RepublicofEcuador EDICTOFGOVERNMENT± Inordertopromotepubliceducationandpublicsafety,equaljusticeforal, abeterinformedcitizenry,theruleoflaw,worldtradeandworldpeace, thislegaldocumentisherebymadeavailableonanoncommercialbasis,asit istherightofalhumanstoknowandspeakthelawsthatgovernthem. NTE INEN 0732 (1985) (Spanish): Leche y productos lácteos. Determinación del calciferol (vitamina D)
CDU: 637 AL 03.01-327 Norma Técnica Ecuatoriana LECHE Y PRODUCTOS LACTEOS. DETERMINACIÓN DEL CALCIFEROL (Vitamina D). INEN 732 Instituto Ecuatoriano de Normalización, INEN Casilla 17-01-3999 Baquerizo Moreno E8-29 y Almagro Quito-Ecuador Prohibida la reproducción 1. OBJETO 1.1 Esta norma establece el método para determinar el contenido de calciferol o vitamina D. 2. ALCANCE 2.1 En esta norma se describen el método de Shear, que servirá de orientación y un método espectrofotométrico de determinación específica. 3. TERMINOLOGIA 3.1 Calciferol o vitamina D. Substancia orgánica que existe en los alimentos y que su falta causa empobrecimiento del calcio y, como consecuencia, deformaciones de los huesos. 3.2 Otros términos relacionados con esta norma están definidos en la Norma INEN 3. 4. DISPOSICIONES GENERALES 4.1 Las pipetas aforadas y todo el instrumental usado deberán estar debidamente esterilizados e inspeccionados. 5. METODO DE SHEAR 5.1 Instrumental. 5.1.1 Calentador eléctrico. 5.1.2 Tubos de ensayo. 5.1.3 Baño de agua. 5.2 Reactivos. 5.2.1 Anilina roja (reactivo para análisis). -1-
NTE INEN 732 5.2.2 Acido clorhídrico concentrado (reactivo para análisis ). 5.2.3 Solución de ensayo. Mezclar 15 cm 3 de anilina con 1 cm 3 de ácido clorhídrico. 6. PREPARACION DE LA MUESTRA 6.1 Mezclar completamente la leche y/o producto lácteo, sacudiendo el recipiente que lo contiene por varias veces, hasta que la muestra esté homogénea. 6.2 Preparar la muestra para ensayo diluyendo con agua destilada en proporción que se estime conveniente. Si se forma grumos de crema y éstos no se dispersan, calentar la muestra en baño de agua hasta 35-40 C. Mezclar cuidadosamente e incorporar cualquier partícula de crema adherida al recipiente y enfriar rápidamente a 18-20 C. 6.3 No deben quedar partículas blancas o grumos adheridos a las paredes del recipiente. 7. PROCEDIMIENTO 7.1 La determinación debe realizarse por duplicado sobre la misma muestra preparada. 7.2 Colocar en el tubo de ensayo 3 cm 3 de la solución 5.2.3 y 3 cm 3 de la solución objeto del ensayo. 7.3 Calentar a ebullición durante un minuto. 7.4 Si a los pocos segundos el líquido toma un color verde que pasa luego al rojo estable, hará presumir existencia de calciferol ( vitamina D ). 8. METODO ESPECTROFOTOMETRICO 8.1 Resumen. 8.1.1 Extracción de la muestra con cloroformo y determinar el contenido de calciferol ( vitamina D ), por lectura en el espectrofotómetro a una longitud de onda de 500 nm y de 550 nm. 8.2 Instrumental. 8.2.1 Balanza analítica, sensible al 0,1 mg -2-
NTE INEN 732 8.2.2 Espectrofotómetro con un rayo visible entre 500 nm y 550 nm, equipado con células ópticas de 10 mm. 8.2.3 Erlenmeyer de 250 cm 3. 8.2.4 Condensador de reflujo. 8.2.5 Pipetas volumétricas de 1 cm 3 y 5 cm 3 : 8.2.6 Frasco volumétrico de 25 cm 3. 8.2.7 Frasco volumétrico de 250 cm 3. 8.2.8 Ampolla de separación de 125 cm 3. 8.2.9 Frasco volumétrico de 100 cm 3. 8.3 Reactivos. 8.3.1 Cloroformo, libre de alcohol. Lavado con agua y secado sobre sulfato de sodio anhidro. 8.3.2 Etanol, al 95 % ( v/v) (reactivo para análisis ). 8.3.3 Glicerina (reactivo para análisis ). 8.3.4 Eter de petróleo, rango de ebullición entre 40 0-60 0 C. 8.3.5 Solución al 50 % de hidróxido de potasio. 8.3.6 Solución de tricloruro de antimonio. Disolver 20g de cristales secos de tricloruro de antimonio, en 20 cm 3 de cloroformo, calentar cuidadosamente. Enfriar, añadir 2-3 cm 3 de cloruro de acetil, filtrar dentro de un frasco volumétrico de 100 cm 3, hacer a la marca con cloroformo y mezclar cautelosamente. Dejar en reposo 30 minutos antes de usar. Guardar en lugar protegido de la luz y humedad. 8.3.7 Calciferol o vitamina D estándar (reactivo para análisis). 8.3.7.1 Solución estándar de calciferol (vitamina D). Pesar con aproximación al 0,1 mg, 2,5 mg dei reactivo 8.3.7 y transferir a un frasco volumétrico de 100 cm 3, disolver en una pequeña cantidad de cloroformo y una vez disuelta llevar a la marca; esta solución contiene 25 ug de calciferol ( vitamina D ), por cm 3. -3-
