Tipos de estudio: Problema: Diabetes. Que hacer???? Métodos de Estudio en Biología Celular. Métodos en vivo. - Estudios in vivo - Estudios in

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1 Métodos de Estudio en Biología Celular Problema: Diabetes 1. Introducción Métodos de estudio 2. Tipos de estudios Estudios in vivo Estudios in vitro 3. Técnicas de estudio De base preferentemente microscópica De base preferentemente NO microscopica Que hacer???? Métodos en vivo Tipos de estudio: - Estudios in vivo - Estudios in vitro (aislamiento y crecimiento de células en cultivo) * Estudios sobre material fijado 1

2 Métodos en vivo Soria et al (2000) Diabetes 49: D3 Transfección con la construcción de selección Higro Promotor r Constitutivo Promotor Rodopsina Neo r Clones resistentes a Higromicina + Higromicina Diferenciación In vitro Selección de células que expresen marcadores de fotorreceptores + Neomicina Maduración 2

3 P10 5 days P10 5 days CÉLULAS D3 INDIFERENCIADAS CUERPOS EMBRIONARIOS DE 2 DÍAS EN DIFERENCIACIÓN ESPONTÁNEA E 9.5 E 10.5 E 11.5 E 12.5 E 13.5 E 14.5 E 15.5 E 16.5 E 18.5 P1 P3 P5 P7 ADULT C- Indif. 3 days 7 days 9 days 11 days 13 days 15 days 17 days 19 days 21 days 25 days 30 days C- Peripherin 1 (mouse) Peripherin 1 (EB s ES-D3/13) E 9.5 E 10.5 E 11.5 E 12.5 E 13.5 E 14.5 E 15.5 E 16.5 E 18.5 P1 P3 P5 P7 ADULT C- Indif. 3 days 7 days 9 days 11 days 13 days 15 days 17 days 19 days 21 days 25 days 30 days C- DIFERENCIACIÓN CON MEDIOS NEURONALES DE CUERPOS EMBRIONARIOS EXPANDIDOS EN MONOCAPA IRBP (mouse) IRBP (EB s ES-D3/13) 3

4 EB s D3 Monocapa (2 días) ATRA/9-cis RA (5 días) Seleccionador de células activado por fluorescencia AMES (2 días) Neurofilamento 200 (verde) y núcleos celulares Hoechst (azul) en cuerpos embrionarios de 26 días Estudios en fresco Estudios Vitales y Supravitales Cúltivo de células y órganos Explantes Cultivos Primarios Cultivos Secundarios Tipos de estudio: - Estudios in vivo - Estudios in vitro (aislamiento y crecimiento de células en cultivo) - Estudios sobre material fijado 4

5 ORGANISMO MATERIAL DE ESTUDIO Estudios sobre material fijado Fresco Congelación Fijación Fijado Cultivo In Vivo Inclusión Corte Tinción Montaje 1. Fijación 2. Inclusión 3. Corte 4. Tinción OBSERVACIÓN Estudios sobre material fijado: FIJACION Objetivos: Detener la dinámica funcional y los procesos enzimáticos para evitar los procesos de autolisis... Hacer estática la estructura del organismo Preservar los componentes tisulares Modificar la reactividad de los tejidos frente a diferentes agentes Facilitar la difusión a través de las membranas (o la fijación) de determinados compuestos Mecanismos de actuación de los fijadores: Por deshidratación: Alcohol, acetona.. Por fijación de sales: Cloruro de mercurio, dicromato potásico, acetato de uranilo,, ácido pícrico,... Por cambios del estado coloidal: Acido acético, ácido crómico,.. Por reticularización: : Formol, paraformaldehido, glutaraldehido,, Osmio... Mezclas 5

6 Estudios sobre material fijado Técnicas de estudio: 1. De base preferentemente microscópica 2. De base preferentemente no micróscopica Separación y cultivo celular Fraccionamiento de componentes celulares Estudio de las condiciones químicas intracelulares Técnicas de DNA recombinante Microscopio Óptico Microscopio Óptico 6

7 Inmunocitoquímica 7

8 Microscopio de Fluorescencia Anticuerpos frente a Colágeno IV Electrodo Intracortical Acute Experiments: Histology Procesamiento Externo 8

9 Acute Experiments: Early response * Chronic Experiments Proliferation of reactive astrocytes (GFAP stain) GFAP NEUN * * 9

10 Microscopio Óptico Microscopio Óptico 10

11 Ampliando los límites de detección Contraste de fases interferencial + Análisis de imagen Microscopio Confocal Autoradiografía: Incorporación de Prolina tritiada a nivel de la membrana basal 11

12 Reconstrucción tridimensional a partir de imágenes de microscopía Confocal Microscopio de fluorescencia Microscopio Confocal Reconstrucción tridimensional a partir de secciones seriadas 12

13 Microscopio Electrónico Transmisión Microscopía Electrónica: Sombreado 13

14 Microscopía Electrónica: Sombreado Microscopía Electrónica: Criofractura Microscopía Electrónica: Criofractura Microscopía Electrónica: Criofractura 14

15 Criotécnicas Reconstrucción tridimensional a partir de imágenes de Microscopia Electrónica Tinción negativa Autoradiografía al Microscopio Electrónico 15

16 Microscopia DIC de alta resolución Proliferation of microglia and macrophages GSI-B4 M. E. Transmisión CD 68 Microscopia de Barrido Microanalysis cps A Técnicas de estudio: B C 1. De base preferentemente microscópica 2. De base preferentemente no micróscopica Separación y cultivo celular Fraccionamiento de componentes celulares Estudio de las condiciones químicas intracelulares Técnicas de DNA recombinante Energy (KeV) 16

17 Fraccionamiento de las células y análisis de sus moléculas. De Duve,, Premio Nobel 1974 Fraccionamiento de las células y análisis de sus moléculas. Cristalografía de Rayos X Homogeneización y ultracentrifugación diferencial. Sistemas de células libres. Técnicas de cromatografía (intercambio iónico, filtración en gel,, afinidad,...) Técnicas de electroforesis (SDS-PAGE, Western Blotting,,...) 17

18 Espectroscopia de RMN Registro Intracelular Ganglion cell spike trains are the result of extensive signal processing in the retinal network G24 Individual ganglion cells are unreliable stimulus encoders due to response variability and ambiguity Variability Red /195 Ambiguity Green /285 Blue /315 Ratecode? Timecode? local versus distributed representation 18

19 Registro en parche de membrana Registro en parche de membrana La proteína luminiscente aecuorina emite luz en presencia de Ca++ libre Visualización intracelular de la concentración de Ca++ utilizando un indicador fluorescente 19

20 Métodos para introducir en una célula una substancia para la cual la membrana es impermeable Visualización de microtubulos con moléculas de tubulina marcadas Tecnología de DNA recombinante Secuenciación de aminoacidos. Clonación y separación DNA. Técnicas de hibridación. Técnicas de PCR. Métodos de Estudio en Biología Celular 1. Observación de la estructura de las células con el microscopio. 2. Aislamiento y crecimiento de células en cultivo. 3. Fraccionamiento de las células y análisis de sus moléculas. 4. Fisiología celular. 20

21 ORGANISMO MATERIAL DE ESTUDIO Fijación Fresco Congelación Fijado Cultivo In Vivo Inclusión Corte Tinción Montaje OBSERVACIÓN 21