Tema : Genómica Griffiths AJ et al., (2000) Klug WS y Cummings MR (999) Links to Animal Genomic Research web site and Database Resources http://www.genome.iastate.edu/resources/other.html Objetivos: Identificar la utilidad del análisis de los marcadores de DNA para la construcción de mapas, la identificación individual y el aislamiento de genes de interés Conocer las metodologías que se han utilizado para la construcción de mapas Establecer la relación entre genómica y la nueva producción y sanidad animal
Qué es un polimorfismo? cuáles conoces? para qué puede servir el análisis de estos polimorfismos? para qué nos sirven? cómo se han construido los mapas del genoma? Contenidos Introducción Polimorfismos del DNA: tipos, metodología de estudio y aplicaciones Cartografía de los genomas, nuevas herramientas Identificación de un gen Estrategias para el conocimiento del genoma: ejemplo del genoma humano Mapas genómicos de especies domésticas Genómica funcional 2
Genómica Caracterización molecular de genomas completos ESTRUCTURAL: Caracterización de la naturaleza física de genomas completos FUNCIONAL: Caracterización del proteoma y de los patrones globales de expresión génica Genómica estructural Caracterización de la naturaleza física de genomas: - Polimorfismos del DNA - Cartografía Clasificación del DNA eucariota DNA eucariótico Genes funcionales de copia única Secuencias funcionales DNA de secuencia repetida Secuencias sin función conocida DNA separador Secuencias funcionales Repeticiones i heterocromatina ti No codificantes Del centrómero Familias de genes codificantes (y pseudogenes asociados) Familias de genes dispersos Familias de genes en tándem VNTR Secuencias derivadas De transposiciones Transposones Retrotransposones
Contenidos Introducción Polimorfismos del DNA: tipos, metodología de estudio y aplicaciones Cartografía de los genomas, nuevas herramientas Identificación de un gen Estrategias para el conocimiento del genoma: ejemplo del genoma humano Mapas genómicos de especies domésticas Genómica funcional Polimorfismo genético Existencia de distintos alelos: Existencia de distintos alelos: Polimorfismo bioquímico: Detección de variación al nivel del producto del gen: proteínas, enzimas Polimorfismos del DNA: Variaciones presentes en la secuencia de bases Polimorfismos producidos por mutaciones puntuales Polimorfismos del número de repeticiones en tándem
Polimorfismos debidos a mutaciones puntuales Variación de un nucleótido en una posición determinada. Frecuencia:/000pb También conocidos como SNP (Single Nucleotide Polymorphisms). Cambios de bases: a. Transiciones: i. Purina Purina: ii. Pirimidina Pirimidina: b. Transversiones i. Purina Pirimidina: ii. Pirimidina Purina Alelo Alelo 2 TACGAGCTA TACGGGCTA A G Purinas T C Pirimidinas SNP: Single Nucleotide Polymorphisms: Polimorfismo muy frecuente (/00 pb) 0 a 0 millones de SNP en el genoma humano Dos posibles alternativas en cada individuo Herencia es muy estable (baja tasa de mutación 0-6 vs 0 - de los microsatélites) Fácil estandarización Aplicaciones en la determinación de enfermedades y en farmacogenética 5
RFLPs-SNP Origen: mutaciones puntuales Variabilidad: 2 alelos Localización: exones, intrones, regiones reguladoras, DNA espaciador RFLPs Detección mediante enzimas de restricción: Southern Blot PCR+RFLP Normalmente determinados en exones Detección de los SNP: RFLP: Southern Blot PCR + RFLP Secuenciación Minisecuenciación Sondas específicas SSCPs PCR en tiempo real Detección de mutaciones puntuales RFLP: Alelo Alelo 2 Aat II TGGACGTCT TGGATGTCT Alelo Alelo 2 Sonda MCL 6
Detección de mutaciones puntuales Minisequencing 7
