INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA DEPARTAMENTO DE BIOPROCESOS ACADEMIA DE BIOTECNOLOGÍA MANUAL DEL LABORATORIO DE BIOTECNOLOGÍA MOLECULAR ELABORADO POR: M. en C. Paola Berenice Zárate Segura I. Bt. César A. Jiménez Sierra Dr. Jesús Agustín Badillo Corona Dr. Claudio Dra. María del Carmen Oliver Salvador México D. F. Agosto 2009 1
Relación de prácticas PRÁCTICA 1. Bioseguridad PRÁCTICA 2. Cuantificación de ADN PRÁCTICA 3. Extracción de ADN PRÁCTICA 4. Cuantificación de ADN en gel de agarosa PRÁCTICA 5. Extracción de ARN PRÁCTICA 6. Extracción de ADN plasmídico por lisis alcalina PRÁCTICA 7. Inserción de material genético en un plásmido bacteriano. PRÁCTICA 8. Reacción en cadena de la Polimerasa (PCR). PRÁCTICA 9. Método para preparar células competentes de Escherichia coli con CaCl 2 PRÁCTICA 10. Transformación de células competentes PRÁCTICA 11. Inmunodetección en estado sólido PRÁCTICA 12. Inmuno ensayo Ligado a enzimas (ELISA) PRÁCTICA 13. Transformación genética de plantas de tabaco (Nicotiana tabacum) utilizando Agrobacterium tumefaciens 2
PRÁCTICA 1. Bioseguridad Según la Ley de Bioseguridad de organismos genéticamente modificados publicada en el Diario Oficial de la Federación el 18 de marzo del 2005 (1), bioseguridad se define como: Las acciones y medidas de evaluación, monitoreo, control y prevención que se deben asumir en la realización de actividades con agentes biológicos, con el objeto de prevenir, evitar o reducir los posibles riesgos que dichas actividades pudieran ocasionar a la salud humana o al medio ambiente y la diversidad biológica, incluyendo los aspectos de inocuidad de dichos organismos que se destinen para uso o consumo humano. Por otra parte, como Biotecnología moderna se entiende: la aplicación de técnicas in vitro de ácidos nucleicos, incluidos el ácido desoxirribonucleico (ADN) y el ácido ribonucleico (ARN) recombinante y la inyección directa de ácido nucleico en células u organelos, o la fusión de células más allá de la familia taxonómica, que supera las barreras fisiológicas naturales de la reproducción o de la recombinación y que no son técnicas utilizadas en la reproducción y selección tradicional, que se aplican para dar origen a organismos genéticamente modificados, que se determinen en las normas oficiales mexicanas que deriven de esta Ley (1) Los principios de BIOSEGURIDAD se pueden resumir en: A) Universalidad: Todo el personal debe seguir las precauciones estandarizadas de manera rutinaria para prevenir la exposición de la piel y de las membranas mucosas, en todas las situaciones que puedan dar origen a accidentes. Estas precauciones, deben ser aplicadas por y para TODAS las personas. B) Uso de barreras: Comprende el concepto de evitar la exposición directa a agentes biológicos infecciosos o sustancias potencialmente contaminantes, mediante la utilización de materiales adecuados que se interpongan para evitar el contacto con estos agentes y sustancias. La utilización de barreras (ej. bata de laboratorio, guantes, lentes de protección, mascarillas, etc.) no evitan los accidentes de exposición a estos fluidos, pero disminuyen las consecuencias de dicho accidente. C) Medios de eliminación de material contaminado: Comprende el conjunto de dispositivos y procedimientos adecuados a través de los cuales los materiales biológicos y químicos utilizados en los laboratorios son depositados para su almacenamiento y posterior eliminación sin que se presente ningún riesgo. 3
Algunos aspectos importantes en Bioseguridad incluyen (2): Contención El término contención se utiliza para describir métodos seguros para manejar materiales biológico-infecciosos en el medio ambiente del laboratorio donde son manipulados o conservados. El objetivo de la contención es reducir o eliminar la exposición de quienes trabajan en laboratorios u otras personas, y del medio ambiente externo a agentes potencialmente peligrosos. La contención primaria se refiere a la protección del personal y del medio ambiente inmediato del laboratorio a la exposición a agentes infecciosos, es provista tanto mediante buenas técnicas microbiológicas como a través del uso de equipos de seguridad adecuados. La contención secundaria, se refiere a la protección del medio ambiente externo al