tripanosomas en una sola amplificación. Se denomina ITS a al espaciador intergénico transcrito (intergenic transcribed spacer) y se encuentra en el ADN ribosomal. La región ITS es altamente conservada entre las diversas especies de

9 tripanosomas. Además, para cada especie, esta región tiene una longitud determinada lo que hace posible identificar una especie particular lo que la hace un buen blanco para identificación de tripanosomas por PCR. Para el T. vivax, la longitud de esta región es de 250pb. Cisteín proteasas. Las proteasas son enzimas con estructura proteica que tienen la capacidad de romper enlaces peptídicos en las proteínas. Tienen un sitio catalítico ubicado en un bolsillo entre dominios, y su especificidad de sustrato viene dictada por las propiedades de enlace que estén presentes en los aminoácidos ubicados en dicho bolsillo [14]. Estas macromoléculas se clasifican en clanes, los cuales incluyen conjuntos de familias de peptidasas que evolucionaron de una macromolécula proteica de origen común. Las familias presentan alta homología en sus secuencias aminoacídicas; esto según el sistema MEROPS de clasificación de peptidasas. Según esta nomenclatura existen 6 tipos de familias de proteasas de acuerdo al sitio catalítico que posean: serín proteasas, cisteín proteasas, aspartíl proteasas, treonín proteasas, proteasas glutámicas y metaloproteasas [15]. El mecanismo de reacción de hidrólisis de un enlace peptídico por las cisteín proteasas (figura 1.3.) consiste en la formación del complejo enzima-sustrato, la formación de producto y regeneración de la enzima en presencia de agua. Figura 1.3. Mecanismo de reacción de la hidrólisis de un enlace péptido por parte de una cisteín proteasa.

10 Las proteasas tipo papaína son pertenecientes al clan CA de las cisteín proteasas. La papaína es una cisteín proteasa proveniente de la Carica papaya y fue la primera de este tipo en ser caracterizada. El clan CA, a su vez, se divide en familias, entre las que se encuentra la C1 que son proteasas tipo catepsina B y catepsina L [14], [15]. Las cisteín proteasas provenientes de Trypanosoma brucei pueden ser divididas en cuatro dominios, según Mottram y cols. [16], los cuales son, comenzando por el extremo N- terminal: una región pre-catalítica hidrofóbica de 20 aminoácidos (aa), una región pro-catalítica de 105 aa, una región catalítica de 217 aa en la catepsina L de mamífero, [15] y una región C- terminal. Esta última comienza con 9 prolinas, que se les denomina región bisagra; además tiene 8 cisteínas en su estructura que la diferencian de las demás cisteín proteasas reportadas. En 1991, Eakins y cols. [17], secuenciaron cisteín proteasa provenientes del Trypanosoma cruzi (cruzaina). Encontraron que la cruzaína tiene un 59,3% de parecido con la proveniente de la T. brucei. Parte de las diferencias se encontraron en la región C-terminal, donde no se ven 9 prolinas seguidas sino 6 treoninas seguidas en la misma sección de la región. Sin embargo, las 8 cisteínas conservan su lugar en las secuencias de las cisteín proteasas de ambos parásito. McKerrow [18], enumera algunas funciones que cumplen las cisteín proteasas: Facilita la invasión, cumple funciones de digestión y ayuda a evadir al sistema inmune del hospedador. De la familia de las cisteín proteasas, la Vivaxpaína es la principal actividad tipo catepsina L en el parásito T. vivax y su nombre deriva de la homología con la familia de la papaína (M. Gonzatti, com. Personal). En el 2009, Cortez y cols. [11], describieron genes de T. vivax que codifican catepsina L. Para esto usaron diferentes aislados provenientes de Sur America y de Africa. Encontraron que los genes daban secuencias divergentes y convergentes dentro de la especie de tripanosoma, lo que revela polimorfismo.

