óptica de tren óptico La iluminación es proporcionada por una lámpara de Tungsteno- Haluro posicionado en el portalámparas, que emite luz que pasa primero a través de una lente colectora y luego en un camino óptico en la base del microscopio. También estacionado en la base del microscopio se encuentra una serie de filtros que condicionan la luz emitida por la lámpara incandescente antes de que se refleje en un espejo y pase a través del diafragma de campo y en el condensador de platina inferior. El condensador forma un cono de iluminación que baña la muestra, que se encuentra en la platina del microscopio, y posteriormente entra en el objetivo. La luz que va dejando el objetivo es desviada por un haz divisor y por una combinación de prismas ya sea por los oculares para formar una imagen virtual, o directamente a través de la lente de proyección montada en el tubo de extensión tri-ocular, donde entonces se puede formar una imagen sobre la matriz de fotodiodos CCD posicionada dentro del sistema de imagen digital. Los componentes ópticos y mecánicos del microscopio, incluyendo el espécimen montado en un portaobjetos de vidrio y de micro cubreobjetos, forman un tren óptico con un eje central que atraviesa la base del microscopio. Los fabricantes de microscopios recomiendan un grosor de 0,17 mm de los cubreobjetos. Muchas son preparadas con cubreobjetos de otros grosores. Esto es de poca importancia para las observaciones en bajas potencias, pero influye fuertemente a 40X o más. En cuanto a los diseñadores de objetivos, los cubreobjetos no estándar trastornan la aberración esférica del objetivo; en términos de los usuarios, la imagen pierde contraste y se ve nublado. Se utilizan instrumentos ópticos diversos, tales como diafragmas colocados estratégicamente, espejos, prismas, divisores de haz, y otros elementos ópticos. El microscopio de tren óptico consiste típicamente en un iluminador (incluyendo la fuente de luz y lentes colectores), una lente condensadora, espécimen, objetivo, ocular, y el detector, que puede ser algún tipo de cámara o el ojo del observador. Nikon Eclipse E600 equipado con un cabezal trinocular y sistema de cámara digital-dxm 1200 para la grabación de imágenes. Imagen de fluorescencia multicolor capturado digitalmente de células de cultivo de tejido
basada en fotones de fluorescencia 1. Excitación: La luz o el haz del láser de la fuente incide sobre la muestra, haciendo que sus fluoróforo pasen a un estado electrónico excitado. 2. Tiempo de vida de excitación: El estado excitado existe por un tiempo finito (1-10 nanosegundos).durante este tiempo, el fluoróforo sufre cambios conformacionales y está también sujeto a una multitud de posibles interacciones con su entorno molecular. 3. Emisión de fluorescencia: Un fotón con energía menor a la incidida es emitido, regresando al fluoróforo al estado base de energía. Electroforesis en gel, manchas y cromatogramas. Soluciones diluidas o suspensiones. Ficobiliproteínas. Nanocristales. Es necesario que las contengan fluorocromos o fluoróforos, que es justamente el componente que hace que la muestra fluoresca. Fluorocromo: Marcador colorante fluorescente empleado en investigación para crear contraste en zonas determinadas de los especímenes. Fluoróforo: Parte de una molécula (fluorocromo, proteína) que le imparte la propiedad de fluorescencia. En instrumentos contemporáneos, la fuente de excitación suele ser la línea espectral 488 nm del láser de argón-ion. Cuatro elementos esenciales de los sistemas de detección de fluorescencia pueden ser identificados: 1) una fuente de luz de excitación, 2) un fluoróforo, 3) filtros de longitud de onda para aislar los fotones de emisión de los fotones de excitación, 4) un detector que registra los fotones de emisión y produce una de salida de grabación, por lo general como una señal eléctrica. de fluorescencia Olympus BX61, acoplado con una cámara digital. Microscopía de fluorescencia de una muestra con microorganismos endolíticos (endolítico = dentro de la piedra). En