laboratorio a la exposición a materiales infecciosos. Esta contención se logra utilizando una combinación del diseño de la instalación y de las prácticas operativas. Por lo tanto, los tres elementos de contención incluyen prácticas y técnicas de laboratorio, equipos de seguridad y el diseño de la instalación. La evaluación del riesgo del trabajo a realizar con un agente específico determinará la combinación apropiada de estos elementos. Equipos de Seguridad (Barreras Primarias) Los equipos de seguridad incluyen gabinetes de seguridad biológica (BSCs), recipientes cerrados, y otros controles de ingeniería destinados a eliminar o minimizar las exposiciones a materiales biológicos peligrosos. Un ejemplo de otra barrera primaria es la cubeta centrífuga de seguridad, un recipiente cerrado destinado a prevenir la liberación de aerosoles durante el centrifugado. Diseño y Construcción de Instalaciones (Barreras Secundarias) El diseño y la construcción de la instalación contribuyen a la protección de quienes trabajan en el laboratorio, proporcionan una barrera para proteger a las personas que se encuentran fuera del laboratorio, y protegen a las personas o animales de la comunidad de agentes infecciosos que pueden ser liberados accidentalmente del laboratorio. Niveles de Bioseguridad. Existen cuatro niveles de bioseguridad (BSLs), que constan de combinaciones de prácticas y técnicas de laboratorio, equipos de seguridad e instalaciones de laboratorio. Cada combinación es específicamente apropiada para las operaciones llevadas a cabo, las vías de transmisión documentadas o sospechosas de los agentes infecciosos, y la función o la actividad del laboratorio (tabla 1). 4
Tabla 1. Niveles de bioseguridad recomendados para el trabajo con agentes infecciosos (2) NIVEL I II III IV Grupo de Riesgo Bajo riesgo individual Bajo, Riesgo Comunitario Moderado riesgo individual, Riesgo comunitario limitado Alto riesgo individual, Bajo riesgo comunitario Alto riesgo Individual, Alto riesgo Comunitario Agentes Que no causen enfermedad en individuos adultos saludables (Cepas silvestres) Asociados con enfermedad en humanos, en donde haya riesgo de infección por heridas percutáneas, ingestión y exposición de membrana mucosa (Shigella, Staphylococcus, Sporotrix) Agentes autóctonos o exóticos con riesgo de transmisión por aerosoles y que causen enfermedades serias o letales (Brucilla, Hystoplasma) Agentes peligrosos o exóticos con alto riesgo de causar enfermedad mortal por transmisión por aerosoles o agentes similares con forma de transmisión desconocida (EBOLA, SARS, B. Antracis) NBS = Nivel de Bioseguridad Prácticas Prácticas microbiológicas comunes NBS 1. Acceso Limitado. Deben utilizarse señalamientos, se deben tomar medidas de precaución en material punzo cortante. Debe contar con manual de Bioseguridad definiendo procedimientos y políticas de confinamiento, desinfección de zonas y materiales y atención médica. NBS 2. Acceso controlado. Procedimientos rutinarios de desinfección de ropa, desechos y material previo al lavado. NBS 3. Ropa (trajes) individuales, equipados en cuartos previos al área de trabajo. Regadera a la salida del Laboratorio. Mecanismo de descontaminación del área de trabajo. Barrera Primaria (Equipos) Campana de flujo laminar Gabinetes de Bioseguridad Clase I o II, equipo para prevenir derrames o difusión de aerosoles. El personal debe utilizar Bata, guantes y cubre bocas o careta, de ser necesario. Todas las anteriores, incluyendo protección del sistema respiratorio. Gabinetes de Bioseguridad Tipo 3. Trajes individuales sellados con sistema de respiración autónomo y presión de aire positiva Barrera Secundaria (Instalaciones) Mesa de Laboratorio con servicio de agua y drenaje. NBS 1. Además, debe existir autoclave. NBS 2, Separación de los corredores de acceso, puertas dobles (sistema de exclusa). Debe evitarse la recirculación del aire. Presión de aire negativa en el área de trabajo NBS 3. Debe ser una zona aislada, con sistemas individuales de obtención y liberación de vacío, sistema de suministro y descontaminación de aire, generador de energía auxiliar. Tipo de Laboratorio Enseñanza Básica Servicios de salud, Hospital de nivel primario, laboratorios de diagnóstico y Laboratorios de nivel Universitario Laboratorios de Diagnóstico Especializado. Laboratorios que trabajan con agentes patógenos peligrosos 5