11 Cinética de la catálisis enzimática. En general, las enzimas aumentan las velocidad de una reacción determinada; en su ausencia las reacciones bioquímicas se llevan a cabo a velocidades despreciables [19]. El estudio de las velocidades de las reacciones químicas se denomina cinética; si las reacciones son enzimáticas, el estudio se denomina cinética enzimática. Las enzimas actúan sobre moléculas denominadas sustratos, los cuales se enlazan al sitio activo de la enzima formando el complejo enzima-sustrato. Según la nomenclatura de Berger y Schechter [20] para las proteasas, se enumeran los sitios catalíticos como S1, S2, Sn hacia el extremo N-terminal de la enzima; mientras que S1, S2, Sn hacia el extremo C- terminal. Como se ve en la figura 1.4, cada S de la enzima reconoce su P correspondiente en el sustrato, de modo que la enzima reconoce el enlace que va a hidrolizar en el sustrato (entre P1 y P1 ). Figura 1.4. Esquema del modelo de Berger y Schechter. (figura 1.5) El intermediario enzima-sustrato da paso a producto y a la regeneración de la enzima

12 Figura 1.5. Ecuación de catálisis enzimática. E=enzima, S=sustrato, ES=complejo enzimasustrato, P=producto Existen dos parámetros cinéticos que sirven para caracterizar una reacción enzimática: La constante de Michaelis (Km) y la velocidad máxima de reacción (Vmax). La Km es una relación de constantes de velocidad, que son características para cada reacción; esto hace que Km también sea característica de la reacción. Un motivo para calcular Km es que establece un valor aproximado de los niveles intracelulares de sustrato. Sin embargo, en un experimento in vitro establece la afinidad de la enzima por un sustrato: a menor Km mayor afinidad. Como Km es constante para una enzima dada, sirve de punto de comparación entre enzimas diferentes para una misma reacción [21]. Km viene dada por la ecuación: (1.1) cuando la concentración de la enzima ([E]) es mucho menos que la concentración de sustrato ([S]). Esto hace que la concentración del intermediario ([ES]) sea mucho más pequeña que la de sustrato. Km tiene unidades de concentración (Levine, 2004). Vmax es el número de moléculas de sustrato convertidas en producto por unidad de tiempo, cuando el sistema está saturado. Es la velocidad máxima que puede alcanzar la reacción. La ecuación de Vmax es: (1.2) donde [E] t es la concentración total de la enzima, es decir, la enzima libre más la enzima en el complejo [12], [22].

13 El método de Lineweaver-Burk, es uno de los tantos métodos que existen para calcular Km y Vmax. Consiste en obtener la grafica 1/V 0 vs.1/[s], donde V 0 es la velocidad de reacción. Al realizar una regresión lineal se pueden obtener todos los datos de la recta (figura 1.6). Figura 1.6. Representación de Lineweaver-Burk para la determinación de Km y Vmax. El intercepto con el eje de las ordenadas es el inverso negativo de Km, el intercepto con el eje de las abscisas es el inverso de Vmax; por lo tanto la pendiente de la recta es el cociente de Km entre Vmax. La ecuación de la recta queda: (1.3) La k cat es otro parámetro cinético que sirve para caracterizar una reacción enzimática. Esta es una contante de velocidad de reacción que mide directamente la producción catalítica de un producto en condiciones de saturación de la enzima. Está definida como [12] : (1.4) [E] t es la concentración de enzima total. k cat tiene unidades de 1/s.

CAPITULO 2. MARCO METODOLOGICO Material Biológico. Criopreservados de sangre de ovino infectada con T. vivax del estado Trujillo (Venezuela) con una parasitemia de 1,172 x 10 7 parásitos por mililitro. A este criopreservado se le denominó el aislado TvLiem76. Criopreservados de sangre de ovino infectada con T. vivax del estado Apure (Venezuela) con una parasitemia no determinada. A este criopreservado se le denominó el aislado TvAA1. Sedimento purificado del 27/4/2005 de Trypanosoma evansi (T. evansi), proveniente de un aislado del estado Apure (Venezuela), Hato El Frio (TeAp-El Frio). Contenía 1,75 x 10 9 parásitos. Ovinos (Ovis aries) juveniles sin restricción de peso o sexo. Inmunosupresión de los ovinos. Se comenzó la inmunosupresión 2 días antes de la inoculación, inyectando 2mg por kilogramo de peso de Dexametasona 4mg/mL (Cipdex, cipla). El día de la inoculación y dos días después de la inoculación también se inmunosuprimió. Con esto se expandió el parasito en uno de los ovinos para inocular a otro con sangre fresca.