NTE INEN 732 8.3.8 Nitrógeno, libre de oxígeno (reactivo para análisis). 9. PREPARACION DE LA MUESTRA 9.1 Mezclar completamente el producto lácteo, sacudiendo el recipiente que lo contiene varias veces, hasta que la muestra esté homogénea. 9.2 Si se forma grumos de crema y éstos no se dispersan, calentar la muestra en baño de agua, a 35 ó 40 C ; mezclar cuidadosamente e incorporar cualquier partícula de crema adherida al recipiente y enfriar rápidamente entre 18-20 C. 9.3 No deben quedar partículas blancas o grumos adheridos a las paredes del recipiente. 10. PROCEDIMIENTO 10.1 La determinación debe realizarse por duplicado sobre la misma muestra preparada. 10.2 Pesar con aproximación al 0,1 mg, dos gramos de muestra y transferir a un Erlenmeyer de 250 cm 3. 10.3 Agregar 50 cm 3 de etanol, 14 cm 3 de glicerina y 20 cm 3 de la solución de hidróxido de potasio. Colocar en el condensador de reflujo y calentar a ebullición durante 30 minutos, agitando ocasionalmente. 10.4 Añadir 110 cm 3 de agua, dejar en reposo por 10 minutos, agitando ocasionalmente. Enfriar y filtrar en un frasco volumétrico de 250 cm 3. Lavar el Erlenmeyer y el filtro con etanol, hacer a la marca con el mismo solvente y mezclar. 10.5 Tomar una alícuota de 5 cm 3 y colocarlo en una ampolla de separación de 125 cm 3 y extraer con cinco volúmenes sucesivos del éter de petróleo, usando en cada extracción 5 cm 3 del reactivo. 10.6 Recibir los excedentes en un frasco volumétrico de 25 cm 3 y llevar a volumen con éter de petróleo. 10.7 Tomar por duplicado una alícuota de 5 cm 3 y evaporar a sequedad en corriente de nitrógeno. Disolver el residuo en 1 cm 3 de cloroformo. 10.8 Agregar 9 cm 3 de la solución de tricloruro de antimonio, mezclar rápidamente y transferir a la célula óptica de 10 mm. Después de 1,5 a 2 minutos que haya sido agregada la solución de tricloruro de antimonio, medir la absorvancia en una longitud de onda de 500 nm y 550 nm en el espectrofotómetro. 10.9 Repetir el mismo procedimiento por duplicado, usando 1 cm 3 de la solución estándar de calciferol o vitamina " D " en lugar de la muestra, y usar el mismo procedimiento que para la muestra. -4-
NTE INEN 732 10.10 Debe realizarse un ensayo en blanco, usando cloroformo, el mismo material, reactivos, cantidades y el mismo procedimiento, en igual forma que para la muestra. 11. CALCULOS 11.1 Restar la lectura de la absorción a 550 nm de la obtenida a 500 nm. Tomar el promedio de las dos lecturas en la solución de la muestra y ésta, correspondería a A.1. Tomar el promedio de las dos lecturas en la solución estándar de calciferol y ésta correspondería a A.2. 12 ERRORES DE METODO 12.1 La diferencia entre los dos resultados de una determinación efectuada por duplicado no debe exceder de 0,0001% en caso contrario, debe repetirse la determinación. 13 INFORME DE RESULTADOS 13.1 Como resultado final debe reportarse la media aritmética de los dos resultados de la determinación. 13.2 En el informe de resultados debe indicarse el método usado, el resultado obtenido. Debe mencionarse además cualquier condición no especificada en esta norma o considerada como opcional, así como cualquier circunstancia que pueda haber influido sobre el resultado y debe incluirse los detalles necesarios para la identificación de la muestra. -5-
NTE INEN 732 APENDICE Z Z.1 DOCUMENTOS NORMATIVOS A CONSULTAR INEN 3 Leche y Productos Lácteos. Terminología Z.2 BASES DE ESTUDIO Millipore AB 321. Calciferol. Cat No. AB 321. Millipore Corporation, Bedford, Massachusetts. 01730. Ma, 1980. Norma Sud-africana SABS Method 357. First Revision. Calciferol ( vitamina D ). Content of the tablets. Council of the South African Bureau of Standards, 1977. Emilio Salazar H. Guía práctica de análisis para el reconocimiento de substancias alimenticias con apuntes sobre alimentación y nutrición, su metabolismo y valor nutritivo. pp. 524. Editorial Dossat. España, 1947-6-
INFORMACIÓN COMPLEMENTARIA Fecha de iniciación: Fecha de aprobación: