Trabajo práctico n 5 ENZIMAS DE RESTRICCIÓN

Facultad de Ciencias Exactas, Químicas y Naturales Universidad Nacional de Misiones Trabajo práctico n 5 ENZIMAS DE RESTRICCIÓN Cátedra de Genética Molecular GRUPO 2 Alumnos o Briñoccoli Yanina o Cortese Julieta o Olexen Cinthia o Rodríguez Ana Laura o Soria Florencia o Zerda Moreira Andrea 2015 1

TRABAJO PRÁCTICO Nº5 ENZIMAS DE RESTRICCIÓN (ER) PARTE PRÁCTICA A) Antes de efectuar una digestión de ADN genómico total es necesario conocer algunas características de la enzima de restricción a utilizar. Con la ayuda de catálogos identificar los siguientes aspectos de HaeIII: -Fuente de donde es extraída la enzima: Haemophilus aegyptius -Sitio diana (apunte la secuencia): GG CC CC GG -Temperatura a la que opera la enzima: 37 C -Buffer en el que actúa: Buffer C (ver Tabla 1 para especificación) -Costo de la enzima: 2500 USD + IVA: 128.70 (Promega) -Detalle: Qué resultados espera obtener luego de la digestión con la ER? Cómo se observaría a luz UV el ADN digerido luego de una electroforesis en gel de agarosa? Luego de la digestión con la enzima se espera obtener fragmentos de diferente peso molecular, dependiendo de la cantidad de sitios diana que la secuencia en análisis presenta. Los fragmentos obtenidos de la digestión luego se someten a electroforesis en gel y al revelar con la luz UV se observarán los distintos fragmentos brillantes, en la distancia corrida según su peso molecular. Se debe considerar que si se utiliza ADN genómico total es posible observar smear en la corrida electroforética dada la cantidad de fragmentos que se generarían, muy por encima de la resolución del gel de agarosa. B) A continuación se le presentarán una serie de fotografías que corresponden a fragmentos de ADN digeridos con: TaqI, HinfI, AluI, MboI, HaeIII y DdeI, con el objeto de determinar diferencias intra (entre sexos) e interespecíficas. Las corridas fueron realizadas en geles de agarosa al 2%. Determinar: TaqI 1. Buscar en catálogos las características de las diferentes enzimas a utilizar de igual forma que en el punto A. 2

-Fuente de donde es extraída la enzima: Thermus aquaticus YTI. -Sitio diana (apunte la secuencia): T CG A A GC T -Temperatura a la que opera la enzima: 65 C (exhibe una actividad <10% a 37 C) -Buffer en el que actúa: Buffer E (ver Tabla 1 para especificación) -Costo de la enzima: 1000u USD:102.31 (Promega) Tabla 1: Proporciona composiciones de Buffers para la reacción de enzimas de restricción, que figuran como concentraciones 1X. Buffer ph (a 37 C) Tris-HCl (mm) De MgCl 2 (mm) NaCl (mm) KCl (mm) TDT (mm) B 7.5 6 6 50-1 C 7.9 10 10 50-1 D 7.9 6 6 150-1 E 7.5 6 6 100-1 HinfI -Fuente de donde es extraída la enzima: Haemophilus influenzae Rf. -Sitio diana (apunte la secuencia): G ANT C C TNA G -Temperatura a la que opera la enzima: 37 C -Buffer en el que actúa: Buffer B (ver Tabla 1 para especificación) -Costo de la enzima: 1000u USD + IVA:85,80 (Promega) AluI 3

-Fuente de donde es extraída la enzima: Arthrobacter luteus. -Sitio diana (apunte la secuencia): AG CT TC GA -Temperatura a la que opera la enzima: 37 C -Buffer en el que actúa: Buffer B (ver Tabla 1 para especificación) -Costo de la enzima: 500u USD + IVA:143.55 (Promega) MboI -Fuente de donde es extraída la enzima: Cepa E. coli que lleva el gen MboI de Moraxella bovis (ATCC 10900). -Sitio diana (apunte la secuencia): GATC CTAG -Temperatura a la que opera la enzima: 37 C -Buffer en el que actúa: 1X CutSmart Buffer: 50 mm acetato de potasio,20 mm Tris-acetato,10 mm Acetato de magnesio,100 mg / ml de BSA -Costo de la enzima: 500u --> USD: 69 (NEB) DdeI -Fuente de donde es extraída la enzima: Desulfovibrio desulfuricans. -Sitio diana (apunte la secuencia): C TNA G G ANT C -Temperatura a la que opera la enzima: 37 C -Buffer en el que actúa: Buffer D (ver Tabla 1 para especificación) 4