OBJETIVO Informar y motivar a los alumnos sobre principios y normas de bioseguridad para su aplicación activa en el trabajo de laboratorio ACTIVIDADES Actividad dinámica por los alumnos para identificar los posibles riesgos en el laboratorio y las medidas necesarias que se pueden llevar a cabo para minimizarlos. Identificar y describir los equipoa en el laboratorio. Entender los procedimientos adecuados para la utilización de estos equipos. REFERENCIAS 1. LEY DE BIOSEGURIDAD DE ORGANISMOS GENÉTICAMENTE MODIFICADOS Nueva Ley DOF 18-03-2005 2. http://www.cdc.gov/od/ohs/pdffiles/bmbl4_spanish.pdf 6
INTRODUCCIÓN PRÁCTICA 2. Cuantificación de ADN En la mayoría de los casos cuando se trabaja con ADN es importante realizar una cuantificación de la cantidad con la que se dispone. La cuantificación del ADN se puede llevar a cabo por estimación de la intensidad de una banda en geles de agarosa en el que el ADN es teñido por algún colorante como Bromuro de Etidio, Syber Green o Gel Red, o bien mediante técnicas de espectrofotometría de luz ultravioleta. Los dobles enlaces conjugados de las bases nitrogenadas hacen que los ácidos nucleicos absorban luz ultravioleta (UV). El espectro de absorción característico de AN presenta un máximo a λ ~ 260 nm. Si bien el coeficiente de extinción de un ácido nucleico en particular depende de la secuencia de nucleótidos, algunas reglas empíricas permiten estimar la concentración a partir del valor de A 260 nm. Así, una unidad de absorbancia a 260 nm corresponde aproximadamente a una concentración de 50 µg/ml de ADN doble hebra, 40 µg/ml de ARN o 33 µg/ml de fragmentos cortos de ADN monohebra. En las preparaciones de ácidos nucleicos, son frecuentes las impurezas de naturaleza proteíca. Dado que los aminoácidos aromáticos (Phe, Tyr, Trp) absorben luz UV, la presencia de proteínas lleva a sobrestimaciones de la concentración de ácidos nucleicos. Dado que el máximo de absorbancia de las proteínas se encuentra en λ ~ 280 nm, es posible estimar el grado de impurezas de origen proteico a partir del cociente A 260 /A 280. La presencia de proteínas en la muestra hará que el cociente A 260 nm /A 280 sea menor que el esperado para ácidos nucleicos puros. Para el ADN doble hebra en soluciones de alta pureza se espera A 260 /A 280 1.8, y para ARN, A 260 /A 280 2.0. Para que la cuantificación de ácidos nucleicos sea adecuada se requiere la habilidad de medir de manera exacta y reproducible. El transferir volúmenes pequeños de líquidos es crítico para obtener resultados confiables es por ello que en los laboratorios de biología molecular para medir volúmenes pequeños, se utiliza un dispositivo conocido como micropipeta (Fig 1). Las micropipetas tienes diferentes capacidades de medida, 0.1-1 µl, 0.5-10 µl, 10-100µL, 20-200 µl, 100-1000 µl, 1000-5000 µl.. OBJETIVOS Objetivo General Llevar a cabo al cuantificación de ADN por métodos espectrofotométricos Objetivos específicos Conocer las partes y el funcionamiento de las micropipetas, Adquirirá destreza en la utilización de pipetas para la medición de volúmenes pequeños. 7
Figura 1. Micropipeta. Se muestran las diferentes partes de la pipeta así como puntas de diferente tamaño para la medición de diferentes volumenes. MATERIALES 1 juego de micropipetas P1000, P200 y P10 por equipo Agua desionizada Balanza analítica con límite de 0,0001 g Tapas de cajas de petri de plástico Puntas de diferentes capacidades (10, 200 y 1000 µl) Muestra de ADN en solución de concentración desconocida 8
METODOLOGÍA EXPERIMENTAL MANEJO DE LA MICROPIPETA Importante: Para el uso adecuado de la micropipeta asegúrese que está usando la micropipeta correcta para el volumen que necesita medir. También, asegúrese que la micropipeta está realmente lista para el volumen que necesita revisando la ventana de volumen. Si es necesario, cambiar el volumen mediante el dispositivo del control o mando del volumen hasta que la micropipeta corrija el volumen (la micropipeta no lee su mente; varias personas usarán las pipetas, no siempre se encontrará como usted la necesita). NO trate de colocar la micropipeta para volúmenes mayores que el máximo, o para volúmenes menores del cero, esto descalibrará y dañará la micropipeta. 