15 Para la inoculación con sangre fresca en el otro ovino, se esperó el pico de parasitemia (10 x 10 6 trip/ml) y luego se usaron 10mL de sangre fresca, inyectada vía intravenosa. Infección experimental de ovinos con Trypanosoma vivax. El protocolo que se siguió fue desarrollado en el Laboratorio de Bioquímica e Inmunología de Hemoparásitos (USB). Se tomó uno de los aislados que se quiere expandir (TvAA1, donado por el Dr. A. Reyna (IDECYT- Universidad Experimental Simón Rodriguez) y TvLiem76, Banco de Hemoparásitos USB) y se procedió a inocular a un ovino (Ovis aries) vía intravenosa. Se siguió el curso de la infección y aparición de la enfermedad en forma interdiaria durante el periodo de prepatencia y diariamente cuando los parásitos se hicieron visibles en sangre. Para esto se colocó una gota de sangre total (recogida en EDTA) del ovino (obtenida de la yugular con una inyectadora estéril) entre un porta y cubre objetos y se observó bajo el microscopio de luz. Cuando la parasitemia alcanzó valores de 10 6 10 7 tripanosomas por ml (determinado por el método de Brener, 1962), se sacaron 100mL de sangre en presencia de anticoagulante (0,15% de heparina). Este procedimiento se usó para los dos aislado, y utilizando un ovino diferente para cada uno. Se les administró tripamidium a los animales infectados para curarlos una vez que se obtuvo la sangre para purificación y terminar así la infección experimental. Contaje de parásitos por el método de Brener [23] (modificado). Se colocó 10 l de sangre sobre una lámina portaobjeto, a la cual se le colocó una lámina cubre objeto de 22mm x 22 mm, se contó en el microscopio (Dialux, Leitz-Wetzlar)con un ocular de 10X y un objetivo de 40X, el número de células en diez campos y se aplicó la siguiente fórmula: (2.1)

16 donde; Oc es organismos contados, Fm es el factor óptico del microscopio (Fm=5033,147, Leitz Wetzlar) y 200 es un factor de proporcionalidad. Extracción de ADN genómico de alto peso molecular a partir de sangre total. congelada. Se usó el método publicado por Bowen y Keeney [24] de extracción rápida para sangre Primero se descongelo la sangre una hora antes del procedimiento. Una vez descongelada, se tomó 700 L de la sangre y se le agregó 700 L de la solución tampón de lisis celular (Tris-HCl 10mM ph 8, Sacarosa 11% m/v, MgCl 2 5mM, Triton X-100 1% v /v) y se mezclaron en el vórtex durante 5 segundos. Se dejó incubar por 5 minutos a temperatura ambiente. Se centrifugó la mezcla por 5 minutos a 12000rpm a temperatura ambiente y se descartó el sobrenadante. Al sedimento se le agregó 500 L de solución tampón de lisis celular, repitiendo así el procedimiento descrito arriba. Luego de centrifugar por segunda vez y obtener el sedimento, éste fue resuspendido en 500 L de solución tampón de lisis nuclear (Tris-HCl 10mM ph8, EDTA 10mM, Citrato de sodio 10mM, SDS 1% m/v). Seguidamente se le agregó 100 L de NaCl 5,3M y 500 L de Cloroformo previamente enfriado a 4 C; se mezcló por inversión y se centrifugó bajo las mismas condiciones anteriores. Se tomó el sobrenadante y los ácidos nucleídos se precipitaron con 650 L de etanol absoluto frío. Se centrifugó nuevamente en las mismas condiciones y descartó el sobrenadante, dejándose secar así el sedimento. Por último, el sedimento se hidrató con 25 L de agua estéril y se guardó a 4 C hasta su uso. m/v. Se verificó la integridad del ADN obtenido realizando una electroforesis de agarosa 0,8% Determinación de la presencia de Trypanosoma vivax usando el método de PCR con cebadores ITS [13]. Para determinar la presencia de T. vivax en sangre en las muestras con bajos niveles de parasitemia, se usó el método de PCR (reacción en cadena de la polimerasa) usando cebadores ITS. Las secuencias aminoacídicas de los cebadores aparecen en la tabla 2.1.