Polimorfismos debidos a variaciones en el número de repeticiones de DNA en tándem VNTR Tamaño Unidad (Kb) repetición ió Método detección Satélites 00-500 20 kb Centrifugación ClCs Elec. campos pulsados Minisatélites 0,-20 20-0 pb Elec. Agarosa Southern Microsatélites pb -pb Elec. Acrilamida Secuenciación Polimorfismos debidos a variaciones en el número de repeticiones de DNA en tándem DNA satélite: repeticiones de formaciones muy grandes (00 kb y algunas Mb) DNA no transcrito Regiones de heterocromatina, principalmente en centrómeros (DNA alfoide) DNA minisatélite Repeticiones de tamaño moderado (60pb) Distribuidas por todo el genoma, principalmente en telómeros Normalmente no se transcriben Tipos: DNA minisatélite hipervariable DNA telomérico 8
DNA minisatélite hipervariable Localización dispersa en todos los cromosomas, entre 0,-20 kb de longitud, de repeticiones en tándem cortas Secuencia repetida común (core): GGGCAGGAXG Son muy polimórficas Se encuentran en intrones Estas secuencias se han empleado como huellas dactilares 9
0 5 7 9 0 8 6 INDIVIDUO 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 0 INDIVIDUO 0 6 8 INDIVIDUO 2 7 5 5 9 INDIVIDUO 6 8 5 7 9 5 7 6 5 7 6 8 5 7 6 8 5 6 6 5 7 5 7 9 5 0 6 8 Fingerprints
Polimorfismos debidos a variaciones en el número de repeticiones de DNA en tándem DNA microsatélite (STR): Short Tandem Repeat Pequeñas formaciones (generalmente < 50pb) de repeticiones en tándem de secuencias muy simples (de a nucleótidos) Repartidas por todo el genoma, normalmente en intrones. Frecuentes y altamente polimóficos (número medio de alelos 0) Herencia mendeliana codominante Alelo CA CA CA CA CA CA Alelo 2 CA CA CA CA CA CA CA CA CA CA Visualización de los microsatélites Genotipado: Secuenciación: ió ACGT
Implicaciones de las secuencias microsatélites en patologías: Expansión de microsatélites de trinucleótidos: Síndrome de X frágil (FMR-) (CCG)n Distrofia miotónica (DM) (CTG)n Enfermedad de Huntington (HD) (CAG)n Ataxia de Friedreich (FA) Nueve formas de ataxia espinocerebelar (SCA) Expansión de tetranucleótidos: DM2 Expansión de pentanucleótidos: SCA0 Enfermedades humanas se han creado animales modelo 2
Secuencias de DNA dispersas DNA basura? - Regulación de la expresión? - Mecanismo de reparación? - Puntos de recombinación? Aplicaciones de los polimorfismos del DNA: Diagnóstico genético Ligamiento con fenotipos Identificación individual Construcción de los mapas génicos
Técnicas básicas: Extracción del DNA genómico Electroforesis Hibridación (Southern, Northern) Restriction Fragment Lenght Polymorphism Reacción en Cadena de la Polimerasa Secuenciación (método de Sanger) Clonación Diagnóstico genético directo: Mutaciones puntuales RFLPs, Secuenciación, chips Inserciones, deleciones PCR, Southern Repeticiones en tándem PCR, secuenciación Transcripción diferencial RT-PCR, Northern, chips Procesamiento alternativo del RNA RT-PCR, North. Metilación MPCR
Diagnóstico genético indirecto: Análisis de marcadores genéticos X Gen alterado Marcador polimórfico Mutación puntual Microsatélite RFLP Deleción Inserción Genotipo del marcador Genotipo del gen dañado Identificación individual: Marcadores fenotípicos (HLA, Gr. Sanguíneos) Análisis de marcadores microsatélites PCR, secuenciación Fingerprinting (minisat.) Microsatélites Minisatélites Control de filiación Control de libros genalógicos Detección mediante RFLP + Southern 5
Contenidos Introducción Polimorfismos del DNA: tipos, metodología de estudio y aplicaciones Cartografía de los genomas, nuevas herramientas Identificación de un gen Estrategias para el conocimiento del genoma: ejemplo del genoma humano Mapas genómicos de especies domésticas Genómica funcional Mapas del genoma: Mapa genético Posiciones relativas de los genes entre si, sin anclaje físico Distancia entre marcadores determinada por la frecuencia de recombinación en la meiosis Mapa físico Posición exacta de un gen Distancia entre marcadores determinada por nº de pb 6
Mapas genéticos Requerimientos Existencia de polimorfismo en los genes a mapear Análisis de familias informativas (AaBb x AABB) Estudios de ligamiento : -Herencia ligada al cromosoma X -Marcadores polimóficos asignados a paneles de familias -Alozimas - Polimorfismos del ADN (microsatélites, RFLPs) - Caza de genes relacionados con enfermedades o caracteres productivos: - Fibrosis Quística (9 años) humano Mapas físicos Resolución Cromosoma (paneles de células híbridas somáticas) Banda cromosómica (FISH) Células híbridas irradiadas Secuencia nucleotídica 7