1) Partes de la micropipeta a) Identificar las partes de la micropipeta ayudándose de la imagen en la Figura 1. b) Observar las diferencias entre la micropipeta a usar y la mostrada en al Figura 2) Llenado de la pipeta a) Colocar una punta según corresponda. b) Colocar el pulgar sobre el mando o émbolo de pipeteado. c) Oprimir el émbolo hasta el primer un punto de resistencia alto o "tope". Si continúa presionando encontrará un punto donde el émbolo ya no se mueve hacia abajo, este corresponde al segundo punto de resistencia alto o "tope". d) Oprimir el émbolo hasta el primer tope y colocar la punta dentro del líquido hasta una profundidad menor a 1 mm. De una manera lenta y controlada, disminuya la presión del émbolo para permitir que se desplace hacia arriba. No suelte el émbolo abruptamente, al permitirlo causará que el líquido pueda salpicar dentro de la punta produciendo volúmenes inexactos y generando contaminación de la pipeta. Una vez el émbolo se haya desplazado hasta arriba mantenga la micropipeta en el líquido durante un segundo, esto evita que se aspire aire en la parte final. 3) Expulsión de la muestra a) Llevar la micropipeta al tubo de polipropileno de 1.5 ml. b) Se apoya la punta en la pared inferior del tubo. c) Oprimir el émbolo hasta el primer tope y luego hasta el segundo tope. Haga este procedimiento a una velocidad moderada, hacerlo muy rápido hará que queden gotas de muestra en la punta. Si observa cuidadosamente, entonces notará que al oprimir hasta el segundo alto se expele todo el líquido de la punta. 9
d) Lo anterior es cierto para la mayoría de soluciones acuosas, excepto para las soluciones de alta viscosidad como el Glicerol. Si es usada inadecuadamente, la micropipeta transferirá volúmenes inexactos. 4) Calibración de Micropipeta La micropipeta puede perder su calibración. Comprobar la calibración de la pipeta es un procedimiento simple que puede ahorrar tiempo considerable, energía, y reactivos. En esta práctica aprenderá a usar la micropipeta de tamaños diversos medir su exactitud, precisión y calibración. Para cada micropipeta revisar el porcentaje de exactitud (E%) y el coeficiente de variación (CV%) en todo el rango usando al menos dos volúmenes diferentes; por ejemplo: Para la micropipeta P1000 revisar los volúmenes de 300 µl y 1000 µl. Para P200 revisar los volúmenes de 60 y 200 µl. Para P10 revisar 3 y 10 µl. a) Seleccionar la micropipeta y las puntas adecuadas. b) Colocar la tapa de la caja de petri en la balanza y tarar a cero. c) Tomar el volumen de agua destilada con la micropipeta y dispénselo en la tapa de la caja de petri. Registre el peso del agua añadido. La densidad del agua es 1 g/ml a 25ºC, por lo tanto un volumen de 1 ml corresponde aproximadamente a una masa de 1 g, 300 µl a 0.3 g, 200 µl a 0.2 g, 60 µl a 0.06 g, 10 µl a 0.01 g y 3 µl a 0.003 g. d) Repita el procedimiento cinco veces para cada volumen. e) Repetir todo el procedimiento para glicerol. La densidad del glicerol es de 1,2656 g/ml a 25 C. f) Calcular la masa esperada para cada volumen 5) Cálculo de la exactitud (E%) y del coeficiente de variación (CV%) Valor medio X = Σ Xi /n donde Xi= pesadas, n= numero de pesadas Volumen medio V=X.Z donde X= valor medio y Z= factor z (1/densidad) Valore del control a 21,5 C (Z = 1,0032) Exactitud E(%)= ((V-V nominal )/V nominal ) *100 Desviación estándar S = Z. Σ(Xi X)2 n 1 10
Coeficiente de Variación CV= (S*100)/V Límites de tolerancia para micropipetas Volumen (µl) E% nominal CV% nominal 5-10 1 0.8 20-50 0.7 0.4 100-1000 0.5 0.2 Una vez determinadas la exactitud y el coeficiente de variación de las micropipetas proporcionadas, realice la cuantificación de las muestras proporcionadas. 6) Cuantificación de ADN Preparación de las muestras. a) Realice diluciones 1:10, 1:100 y 1:1000 de las muestras proporcionadas por triplicado con agua Milli Q estéril, en tubos de polipropileno estériles. b) c) Encienda el espectrofotómetro al menos 15 minutos antes de iniciar las lecturas. d) Mantenga las muestras en hielo o en refrigeración hasta ser cuantificadas e) Cuantifique las muestras a 260 y 280mn f) Realice los cálculos correspondientes Muestra Dilución Lectura 260 nm ADN1 ADN2 REFERENCIAS Lectura 280 nm Relación 260/280 ADN (ng/µl) ADN (fg/µl) ADN (mg/µl) Sambrook, J. y Russell, D. W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3ª ed. Ed Cold Spring Harbor Laboratories. Nueva York. USA 2001. 2344 págs. 11