-Costo de la enzima: 200u USD + IVA:59.40 (Promega) 2. Reconocer, con la ayuda de catálogos, qué marcador de PM se utilizó en las diferentes corridas electroforéticas. Detallar el tamaño de las diferentes bandas del mismo. Con la ayuda del catálogo de Genbiotech, el marcador de PM que se utilizó en las diferentes corridas electroforéticas fue una escalera de ADN de 100bp (Fig.1), de 11 fragmentos que varían en tamaño desde 100 pb a 1000 pb en incrementos de 100 con una banda adicional en 1,500bp. El fragmento de 500 pb está presente en mayor intensidad para facilitar su identificación. En el presente trabajo se consideró de 600pb a la banda de mayor intensidad. Fig 1. Marcador de peso molecular. Escalera de ADN de 100pb 3. Estimar el tamaño de las diferentes bandas producto de la digestión de una enzima cualquiera. En la tabla siguiente se presentan el tamaño, en pares de bases, de las diferentes bandas producto de la digestión de cada una de las enzimas propuestas, en cada especie y discriminada por sexo: 5

Especies Enzima sexo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 AluI Machos 510 510 510 510 510 510 510 510 510 510 200 200 200 200 200 200 200 200 200 200 170 170 170 170 170 170 170 170 170 170 150 150 150 150 150 150 150 150 150 150 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 1130 1130 1130 1130 1130 1130 1130 1130 1130 1130 Hembras 520 520 520 520 520 520 520 520 520 520 200 200 200 200 200 200 200 200 200 200 170 170 170 170 170 170 170 170 170 170 150 150 150 150 150 150 150 150 150 150 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 1140 1140 1140 1140 1140 1140 1140 1140 1140 1140 DdeI Machos 550 550 550 550 550 550 550 550 550 550 460 280 280 280 280 280 280 280 280 280 280 170 170 170 170 170 170 170 130 130 1000 1590 1130 1000 1000 1000 1000 830 830 830 Hembras 540 540 540 540 540 540 540 540 540 270 270 270 270 270 270 270 100 100 810 810 910 810 810 910 810 540 540 HaeIII Machos 480 650 460 640 430 640 430 620 650 650 620 480 650 460 640 430 640 1050 620 650 650 Hembras 640 650 650 420 650 470 650 470 Himfl Machos 600 600 600 600 600 600 600 600 600 600 330 330 330 330 330 330 330 330 330 330 100 100 100 100 100 930 930 1030 1030 930 1030 1030 1030 930 930 Hembras 600 600 600 600 600 600 600 600 600 330 330 330 330 330 330 330 330 330 100 100 100 100 100 100 930 930 1030 1030 930 1030 1030 1030 1030 Mbol Machos 850 850 850 850 850 850 850 850 850 850 360 300 300 300 300 300 300 300 300 300 300 1150 1150 1150 1150 1150 1150 1510 1150 1150 1150 Hembras 860 860 860 860 860 860 860 860 860 380 320 320 320 860 860 1180 1180 860 860 1560 860 860 Machos 1160 1160 1160 630 1160 1160 630 660 860 620 TaqI 620 620 660 260 620 620 260 620 620 260 260 260 260 210 260 260 210 260 210 210 210 210 210 210 210 210 2250 2250 2290 1100 2250 2250 1100 1750 1690 1090 Hembras 620 620 630 620 620 620 620 660 830 200 200 200 200 200 200 200 200 360 360 360 360 360 360 360 360 360 6

El cálculo del tamaño de las bandas obtenidas por las diferentes enzimas de restricción se realizó a partir de la medición de las imágenes de las corridas electroforéticas y mediante una curva estándar, la cual consiste en: la distancia de corrida de las bandas del marcador de peso molecular en el gel en milímetros, versus el tamaño en pares de bases. Tal curva se realizó para cada gel presentado, para así, luego de medir la distancia de la/las banda/s de cada especie en dicho gel, ubicar tal distancia en la curva y poder determinar el peso molecular correspondiente: Tamaño en pares de bases Distancia de migración en mm 4. Elaborar un mapa de restricción tentativo para las diferentes enzimas utilizadas. 7