verde fluoresce el mineral y en rojo las bacterias Citometría de Flujo Un citómetro de flujo está compuesto por tres subsistemas principales: fluidos, óptica y electrónica. Fluidos: El subsistema de fluidos transporta partículas en una corriente de fluido al rayo láser para ser interrogado. El punto en el cual las partículas se encuentran con el rayo láser es el punto de interrogación. La luz láser incidente es dispersada y la fluorescencia es emitida en forma de partículas pasan a través del punto de interrogación Óptica: Proporciona fuentes de excitación y recoge las señales de luz. La citometría de flujo es un proceso de realizar mediciones en células o partículas que se encuentran en suspensión líquida. Por ejemplo: células, cromosomas, bacterias y glóbulos. Las células de los tejidos sólidos deben ser desagregadas antes del análisis. Se puede medir el tamaño relativo de la muestra. También la complejidad interna, y la intensidad de fluorescencia relativa. Citómetro de Flujo BD Accuri C6
multifotónica Electrónica: Convierte las señales ópticas en señales electrónicas equivalentes, a continuación, en datos digitalizados. Se basa en la estimulación de un fluorocromo de modo simultáneo por dos (o más) fotones. La energía de ambos fotones se suma y juntos son capaces de estimularle del mismo modo que lo haría un solo fotón con el doble de energía (doble de frecuencia) que uno de estos fotones individualizados. Posee un láser especial ya que no es continuo, es pulsante. Todos los fotones los concentran en pulsos extremadamente cortos. El objetivo del microscopio concentra todavía más los fotones en un punto (distancia focal) logrando que dos fotones infrarrojos muy juntos actúen como si fuera un fotón del doble de energía. Así, con fotones de longitud de onda 800 nm (infrarrojo, poca energía) se generan excitaciones del 400 nm (mucha energía). Así se conjugan las ventajas del confocal con las ventajas del uso de láseres de baja energía media. Típicamente de tamaño 0.2-50 micras Estudio de espesas. Muestras fluorescentes. Tejidos biológicos El multifotón es un confocal normal con unas adaptaciones y un láser de excitación de la muestra especial. Sin embargo, el protocolo de marcaje de la muestra es el mismo tanto si se usa para microscopía de fluorescencia, confocal o multifotón. La microscopía de fluorescencia esta limitada cuando observamos gruesas. La luz visible (microscopio óptico) es fuertemente dispersada en los tejidos biológicos y por lo tanto las imágenes de fluorescencia se limitan a una profundidad de imagen de alrededor de 100 micras. En contraste, la microscopía multifotónica utiliza longitudes de onda de excitación en los infrarrojos, y toma ventaja la reducida dispersión de longitudes de onda más largas. Esto hace a las imágenes multifotónicas la herramienta perfecta para imágenes de tejidos profundos en secciones gruesas y animales vivos. Las aplicaciones van desde la visualización de la compleja arquitectura de todo el cerebro para el estudio del desarrollo del tumor y la metástasis o las respuestas del sistema inmune en animales vivos. En un sistema de microscopio multifotónica, el rayo láser pasa a través de un enrutamiento de haz fijo que lleva al soporte microscopio y a través del objetivo para la muestra. Especialmente el objetivo se compone de muchos elementos ópticos hechos de vidrio. La luz viaja a través del cristal a diferentes velocidades dependiendo de su longitud de onda. Este efecto se denomina dispersión. La unidad precompensación del láser invierte el efecto de dispersión del microscopio antes de que la luz entre en el recorrido óptico. La combinación de la dispersión de la unidad de precompensación y la del microscopio debe resultar en dispersión cero. multifotónico Leica TCS SP8 MP Imagen multifotónica de una sección transversal de retina humana no teñida sin (arriba) y con (abajo) óptica adaptativa. Imágenes multifotónicas de la células ganglionares (izquierda) y de los fotorreceptores (derecha) de la retina del pollo.