17 Tabla 2.1. Cebadores utilizados para la determinación de la presencia de T. vivax por el método de PCR. Cebadores Secuencia Referencia ITS1 CF 5'CCGGAAGTTCACCGATATTG Njiru y cols., 2005 ITS1 BR 5'TTGCTGCGTTCTTCAACGAA Las PCR se realizaron en un termociclador XPcycler de la marca Biuers bajo las siguientes condiciones: Un paso inicial de desnaturalización a 94 C por 5 minutos, 35 ciclos de 94 C por 40 segundos, 58 C por 40 segundos, 72 C por 90 minutos y finalmente un paso de extensión a 72 C por 5 min. Purificación de Trypanosoma vivax. Por Cromatografía de Intercambio Iónico Se usó el método de Lanham y Godfrey [25] modificado por Loly Rojas, (comunicación personal). Se empleó como columna una jeringa de 60ml, en la cual se colocaron 30ml de DEAE- Celulosa, equilibrada con una solución tampón denominada Krebs, ph 7,2 con 1% de Glucosa. Primero se procesó la muestra de sangre para separar el plasma sanguíneo (sobrenadante) mediante centrifugación a 2500rpm por 10 minutos a 10 C (Centrifuga Eppendorf 5810R 15amp version). El sedimento se lavó bajo las mismas condiciones colocando tampón Krebs. Luego se tomó con una pipeta Pasteur la capa blanca sobre los eritrocitos, que contenía las células sanguíneas blancas y los tripanosomas T. vivax, se resuspendió en aproximadamente 4,5ml de

18 tampón Krebs y se cargó en la columna. Se eluyó la muestra con tampón Krebs, colectando las fracciones en tubos de 15ml (Falcon). Las fracciones en las cuales se observan parásitos al microscopio se centrifugaron a 3000rpm por 10min a temperatura ambiente. Al descartar el sobrenadante, se unieron los sedimentos, utilizando 1ml de solución Krebs. Se determinó el número de parásitos bajo el método de Brenner y se centrifugó a 12500 rpm por 5 minuntos a temperatura ambiente (Centrífuga 5415D, Eppendorf). Se descartaró el sobrenadante y se congeló el sedimento a -80 C hasta su posterior uso. Por gradiente de Percoll Se empleó el método publicado por González y cols. [26]. Se tomó 100mL de sangre infectada y se mezcló con un volumen igual de una solución de Percoll (Sigma, St. Louis, USA) ph 7,4 (Sucrosa 8,55% m/v, Glucosa 2% m/v en Percoll y se ajustó ph con Hepes sólido). La mezcla se centrifugó a 25000xg por 25 minutos a 15 C (Sorvall Ultra Pro 80). Los parásitos se recuperaron cuidadosamente de las capas superior y media del gradiente formado, dejando la inferior en donde se encuentran todos los glóbulos rojos como se ve en la figura 2.1. A B Figura 2.1. Gradiente de Percoll formado. A) Muestra la identificación de las capas. B) Muestra la capa donde se encuentran la mayoría de los tripanosomas.

19 Se resuspendieron los parásitos en proporción 1:2 en solución tampón de fosfato salino glucosado (PBSG) ph 7,5 (tampón de fosfato salino 40mM ph 7,5, NaCl 150mM, Glucosa 1% m/v) y se centrifugaron a 6000g por 15 minutos a 15 C (Jouan, MR22). Se descartó el sobrenadante. El sedimento fue lavado una vez con 40 L de PBSG para eliminar los residuos de Percoll. Resuspender el sedimento final en 3mL de PBSG. Esta solución de parásitos se pasó por una columna de cromatografía de intercambio iónico previamente equilibrada a ph 7,5 (20g de DEAE-Celulosa (Watman 52, Sigma) como fase estacionaria y PBSG como eluyente) y las fracciones obtenidas fueron examinadas por microscopía. Las fracciones que contenían parásitos fueron reunidas y centrifugadas a 3000xg por 15 minutos a 15 C. Se unieron los sedimentos en un solo tubo utilizando 1ml de PBSG y se centrifugó a 14000xg por 5 minutos. Se descarta el sobrenadante y se guarda el sedimento a -80 C hasta el momento de su uso. Obtención de las proteínas. Se tomó una alícuota de 1-5 x 10 6 tripanosomas y se resuspendieron en 50 l de solución tampón acetato (50 mm, ph 5,5) con Triton X-100 1% v/v en hielo. Seguidamente, los parásitos sometieron 3 veces a choque térmico usando nitrógeno líquido durante 15 segundos y colocándolos en hielo 1 min. Luego el extracto fue centrifugado a 14.000 g x 15 minutos a 4 C (Eppendorf 5810R 15amp versión). Se separa el sedimento (TvAA1p y TvLiem76p) del sobrenadante (TvAA1s, y TvLiem76s) y se guardan a 80 C hasta su uso. Determinación de la concentración de proteínas. Las fracciones obtenidas de los dos diferentes aislados (TvAA1s y TvLiem76s) en el punto anterior, fueron sometidas a determinación de la concentración de proteína según el método de Lowry y col. [27] ; los ensayos se realizaron por duplicado. La determinación se hace en condiciones alcalinas, en donde el ión Cu 2+ forma un complejo con el enlace peptídicos de la proteína y se reduce a Cu +. Esta es la reacción de Biuret. Luego el ión Cu + y los grupos R de los aminoácidos triptófano (Trp, W), tirosina (Tyr, Y),

20 histidina (His, H) y cisteína (Cys, C) reaccionan con el reactivo Folin-Ciocalteau (que es un complejo hexavalente de ácido fosfomolibdico/fosfotugstico) reduciéndolo para originar el azul de molibdeno-tungsteno La curva de calibración se realizó usando albumina de suero bovino (BSA) en concentraciones de 0; 1; 2,5; 5; 10; 20mg/mL de proteina. Comparación del perfil proteico: Electroforesis en SDS-PAGE. Se llevó a cabo en una cámara de electroforesis MINI-PROTEAN II de Bio-Rad. El gel de corrida tenía un tamaño aproximado de 6 cm y 1,5 mm de espesor según Laemmli [28]. El gel de corrida se hizo al 12% de acrilamida en solución tampón tris-hcl 0,5M, ph 8,8 con 0,1% de dodecilsulfato de sodio (SDS). El gel de apilamiento al 5% de acrilamida en solución tampón tris-hcl 125mM, ph 6,8 con 0,1% de SDS. Las muestras se resuspendieron en solución tampón para muestra 4X (tris-hcl 100mM, ph 6,8, SDS al 2% m/v, glicerol al 2% v/v y azul de bromofenol al 0,02% m/v) 1:4; solución tampón: muestra cruda, con -mercaptoetanol como agente reductor y calentadas alrededor de 100 C por 5 min. La corrida electroforética se realizó con solución tampón de corrida (trisma base 25mM, glicina 195mM y 0,1% m/v de SDS) a temperatura ambiente con una corriente de 100 voltios. Luego se tiñeron los geles con azul brillante de coomassie R-250 al 0,1% m/v en metanol 25% v/v y ácido acético 10%v/v por 90 min. Pasado este tiempo, se les colocó solución decolorante que contenía 25% v/v de metanol y ácido acético 10% v/v hasta obtener una resolución adecuada de las bandas de proteínas. Se corrió junto con las muestra un estándar de peso molecular comercial Broad Range Protein Molecular Markers de Promega y una solución de 1mg/mL de BSA. Al finalizar se colocaron los geles en una solución fijadora de ácido acético 9% v/v para conservar la tinción del azul de coomassie.

21 Determinación de actividad peptidasa mediante zimogramas copolimerizados con gelatina. La actividad peptidasa de los sobrenadantes proteicos obtenidos de los extractos de T. vivax purificados mediante DEAE-celulosas se analizaron por zimogramas copolimerizados con gelatina al 1% m/v según Lantz y Ciborowski [29]. Se prepararon geles al 12% de acrilamida con un espesor de 0,75 mm. Las muestras se resuspendieron en solución tampón para muestra 4X (tris-hcl 100mM, ph 6,8, SDS al 2% m/v, glicerol al 2% v/v y azul de bromofenol al 0,02% m/v) 1:4; solución tampón: muestra cruda. Las muestras no se hirvieron para evitar la desnaturalización de las proteasas pero se les colocó -mercaptoetanol como agente reductor. La separación electroforética se realizó en una cámara MINI-PROTEAN II de Bio-Rad a 4 C y 70 voltios. Terminada la corrida, los geles se lavaron con buffer Tris-HCl 0,1 M, ph 8,8 conteniendo Triton X-100 al 1% v/v durante 30 minutos a temperatura ambiente, para remover el SDS. Luego, los zimogramas se lavaron tres veces con agua destilada y nuevamente con buffer Tris-HCl 0,1 M, ph 8,8 durante 30 minutos para eliminar el detergente remanente. Para confirmar que la actividad enzimática corresponde a una cisteín proteasa, los geles se incubaron durante 90 minutos a 37 C con diferentes soluciones: Sin activador, se usó solución tampón de citrato 0,1 M, ph 4,2. Con activador, a la solución tampón sele añadió 25 mm de L- cisteína (Sigma) y 2,5 mm de CaCl 2 (Sigma-Aldrich). Para inhibir la actividad enzimática se utilizó la solución tampón con activador y se le agregó 1mM de iodoacetamida (Sigma-Aldrich) (Bremo, 1997). El compuesto iodoacetamida es un inhibidor irreversible, no especifico de las cisteín proteasas. La reacción se puede observar en la figura 2.2 [30].

22 Figura 2.2. Esquema de reacción de iodoacetamida como inhibidor irreversible de las cisteín proteasas. (Tomado y modificado de http://webpages.ull.es/users/protllan/enzimas.pdf) Las diferentes soluciones de incubación fueron removidas con tres lavados de agua destilada y se tiñeron los zimogramas con solución de azul brillante de coomassie R-250 al 1% m/v en metanol 25% v/v, acido acético 10% v/v y agua destilada durante dos horas. Finalmente, los geles se dejaron en solución decolorante (metanol 25% v/v, ácido acético 10% v/v) hasta que se observaron bandas transparentes sobre un fondo azul. Para conservarlos se colocaron en solución fijadora (ácido acético 9% v/v). Determinación de actividad peptidasa mediante fluorimetría [31]. Para realizar los ensayos de medición de actividad enzimática por fluorometría se utilizaron los extractos de parásitos T. vivax purificados y el sustrato fluorogénico Benciloxicarbonil-Phe-Arg-aminometilcumarina (ZFR-AMC) 1 mm en DMSO. Este sustrato es específico para las cisteín proteasas. FR es un dipéptido que determina la preferencia de la proteasa, enlazándose en los sitios S2 y S1 del la proteasa y AMC es un grupo que tiene la capacidad de fluorescer cuando la proteasa hidroliza al sustrato [32].

23 Como control positivo del ensayo, se usaron extractos de parásitos T. evansi suministrados por el laboratorio. Para la realización de los ensayos de calibración y de actividad peptidasa, se utilizó una placa negra, tipo ELISA y un espectrofluoroluminómetro (GENios, TECAN). Se realizó una curva de calibración con las siguientes concentraciones finales de aminometil cumarina (AMC, PM: 175,2g/mol): 0; 0,125; 0,25; 0,5; O,75 y 1 M, utilizando 100 l de tampón acetato 200mM, ph 5,5 para cada muestra y un volumen final de 200 l. Se usó este compuesto, por ser el grupo fluorescente del sustrato usado. Como la fluorescencia es medida en unidades relativas de fluorescencia (U.R.F), esta curva hace posible la conversión a unidades de cantidad de producto AMC formado. Para el ensayo de actividad peptidasa, se utilizó 10 g de proteínas totales de TeAp-El Frio en 93,4 L de tampón acetato 100mM, ph5,5 y 2 L de Ditiotreitol (DTT) para un volumen final de 200 µl. Las concentraciones usadas de FR-AMC fueron: 0, 4, 10 y 20 M. De los aislados TvLiem76 y TvAA1 se usó 20 g de proteínas totales en 89,3 L del tampón acetato y 2 L de DTT para un volumen final de 200 L. La placa negra se leyó inmediatamente la placa a 360 nm de excitación y 465 nm de emisión a 37 C. Los ensayos se realizaron por duplicado.

CAPITULO 3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN. Infección experimental de ovinos con Trypanosoma vivax. Se realizaron cuatro infecciones experimentales en ovinos con el fin de expandir y purificar los aislados TvLiem76 y TvAA1. En estudios realizados previamente por Gómez (comunicación personal) con estos aislados geograficos, TvLiem76 fue el que presentó mayor parasitemia pero contrariamente a lo esperado, no es el aislado que presenta menor índice de hematocrito. Esta característica la manifiestan las infecciones con el aislado TvAA1 Infección con el aislado TvLiem76: Tres ovinos fueron inoculados con este aislado tal como vemos en la tabla 3.1. Tabla 3.1. Datos de la infección experimental con el aislado TvLiem76 de tres ovinos juveniles. Barbudo era macho y 129 y 131 eran hembras. Nombre Condiciones de o n de Infección animal Barbudo Sano. 4mL de aislado criopreservado (3,08 x 10 7 trip. totales) 129 Inmunosuprimido. 5mL de aislado criopreservado (5,64 x 10 7 trip. totales) 131 Sano. 10mL de sangre fresca infectada (3,00 x 10 7 ) Duración de la Infección Periodo de Prepatencia Pico de parasitemia Parasitemia máxima alcanzada 12 días 6 días 9 días y 12 días postinfección 3,02 x 10 7 trip/ml 8 días 4 días 7 días post-infección 1,32 x 10 7 trip/ml 5 días 2 días 4 días post-infección 1,01 x 10 7 trip/ml

25 Como se puede observar, estas infecciones se realizaron bajo tres condiciones diferentes. El periodo de prepatencia en las distintas infecciones se presentó entre los 2-3 días. Con Barbudo se tuvo parasitemias más altas, aunque el periodo de prepatencia fue de 3 días, mientras que 131 tuvo un periodo de prepatencia menor (2 días) pero también lo fue la parasitemia. Infección con el aislado TvAA1: Un ovino fue inoculado sangre criopreservada de ovino infectada con Trypanosoma vivax (Apure). Los datos obtenidos de la infección se ven en la tabla 3.2. Tabla 3.2. Datos de la infección experimental con el aislado TvAA1 de un ovino juvenil Nombre o n de animal Barriga Negra Condiciones de Infección Sano. 4mL de aislado criopreservado Duración de la Infección macho. Periodo de Prepatencia Pico de parasitemia 6 días 4 días 5 días y 6 días postinfección Parasitemia máxima alcanzada 1,92x107 trip/ml Se debe mencionar, que antes de las dos infecciones experimentales exitosas de los ovino 129 y 131, se intentó infectar a ambos animales una vez antes. Cada una de esta infecciones se siguió durante 30 días, sin ningún resultado. El periodo de prepatencia se definió como la cantidad de tiempo que pasó desde el momento que se hace la inoculación, hasta que se vio el primer parásito bajo el microscopio por el método de Brenner. A lo largo de todas las infecciones experimentales, se registraron las temperaturas y los hematocritos como medida del deterioro del animal producido por la presencia del parasito en su organismo. El seguimiento se hizo de forma interdiaria durante el periodo de prepatencia y diaria después de que se vio el primer parasito bajo microscopio. El hematocrito es el porcentaje de glóbulos rojo que se encuentran en la sangre. El bajo porcentaje de hematocrito indica anemia en el ovino. Los picos de parasitemia van acompañados, generalmente, por el bajo porcentaje de hematocrito y fiebre en el animal infectado. En las

26 figuras 3.1 y 3.2 vemos como variaron estos parámetros durante el tiempo que duraron las infecciones experimentales. Figura 3.1. Variación de la temperatura de cada ovino durante el tiempo de la infección. Con flechas se indica el día de tratamiento. Figura 3.2. Variación del hematocrito (%) de cada ovino durante el tiempo de la infección.

27 En las figuras 3.1 y 3.2 se señala con una flecha el momento en que el animal fue tratado. Es en ese momento que se termina la infección experimental. En las curvas se puede observar que la temperatura tiene una tendencia a subir cuando el índice de hematocrito tiene una tendencia a bajar para los dos aislados de tripanosoma. En la infección con el aislado TvAA1, se observó una mayor caída de hematocrito. Esto concuerda con los resultados obtenidos en las infecciones experimentales de Gómez. Extracción de ADN genómico de alto peso molecular a partir de sangre total. Partiendo de muestras de sangre congeladas y extraídas de los ovinos durante el tiempo de la segunda infección, se extrajo ADN genómico de alto peso molecular. Una vez obtenidos los ADNs se verificó su integridad, realizando una electroforesis de agarosa 0,8% m/v (Figura 3.3). Figura 3.3. Gel de Agarosa 0,8% que muestra la integridad de los ADNs extraídos de la sangre infectada experimentalmente de ovinos con T. vivax. Todas las muestras indican el nombre de la oveja (numero a la izquierda) y el día post-infección que se tomó la muestra (numero a la derecha).