En el mapa tentativo presentado se debe considerar que los puntos de corte han sido estimados de mediciones de corridas electroforéticas que, en algunos casos, pueden haberse perdido algunas bandas, por lo que el tamaño del fragmento total y el número de sitios podría no reflejar la verdadera acción enzimática. Asimismo, el orden de los fragmentos es arbitrario. 5. Determinar si con alguna de las enzimas se detectaron diferencias intra o interespecíficas. La enzima Alu I no presentó diferencias intra e interespecíficas. DdeI presentó diferencias intra e interespecíficas. En el macho 2 se observan 5 fragmentos, obtenidos por 4 cortes realizados por la enzima. Por otra parte los machos de las especies 1 2 3 5 y 7 presentan una banda adicional. Los machos 2 y 3 también tiene una banda de 130 pb ausente en las demás especies. En cuanto a las hembras en la especies 8 y 9 está ausente la banda de 270 pb. Mientras que las especie 3 y 6 presentan una banda extra de 100 pb. La enzima TaqI, evidenció en la corrida electroforética, diferencias intra e interespecificas en los sitios de corte para esta enzima. Los machos de la especie 1 presentaron 4 bandas (3 sitios de corte) en comparación con las hembras de la especie 1 que presentaron 3 bandas (2 sitios de corte). La misma situación puede observarse para los machos y hembras de las especies 2, 3, 5,6. Los machos y hembras de las especies 4 y 7, presentaron 3 bandas (2 sitios de corte). Con respecto a la especie 9, para los machos se observaron 3 bandas ( 2 sitios de corte) mientras que para las hembras se observaron solo 2(un sitio de corte). En todos los casos la longitud de las bandas entre machos y hembras fue diferente con excepción de los machos de las especies 1,2,5 y 6 que comparten una banda de igual longitud con las hembras de las especies 1,2, 4,5, 6 y 7. Algunas bandas fueron de tamaño muy similar entre machos y hembras de la misma especie. 8

Por otro lado, se observan diferentes patrones de bandas de distintas longitudes entre las especies, pudiendo decir que la enzima TaqI presenta 1, 2 y 3 sitios de corte, dependiendo de la especie observada. HaeIII presentó diferencias intra e interespecíficas. Los machos y las hembras de las especies 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8 y 9 presentan patrones de bandas distintivos, en cuanto al tamaño y, en algunos casos al número, presentando ninguno, 1 a 2 sitios de corte (quizás más). La especie 2 parecería no tener diferencias intraespecíficas. Asimismo, son evidentes las diferencias entre las especies, mostrando diferentes o igual número de bandas, y en el último caso, con diferente tamaño. La enzima HaeIII parecería presentar diferentes sitios de corte en las diferentes especies y entre los distintos sexos. En la enzima MboI se observó tanto diferencias intra como interespecificas. Dentro de las primeras observamos que las hembras presentaban mayor longitud (PM) de los fragmentos obtenidos y que podían diferir en el número de bandas con respecto a los machos de una misma especie. En cuanto a las diferencias interespecificas se puede mencionar 3 patrones de bandas diferentes 1, 2 o 3 bandas donde algunas especies comparten el mismo patrón como en el caso de los machos de las especies 2, 3, 4, 5, 9 y 10, que a su vez difieren de la especie 7. Al digerir con la enzima Hinf I, y luego del análisis de las fotografías de las corridas electroforéticas, se pone de manifiesto que existen diferencias tanto intraespecificas como interespecificas. Siendo más acentuadas las diferencias interespecificas. Respecto a las diferencias intraespecificas: solo en la especie 9 se observa que los machos presentan dos bandas (1 sitio de corte), mientras que en las hembras presentan 3 bandas (2 sitios de corte). Los individuos, tanto machos como hembras, de las especies 1, 2, y 5 presentan el mismo patrón de bandas, dos fragmentos (1 sitio de corte). Los representantes de las especies 3, 4, 6, 7, y 8 presentan a su vez el mismo patrón de bandas, 3 fragmentos (2 sitios de corte). Pero en las hembras de las especies 6 y 7 aparte existen otros tres fragmentos en los que no se puede determinar el peso molecular de los mismos, debido a que se encuentran por fuera del rango del marcador de peso molecular. No sucede lo mismo en los machos de las mismas especies en donde solo existen los tres fragmentos mencionados anteriormente. 6. Discutir los resultados. En los resultados obtenidos resaltamos que, al no poder determinar el tamaño del fragmento total tratado con diferentes enzimas, los puntos de cortes propuestos son sólo sugerentes y representan los sitios tentativos de acción de las enzimas. Esto se debe a que el número de bandas presentadas 9