INTRODUCCIÓN PRÁCTICA 3. Extracción de ADN Hay diferentes técnicas que permiten obtener ácidos nucleicos con alto grado de pureza. Las más utilizadas suelen incluir una etapa de ultracentrifugación en gradientes de CsCl o una cromatografía de intercambio iónico. Sin embargo, muchas aplicaciones de laboratorio no necesitan un grado de pureza tal que justifique incluir estas técnicas (laboriosas y/o caras) en los protocolos de purificación. Las etapas del procedimiento que se realizan son las siguientes: Desintegración del tejido y solubilización y homogenización de los componentes celulares Precipitación de los ácidos nucleicos y disolución en un buffer adecuado Homogenización de la muestra El método para desintegrar el tejido debe estar adaptado a las características de éste. Para grandes volúmenes de tejidos blandos, suelen usarse licuadoras esencialmente iguales a las licuadoras domésticas. Para volúmenes menores, en general es suficiente un homogeneizador, el cual consiste en un tubo de vidrio de paredes gruesas y un pistón (de vidrio o de teflón). La rotación del pistón dentro del tubo (propulsión manual o por un motor), disgrega la muestra. Tejidos más resistentes, como por ejemplo hueso o diente, necesitan tratamientos mecánicos especiales. Aquellos tejidos con células cuya pared celular es resistente, como por ejemplo vegetales, hongos o bacterias, requieren también condiciones drásticas. Uno de los métodos más utilizados consiste en congelar la muestra en nitrógeno líquido y, manteniéndola congelada, pulverizarla con un mortero. Así, además de desintegrar la muestra, se logra que ésta se mantenga a muy baja temperatura durante el tratamiento, con lo cual se evita la acción de nucleasas endógenas que pudieran degradar el material de interés. Como puede deducirse de los párrafos anteriores, se han descrito diversos métodos particulares a cada tipo de muestra. Por ejemplo, en el caso particular de células bacterianas, se emplea típicamente la enzima lisozima, que cataliza la degradación de la pared celular. Para facilitar a la solubilización de los componentes celulares, y a la ruptura de membranas y complejos proteicos, la solución de lisis contendrá un detergente iónico (dodecil sulfato de sodio, SDS). Este detergente dispersa los componentes de las membranas y desnaturaliza las proteínas. La solución de lisis contiene además el agente quelante de cationes divalentes EDTA. Esto impide la acción de las ADNasas (dependientes de Mg ++ ), aunque no tiene efectos sobre la mayor parte de las ribonucleasas Es importante comprender que durante la homogenización de la muestra, así como en otros pasos siguientes de la purificación de ácidos nucleicos, las moléculas de gran tamaño (como por ejemplo las moléculas de ADN genómico presentes en los cromosomas, cuyo tamaño es del orden de millones de pares de bases) es fragmentado mecánicamente en 12
forma parcial, por lo que se obtienen fragmentos de tamaño mucho menor (típicamente entre 20 y 200 kb). El grado de fragmentación dependerá, obviamente, de los métodos utilizados para la homogeneización y purificación. Los métodos más vigorosos por lo general permiten mayores rendimientos, al maximizar el número de células lisadas, pero por la misma razón llevan a una mayor fragmentación del ADN. Extracción de proteínas y lípidos Los ácidos nucleicos son muy solubles en agua debido al fuerte carácter hidrofílico de sus grupos fosfato. Dentro de una mezcla de solventes no miscibles, uno acuoso y otro orgánico no polar, los ácidos nucleicos tenderán a permanecer en la fase acuosa, en tanto que los lípidos y gran parte de las proteínas desnaturalizadas se encontrarán en la fase orgánica. En la preparación de ácidos nucleicos, los solventes que se usan más frecuentemente para la extracción de proteínas y lípidos son el fenol y el cloroformo. Precipitación de ácidos nucleicos La precipitación de los ácidos nucleicos permite su purificación y concentración. Se basa en la simultánea neutralización de las cargas negativas (mediante el añadido