Trabajo Práctico de Biología Celular

Objetivo General: Reconocimiento de estructuras subcelulares mediante transfección de proteínas fluorescentes e inmunocitoquímica

Transfección: proceso por el cual un gen de interés es introducido dentro de la célula eucariota por métodos químicos ó físicos. Inmunocitoquímica: se emplean anticuerpos para detectar y localizar antígenos específicos en células ó tejidos (Inmunohistoquímica).

GFP-PTP 1B DA VINCULINA

Manipulación de células en cultivo: 1) MEDIO DE CULTIVO Requerimientos MEDIO DE CULTIVO SUERO ANTIBIOTICO SUPLEMENTO BUFFER Nutrientes Aporte Estimulo proliferativo y adhesivo Prevención de contaminaciones, selección Estimulo especifico Mantiene el PH Composición *glucosa (fuente de C) *aminoácidos (fuente de N) *cofactores enzimáticos *vitaminas *sales *Transferrina *Albumina, *Factores de crec. *Factores de anclaje *penicilina *estreptomicina *gentamicina *hormonas *Factores de crec. *Bicarbonato *Indicador: Rojo Fenol

2) FACTORES FISICOQUIMICOS PH: 7.2-7.5 OSMOLARIDAD : 280-320mOsmol/kG CO 2 : 2-5 % TEMPERATURA: 35-37 ºC 3) ESTERILIDAD 1) Manipulación de células en flujo laminar 2) Exposición de luz UV dentro del gabinete del flujo por 15 antes de empezar a trabajar 3) Todo el material usado debe estar estéril * por autoclavado (120 C, 1 atm, 20 ) en el caso de tips, frascos, eppendorfs, pipetas, etc. * por filtración (poro de 0,2µM) en el caso de medio (antes del agregado de SFB y antibióticos), buffers, agua, etc. 4) Todo los elementos que ingresan al flujo laminar deben ser lavados con etanol 70%

- Fijación Inmunocitoquímica - Permeabilización - Bloqueo - Tinción con anticuerpos - Inmunocitoquímica directa - Indirecta

Fijación Preserva la morfología celular y la localización y estructura de los antigenos. Glutaraldheído Paraformaldheído Metanol/Acetona Modo de acción Por puentes entre grupos aminos de las proteínas Por puentes entre grupos aminos de las proteínas Por precipitación de proteínas y carbohidratos Uso mas frecuente Microscopia electrónica y algunos estudios de fluorescencia Ampliamente usado para estudios de fluorescencia e inmunocitoquímicos Gran variedad de estudios ventajas/ desventajas *provee la mayor preservación de la estructura fina *es el mas severo de los fijadores *en gral. Altera los epitopes *provoca fluorescencia inespecifica *produce menor autofluorescencia que el gluteraldheído *menor cantidad de puentes que el glutaraldheído *penetra mas rápidamente dentro de la célula. *fijación mas rápida que el aldheído *frecuentemente altera el patrón de localización de antígenos *Fija y permeabiliza * antígenos solubles pueden perderse *contracción de la muestra

Permeabilización Produce poros en las membranas celulares Permite la entrada de los anticuerpos a la célula No es necesario si se quiere detectar antígenos expuestos en la cara exoplásmica de la membrana plasmática o de matriz extracelular Se utilizan generalmente detergentes no iónicos

Permeabilización Micela de detergente en agua

Ruptura de la membrana por detergente

Bloqueo En general se utiliza BSA (Sero-albúmina bovina) Su función es evitar interacciones inespecíficas de los anticuerpos

Tinción con Anticuerpos Los anticuerpos son proteínas que tienen la capacidad reconocer y unirse específicamente y con alta afinidad a otras proteínas. La molécula que induce la producción de anticuerpos y a la éstos se unen se denomina antígeno. Cada antígeno suele presentar varios determinantes antigénicos o epitopes.

Anticuerpos Policlonales Monoclonales Anticuerpos producidos por diferentes clones de linfocitos Anticuerpos producidos por un único clon de linfocitos Mezcla heterogénea de anticuerpos, reconocen distintos epitopes de un mismo antígeno. Población de anticuerpos homogéneos, reconoce un único epitope del anticuerpo

Anticuerpos policlonales Conejo, cabra, oveja, etc. Separar el suero Purificación de anticuerpos

Anticuerpos monoclonales Se obtienen inmortalizando linfocitos B, por fusión con células de mieloma de ratón. Las células fusionadas (hibridomas) producirán inmunoglobulinas idénticas a las que producía el linfocito B normal parental y es inmortal como el mieloma que le dio origen.

Anticuerpos monoclonales Células productoras de anticuerpos Fusión Hibridomas Producción de anticuerpos monoclonales

Anticuerpos monoclonales Alta especificidad, reconocen un único epitope. Se pueden obtener en cantidades ilimitadas con las mismas características. Mayor costo que los sueros policlonales.

César Milstein (Bahía Blanca, 8/10/1927 Cambridge, 24/3/2002) Premio Nobel de Química 1984

Inmunofluorescencia directa Anticuerpo fusionado a un fluoróforo Células fijadas, permeabilizadas y bloqueadas

Inmunofluorescencia indirecta Anticuerpo primario (IgG) anti-tubulina (producido en conejo) anti-vinculina (producido en conejo)

Inmunofluorescencia indirecta Fluoróforo Anticuerpo secundario (anti IgG de conejo) Anticuerpo primario (IgG) anti-tubulina anti-vinculina Células fijadas, permeabilizadas y bloqueadas

Inmunofluorescencia indirecta Microscopio de fluorescencia

Inmunofluorescencia DIRECTA INDIRECTA Anticuerpo marcado con fluoróforo primario secundario Ventajas Acorta tiempos de incubación Mayor sensibilidad El anticuerpo secundario puede ser usado para localizar cualquier anticuerpo primario producido en el mismo animal para el cual fue hecho el secundario

TP INMUNOCITOQUÍMICA CÉLULAS EN MONOCAPA TRANSFECCIÓN FIJACIÓN (paraformaldehído ) PERMEABILIZACIÓN BLOQUEO LAVADOS ANALISIS POR MICROSCOPIA DE FLUORESCENCIA ANTICUERPO PRIMARIO ANTICUERPO SECUNDARIO

ACTINA ACTINA/NUCLEO/RETICULO

VINCULINA/NUCLEO/RETICULO

MICROTUBULOS/NUCLEO/VESICULAS