s electrónicas Microscopía electrónica de transmisión (TEM) Microscopía electrónica de barrido (SEM) Los electrones son emitidos por un cátodo caliente, y acelerados por una diferencia normal de potencial de 10 a 100 kv. Pasan por una lente condensadora y se conforman en un rayo paralelo, antes de pasar por el espécimen u objeto a examinar. La lente objetivo forma entonces una imagen intermedia de este objeto, y la lente de proyección produce una imagen real final del objeto. Las lentes objetivo y de proyección desempeñan los papeles de las lentes objetivo y ocular, respectivamente, de un microscopio óptico compuesto. La imagen final se registra en una película fotográfica, o se proyecta sobre una pantalla fluorescente, para verla o fotografiarla. El haz de electrones se enfoca formando una línea muy fina que barre el espécimen, al igual que el haz de electrones en un cinescopio de TV traza la figura. Cuando el haz barre el espécimen, los electrones salen despedidos y son reunidos por un ánodo recolector positivo con respecto a la muestra, mantenido a un potencial de algunos cientos de volts. La corriente en el ánodo recolector se amplifica y usa para modular el haz de electrones en un tubo de rayos catódicos, que es barrido en sincronización con el haz en el microscopio. Así, el tubo de rayos catódicos traza una imagen muy aumentada del espécimen. El espécimen a examinar es muy delgado, normalmente de 10 a 100 nm de espesor, por lo que los electrones no se desaceleran en forma apreciable al atravesarlo. La preparación de las es relativamente fácil ya que la mayoría de los SEM sólo requieren que estas sean conductoras. De esta forma, la muestra generalmente es recubierta con una capa de carbono o una capa delgada de un metal como el oro para conferirle carácter conductor. Pueden ser biológicas, metálicas. Solamente pueden observarse organismos muertos, y no se puede ir más allá de la textura externa que se quiera ver. Todo el aparato, incluyendo el espécimen, debe estar encerrado en un recipiente al vacío, igual que en el caso del tubo de rayos catódicos; de no ser así, los electrones se dispersarían con las moléculas de aire, y perjudicarían la imagen. Este esquema tiene varias ventajas. El espécimen puede ser grueso, porque el haz no necesita atravesarlo. También, la producción de electrones despedidos depende del ángulo con el que el haz llega a la superficie. Así, las micrografías de un microscopio electrónico de barrido parecen mucho más tridimensionales que las tomadas con luz visible. La resolución característica es de 10 nm, todavía mucho más fina que la de los mejores microscopios ópticos. electrónico de barrido XL30 ESEM-FEG La imagen de este MET presenta una célula de piel en el proceso de división en dos células vástago. Se utilizó un color falso para mostrar el material genético (verde oscuro). Características morfológicas de nanopartículas de oro Mosca de murciélago (Streblidae) Cabeza de hormiga
s de efecto túnel de fuerza atómica Fundamento Es un instrumento mecano-óptico capaz de detectar fuerzas del orden de los nano Newton. Al analizar una muestra, es capaz de registrar continuamente la altura sobre la superficie de una sonda o punta cristalina de forma piramidal. La sonda va acoplada a un listón microscópico, muy sensible al efecto de las fuerzas, de sólo unos 200 µm de longitud (cantileve) La fuerza atómica se puede detectar cuando la punta está muy próxima a la superficie de la muestra. Es posible entonces registrar la pequeña flexión del listón mediante un haz laser reflejado en su parte posterior. Un sistema auxiliar piezoeléctrico desplaza la muestra tridimensionalment e, mientras que la punta recorre ordenadamente la superficie. Todos los movimientos son controlados por una computadora. Tipo de Funciona bien con duras. No tocar directamente la superficie de las con las manos por que pueden contaminarse. Las deben ser conductoras. Particularidad Diagrama óptico Imagen del microscopio Imagen que se obtiene o gráfico La resolución del instrumento es de menos de 1 nm, y la pantalla de visualización permite distinguir detalles en la superficie de la muestra con una amplificación de varios millones de veces. Bruker AFM multimode Nanoscope III A Glóbulos rojos irradiados a 25 Gy.