de sales), y deshidratación de la molécula (mediada por el agregado de alcoholes, típicamente etanol o isopropanol), lo cual lleva a su precipitación. La precipitación es un fenómeno reversible (mediante la disolución en soluciones acuosas) y no debe ser confundido ni con la desnaturalización (potencialmente reversible) ni con la degradación (irreversible) de los mismos. OBJETIVOS Objetivo General Extraer ADN de diferentes muestras por métodos físico-químicos Objetivos específicos Conocer la metodología básica para la extracción de ADN Adquirir destreza en la manipulación de diversas muestras biológicas para la extracción de ADN Determinar la integridad del ADN por electroforesis en gel de agarosa MATERIALES Reactivos y Materiales Acetato de Sodio (3 M) Etanol absoluto Etanol 70% Fenol Cloroformo 13
Agua desionizada TE (ph 8.0) 1 juego de micropipetas P1000, P200 y P10 por equipo Gradillas Medio LB líquido Termobloques Tubos de polipropileno 1.5 ml Centrifuga Vortex Muestras biológicas Una alícuota de 3 ml de un cultivo líquido de E. coli incubado por 14-16 h a 37 C con agitación constante de >200 rpm. Una muestra de suelo. METODOLOGÍA EXPERIMENTAL IMPORTANTE: Además de los aspectos básicos de bioseguridad (bata obligatoria, zapatos cerrados) se deberá usar en todo momento guantes de látex o vinilo. Primera Sesión. Extracción de DNA Extracción de ADN de E. coli 1. Propagar un cultivo de E. coli en medio LB (3 ml) durante toda la noche (14-16 h) a 37 C con agitación constante de >200 rpm. 2. Colocar 1 ml del cultivo en un tubo de polipropileno de 1.5 ml. 3. Centrifugar el tubo a 7000 g durante 2 min. 4. Decantar el sobrenadante. 5. Agregar 250 µl de agua desionizada estéril al paquete celular. 6. Agitar vigorosamente utilizando un vortex hasta lograr la resuspensión de las células (aproximadamente 30 s). 7. Agregar 250 µl de fenol (equilibrado con Tris 1M ph 8.0). 8. Agitar vigorosamente durante 30 s utilizando un vortex. 9. Agregar 250 µl de cloroformo. 10. Agitar vigorosamente utilizando un vortex durante 30 s. 11. Centrifugar a 19000 g durante 5 min. 12. Recuperar la fase acuosa (fase superior, aprox. 225 µl) y colocarla en otro tubo de 1.5 ml. En muchas ocasiones en la interfase se presenta un precipitado blanco, este 14
precipitado no debe de ser recuperado, ya que son proteínas que pueden contaminar la muestra e inhibir reacciones posteriores. 13. Agregar 225 µl de cloroformo. 14. Agitar vigorosamente durante 30 s utilizando un vortex. 15. Centrifugar a 19000 g durante 5 min. 16. Recuperar la fase acuosa (fase superior, aprox. 200 µl) y colocarla en otro tubo de 1.5 ml, teniendo las mismas precauciones que en el paso 12. 17. Agregar 20 µl de Acetato de Sodio (3M) a la fase acuosa. 18. Agitar en vortex 20 s. 19. Agregar 440 µl de etanol Absoluto frío a la fase acuosa. 20. Centrifugar a 19000 g durante 30 min. Es importante colocar los tubos un la misma orientación siempre, para saber en qué lado del tubo está el ADN precipitado. Mientras se está llevando a cabo la centrifugación, se debe hacer el gel de agarosa. 21. Decantar el sobrenadante a un tubo nuevo y mantenerlo en hielo durante el resto del experimento. 22. Agregar 500 µl de etanol al 70% al tubo que ha sido vaciado, evitando resuspender la pastilla. 23. Centrifugar a 19000 g durante 5 min. 24. Decantar el sobrenadante a un tubo nuevo y mantenerlo en hielo durante el resto del experimento. 25. Colocar el tubo que ha sido vaciado encima de una servilleta de papel y boca abajo, hasta que todo el etanol haya sido evaporado. 26. Resuspender el ADN en 50 µl de TE ph 7.8 o agua desionizada. Guardar a -20 C. Extracción de ADN de Suelo 1. Pesar 0.1 mg de suelo en un tubo de polipropileno de 1.5 ml. 2. Agregar 250 µl de agua desionizada estéril. 3. Agitar vigorosamente utilizando un vortex hasta lograr la resuspensión de las células (aproximadamente 30 s). 4. Agregar 250 µl de fenol (equilibrado con Tris 1M ph 8.0). 5. Agitar vigorosamente durante 30 s utilizando un vortex. 6. Agregar 250 µl de cloroformo. 7. Agitar vigorosamente utilizando un vortex durante 30 s. 8. Centrifugar a 19000 G durante 5 min. 9. Recuperar la fase acuosa (fase superior, aprox. 225 µl) y colocarla en otro tubo de 1.5 ml. En muchas ocasiones en la interfase se presenta un precipitado blanco, este precipitado no debe de ser recuperado, ya que son proteínas que pueden contaminar la muestra e inhibir reacciones posteriores. 10. Agregar 225 µl de cloroformo. 11. Agitar vigorosamente durante 30 s utilizando un vortex. 12. Centrifugar a 19000 G durante 5 min. 13. Recuperar la fase acuosa (fase superior, aprox. 200 µl) y colocarla en otro tubo de 1.5 15
ml, teniendo las mismas precauciones que en el paso 12. 14. Agregar 20 µl de Acetato de Sodio (3M) a la fase acuosa. 15. Agitar en vortex 20 s. 16. Agregar 440 µl de etanol Absoluto frío a la fase acuosa. 17. Centrifugar a 19000 g durante 30 min. Es importante colocar los tubos un la misma orientación siempre, para saber en qué lado del tubo está el ADN precipitado. Mientras se está llevando a cabo la centrifugación, se debe hacer el gel de agarosa. 18. Decantar el sobrenadante a un tubo nuevo y mantenerlo en hielo durante el resto del experimento. 19. Agregar 500 µl de etanol al 70% al tubo que ha sido vaciado. 20. Centrifugar a 19000 g durante 5 min. 21. Decantar el sobrenadante a un tubo nuevo y mantenerlo en hielo durante el resto del experimento. 22. Colocar el tubo que ha sido vaciado encima de una servilleta de papel y boca abajo, hasta que todo el etanol haya sido evaporado. 23. Resuspender el ADN en 50 µl de TE ph 7.8 o agua desionizada. Guardar -20 C DEPENDIENDO DEL AVANCE CONTINUAR 24. Realizar una electroforesis en gel de agarosa para visualizar el ADN (práctica 4). 25. Cuantificar el ADN utilizando un espectrofotómetro a una longitud de onda de 260 nm. 26. Cuantificar el ADN utilizando un espectrofotómetro a una longitud de onda de 260 nm. 27. Realizar una electroforesis en gel de agarosa para visualizar el ADN (práctica 4). REFERENCIAS Sambrook, J. y Russell, D. W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3ª ed. Ed Cold Spring Harbor Laboratories. Nueva York. USA 2001. 2344 págs. 16
INTRODUCCIÓN PRÁCTICA 4. Cuantificación de ADN en gel de agarosa Una vez que se ha realizado la extracción de ADN es necesario revisar la integridad y la cantidad del mismo, esto se efectúa mediante la separación por electroforesis en geles de agarosa o de poliacrilamida. La agarosa es más comúnmente utilizada puesto que no es tóxica. A los valores de ph en los cuales usualmente se trabaja con ácidos nucleicos, los grupos fosfato confieren carga neta negativa a estas moléculas. En la electroforesis en geles de agarosa, las moléculas de ADN lineales migran según su tamaño y se pueden visualizar mediante tinción. Los geles son teñidos con diferentes colorantes para visualizar el ADN. Los más comunes son: el bromuro de etidio, el nitrato de plata, y recientemente el SYBER SAFE, Gel Red, Syber Green, Syber Gold, etc. Los geles de agarosa se preparan fundiendo agarosa en presencia del buffer adecuado hasta que se logre una solución transparente. La solución fundida es puesta en un molde donde gelifica. El gel forma una matriz cuya densidad está determinada por la concentración de agarosa. Cuando se aplica un campo eléctrico a través del gel, el ADN migra hacia el ánodo. La velocidad de migración está determinada por varios parámetros, algunos de los cuales son detallados a continuación. (a) Tamaño del ADN: Las moléculas de ADN lineal de doble hebra migran a través del gel a velocidades que son inversamente proporcionales al log del número de pares de bases. Dado que la carga del ADN está dada por los grupos fosfato y que por cada par de bases hay dos grupos fosfato, la relación carga/masa es la misma para moléculas de ADN de diferente tamaño. Pero, debido a la fricción que impone la malla del gel de agarosa, las moléculas de mayor tamaño serán retardadas respecto a las de menor tamaño. (b) Concentración de la agarosa: Un fragmento de ADN lineal migra a diferentes velocidades dentro de geles con diferentes concentraciones de agarosa. La tabla siguiente muestra concentraciones de agarosa usadas para resolver fragmentos de ADN en los intervalos indicados. Concentración del gel de agarosa (% w/v) Intervalo de peso molecular (kpb) 0.3 5-60 0.6 1-20 0.7 0.8-10 0.9 0.5-7 1.2 0.4-6 1.5 0.2-3 2.0 0.1-2 17