Contenidos Introducción Polimorfismos del DNA: tipos, metodología de estudio y aplicaciones Cartografía de los genomas, nuevas herramientas Identificación de un gen Estrategias para el conocimiento del genoma: ejemplo del genoma humano Mapas genómicos de especies domésticas Genómica funcional Estrategias para la identificación de un gen Identificación del fenotipo Clonado posicional Clonado funcional Gen candidato Mapa Función Gen Gen Gen Mapa Mutaciones Mutaciones Mutaciones Función Mapa Función 8
Identificación de un gen Identificación clásica Estudios en familias (modo de herencia) Análisis de ligamiento o mapa físico (identificación de la región cromosómica) Genómica Estudios de expresión gen mutaciones Acotar la zona cromosómica (clonaje en YAC) Análisis de los clones (contigs, búsqueda de marcadores, ORF, mutaciones) gen Estudios de expresión Gen de doble musculatura Azul Belga Piamontesa Limusina Charolés Asturiana de los Valles Crecimiento anormal del tejido muscular debido a una hipertrofia (=hiperplasia) i 20% más de rendimiento de carne Aumento de cortes con gran valor económico Carne magra Muy buena conversión alimentaria Dificultades en el parto 995: Carácter controlado por un gen mayor mh 9
Gen de doble musculatura mh? Identidad? MYOS -/- Miostatina Gen candidato MYOS 2q Localización cromosómica Azul Belga x Frisona Rastreo del genoma con microsatélites Región BTA2 próxima centrómero Mutaciones con efecto fenotipo: Doble musculatura Descripción Tipo de mutación Raza inserción/deleción en la posición 8 transición C T en la posición 60 transversión G T en la posición 676 Deleción de pb desde la posición 82 hasta la 8 Corrimiento en el marco de lectura Sin sentido - terminación prematura de la proteína Sin sentido - terminación prematura de la proteína Corrimiento en el marco de lectura - terminación prematura de la proteína Belgian blue, Asturianas, Rubia Gallega, Aubrac Charoláis Maine-Anjou, Parthenais Belgian blue, Limousine, South Devon, Asturiana de los Valles Transversión transición G A en la Piemontese, consentido. Cys posición 98 Gascon Tyr en la proteina Mutaciones sin efecto fenotipo: Normales transversión C A en la posición 282 transición C T en la posición Mutación consentido. Phe Leu en la proteina Transición silente sin cambio en la proteína Limousine, Aubrac, Devon, Pirenaica Ampliamente distribuida Herencia autosómica recesiva Tipificación de animales: Diagnóstico indirecto: - microsatélites Diagnóstico directo: - mutaciones MYOS 20
Ligamiento vs asociación Ligamiento: Identificación de regiones del genoma con un nº de alelos compartidos en individuos afectados > al esperado (en familias) Análisis de 500 pols Regiones candidatas y acotamiento de la región Alelos raros de alto riesgo Asociación: Análisis de individuos afectados no emparentados e identificación de alelos compartidos Facilidad para la obtención de muestras Necesidad de analizar miles de marcadores Alelos de acción modesta en enfermedades comunes Contenidos Introducción Polimorfismos del DNA: tipos, metodología de estudio y aplicaciones Cartografía de los genomas, nuevas herramientas Identificación de un gen Estrategias para el conocimiento del genoma: ejemplo del genoma humano Mapas genómicos de especies domésticas Genómica funcional 2
Mapa genómico: Representación lineal de los sitios genómicos importantes (genes y marcadores) 990: Proyecto Genoma Humano (National Institute of Health and the Department of Energy, USA) Mapear y secuenciar el genoma humano. Construcción del mapa físico y genético 2. Determinar la secuencia de 000 millones de caracteres del DNA humano con un 99.9% 9% de fiabilidad. Determinar y localizar las variaciones del DNA entre individuos (polimorfismos). Localizar todos los genes humanos 5. Establecer las funciones de estos genes y otras partes del genoma Mapear y secuenciar los genomas de animales modelo: E. coli (,6 millones pb) S. cerevisiae (2 millones pb) C. elegans (97 millones pb) D. melanogaster (65 millones pb) M. musculus (000 millones) Otros Recolectar y distribuir datos: Publicar en 2 h toda secuencia >2000pb Crear bases de datos Desarrollar programas de análisis de DNA Desarrollar herramientas para comparar e interpretar la información genómica Compartir la información públicamente Estudiar los aspectos éticos, legales y sociales de la investigación en genética Entrenamiento de investigadores Desarrollo de tecnologías 22
200: Genoma completado - Desarrollar el catálogo definitivo de genes codificantes de proteínas -Utilizar la genómica comparativa para alinear el genoma humano con el de otras especies para la identificación de genes -Encontrar los elementos funcionales que controlan el tiempo y nivel de expresión de genes y micro-rnas -Secuenciar el restante 20% de heterocromatina (problemas de repeticiones) The end of the begining 2
Contenidos Introducción Polimorfismos del DNA: tipos, metodología de estudio y aplicaciones Cartografía de los genomas, nuevas herramientas Identificación de un gen Estrategias para el conocimiento del genoma: ejemplo del genoma humano Mapas genómicos de especies domésticas Genómica funcional 2
Mapas genómicos en especies domésticas. Mapas de ligamiento, ricos en marcadores de DNA 2. Mapas físicos, ricos en genes conservados (permiten el mapeo comparativo). Unión de ambos mapas. Mapas de EST (Expressed Sequence Tag) 5. Mapas de alta resolución en cromosomas específicos 6. Identificación de genes candidatos y regiones con QTLs Mapas genómicos en especies domésticas Australian Sheep Gene mapping Web site http://rubens.its.unimelb.edu.au/~jillm/jill.htm BovMap database http://locus.jouy.inra.fr/cgi-bin/bovmap/intro2.pl Pig base http://www.thearkdb.org/browser?species=pigthearkdb pig Dogmap http://www.dogmap.ch/ 25
Contenidos Introducción Polimorfismos del DNA: tipos, metodología de estudio y aplicaciones Cartografía de los genomas, nuevas herramientas Identificación de un gen Estrategias para el conocimiento del genoma: ejemplo del genoma humano Mapas genómicos de especies domésticas Genómica funcional Genómica funcional Los datos de la secuenciación a gran escala son el punto de partida de la genómica funcional Búsqueda de ORF en secuencias de DNA desconocidas Identificación de su función Empleo de chips (microarrays) de DNA para estudio de regulación génica 26
Chips de DNA Muestras de DNA ordenadas, unidas a un chip de cristal del tamaño de un cubreobjetos En un chip puede haber miles de muestras (cdna de genes conocidos) Los chips se exponen a muestras de mrna marcados procedentes de distintos tejidos (distinta fase de desarrollo, tumoral vs normal, etc.) Se miden variaciones en la expresión de los tejidos Aplicaciones de la Genómica Conocimiento y comprensión de procesos patológicos Precisión de diagnóstico: Clasificación más fina (cáncer de colon, piel) Farmacogenómica respuesta individual a tratamientos, elección de quimioterapia Evaluación correcta del riesgo genético: Predicción ió de la agresividad id d tumoral Prevención conocido el riesgo genético Comenzar planes de vigilancia en riesgo de cáncer, hipercolesterolemia, hemocromatosis,.. 27
Implicaciones del conocimiento del genoma Análisis de recién nacidos Detección de portadores Desarrollo de terapias: Terapia génica: reemplazar un gen alterado por el gen funcional Terapia basada en la genética: Diseño de nuevas drogas Tratamientos basados en las bases moleculares Elección del tratamiento Identificación de genes con interés en producción. Videos de genómica Microarray: http://www.youtube.com/watch?v=vnsthmnjkhm http://www.youtube.com/watch?v=epfe7yg7lvm& feature=related http://www.youtube.com/watch?v=ahntt6- Jgcg&feature=related Qué falta aquí? http://www.youtube.com/watch?v=6ifdphwxjw&feature=related 28