(c) Conformación del ADN El ADN circular cerrado de doble hebra superenrollado (forma I), el circular relajado con un corte en una de las hebras (forma II) y la forma lineal (forma III) que tengan idéntico peso molecular y misma secuencia van a migrar a distinta velocidad en los geles de agarosa. Las movilidades relativas de las tres formas dependen primariamente de la concentración de agarosa, pero también están influidas por otros factores como la corriente eléctrica aplicada, la fuerza iónica del buffer y de la cantidad del colorante presente (fundamentalmente en el caso de la forma I). (d) Corriente aplicada A bajo voltaje, la velocidad de migración de los fragmentos lineales es proporcional al voltaje aplicado. Sin embargo a medida que la fuerza del campo eléctrico aumenta, la movilidad de los fragmentos de ADN de alto peso molecular se incrementa menos. Por lo tanto el intervalo efectivo de separación en los geles de agarosa disminuye a medida que el voltaje es incrementado. (e) Otros factores Otros factores que influyen (y que no se discutirán en esta INTRODUCCIÓN) son: la dirección del campo eléctrico, la composición de bases de los fragmentos a analizar, la temperatura y la composición del buffer de electroforesis. OBJETIVOS Objetivo General Determinar la cantidad de ADN por densitometría de las bandas en un gel de agarosa Objetivos específicos Adquirir destreza en el corrimiento de muestras de ADN en geles de agarosa Cuantificar el ADN en geles de agarosa por densitometría MATERIALES Materiales y Reactivos Solución de Agarosa 0.5% w/v Solución para teñir ADN Regulador para electroforesis TBE 1X 18
Regulador de carga 6x 1 juego de micropipetas P1000, P200 y P10 por equipo Agua desionizada Puntas de diferentes capacidades (10, 200 y 1000 µl) Muestras de ADN Cámara de Electroforesis Fuente de Poder Marcador de Peso Molecular (100pb) METODOLOGÍA EXPERIMENTAL 1. Colocar 20 ml de TBE en un vaso de precipitado de 100 ml (para un volumen de gel de 20 ml, si es mayor hacer los cálculos conservando la proporción de la concentración del gel) 2. Agregar 100 mg de agarosa 3. Calentar en parrilla de calentamiento hasta fundir completamente 4. Adicionar 0.5µL de reactivo para teñir ADN (Rojo Texas, Syber green, etc.) 5. Mezclar 6. Verter la solución en una canastilla para electroforesis 7. Colocar el formador de pozos (peine) en la canastilla 8. Dejar gelificar (cubrir el gel con papel aluminio) 9. Colocar la canastilla adentro de la cámara de electroforesis 10. Agregar buffer de corrimiento (TBE) 11. Preparar las muestras a analizar (con buffer de carga, no más de 10 µl en total) 12. Colocar las muestras adentro de los pozos 13. Llevar a cabo la electroforesis a 100 V durante 30 a 45 min 14. Visualizar el gel en el transiluminador y cuantificar según instrucciones. REFERENCIAS Sambrook, J. y Russell, D. W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3ª ed. Ed Cold Spring Harbor Laboratories. Nueva York. USA 2001. 2344 págs. COMPOSICIÓN DE SOLUCIONES 6x Amortiguador de carga Azul de bomofenol 0.25% (w/v) Glicerina en agua 30% (v/v) TBE Prepare una solución madre 5x en 1 litro de H2O Tris base 54 g, Ácido Bórico 27.5 g, EDTA 0.5 M (ph 8.0) 20 ml 19
PRÁCTICA 5. Extracción de ARN En una técnica sencilla de extracción de ARN, las células son homogenizadas en tiocianato de guanidina y posteriormente purificado por fenol-cloroformo a ph reducido. El rendimiento del ARN total extraído depende del tipo de muestra y generalmente esta en un intervalo de 4-7 µg/ml iniciando de 5-10 mg de tejido o 10 6 células. OBJETIVOS Objetivo General Extraer ARN de diferentes muestras por métodos físico-químicos Objetivos específicos Conocer la metodología básica para extracción de ARN, Adquirir destreza en la manipulación de diversas muestras biológicas para la extracción de ARN. Determinar la integridad del ARN por electroforesis en gel de Agarosa MATERIALES Cloroformo: alcohol isoamílico (49:1, v/v) Etanol Isopropanol Nitrógeno liquido Fenol Acetato de sodio (2 M, ph 4.0) Solución D (solución desnaturalizante) Agua desionizada 1 juego de micropipetas P1000, P200 y P10 por equipo Gradillas Termobloques Tubos de polipropileno 1.5 ml Centrifuga Vortex Material biológico Una alícuota de 3 ml de un cultivo líquido de E. coli incubado por 14-16 h a 37 C con agitación constante de >200 rpm. Una planta de tabaco o de lechuga fresca. 20