en las corridas no implica, necesariamente, un número de sitios de cortes determinado. Por otro lado, existe la dificultad de la determinación del tamaño de los fragmentos más pequeños que caen fuera de la escala del marcador. C) Utilizando el siguiente número de acceso M24401.1 del NCBI rescate la secuencia del genzfy- 2 de Mardon and Page (1994). Ubique los primers (AK1 y AK2) con la herramienta del NCBI. Verifique el tamaño del amplicón. Levante la secuencia delimitada por los primers y traslade al programa NEB CUTTER (www.tools.neb.com). Proceda a efectuar la digestión con las ER detalladas en el punto B. Determine: (a) cuántos sitios de reconocimiento para cada ER posee el fragmento amplificado? (b) la posición de los diferente sitio diana para las diferentes ER. (c) Genere una corrida electroforética electrónica que le permita discriminar los fragmentos discretos producto de la digestión con las diferentes enzimas. (d) Compare con los datos de las digestiones realizadas en las fotografías entregadas. Utilizando el número de acceso M24401.1 del NCBI identificamos la secuencia del gen Zfy-2 de Mardon and Page (1994) y ubicamos los primers (AK1 y AK2): LOCUS MUSZFY2A 2794 bp mrna linear Mus musculus, proteína de dedos de zinc (Zfy-2) mrna. Mus musculus (ratón doméstico) Clasificación (NCBI) Mus musculus Eukaryota; Metazoa; Chordata; Craniata; Vertebrata; Euteleostomi; Mammalia; Eutheria; Euarchontoglires; Glires; Rodentia; Sciurognathi; Muroidea; Muridae; Murinae; Mus; Mus. La secuencia delimitada por los primer es: 10

GTCTATCCTTGCATGTTTTGTGGGAAAAAATTTAAGACCAAAAGGTTTTTGAAAAGACACATAAAAAACCAT CCTGAATACCTTGCTAATAAAAAATATCACTGTACTGAGTGTGATTACAGTACCAACAAGAAGATAAGCTTA CATAATCACATGGAGAGCCACAAGCTAACCATTAAGACAGAAAAGACCACCGAATGTGATGACTGTAGGAA GAATCTTTCTCATGCTGGGACTTTGTGTACTCACAAAACAATGCATACAGAAAAAGGAGTCAACAAAACATG TAAGTGTAAGTTCTGTGACTATGAAACAGCTGAACAGACATTATTGAATCACCACCTTTTGGTGGTCCACAG GAAGAAATTTCCTCACATTTGTGGAGAATGTGGTAAAGGTTTCCGTCACCCATCAGCACTCAAAAAGCACAT ACGAGTTCACACAGGAGAGAAGCCCTATGAATGTCAGTATTGTGAGTACAAGTCTGCAGACTCTTCCAACTT GAAAACTCATATAAAATCTAAGCATAGTAAAGAGATACCACTGAAGTGTGACATCTGTCTCCTGACTTTCTC AGATACCAAAGAGGCTCAGCAACATGCCGTTCTGCACCAAGAAAGCAGAACACATCAATGTTCACATTGCA ACCATAAGAGTTCAAACTCAAGTGATTTAAAGCGACACATAATTTCCGTTCACACAAAGGCGTATCCTCATA AATGTGACATGTGCAGCAAAGGATTTCATAGGCCTTCAGAACTCAAGAAGCATGTGGCTACCCATAAAAGT AAAAAAATGCACCAATGTAGACACTGTGACTTTAATAGTCCAGATCCATTTCTGCTTAGTCACCATATTCTCT CAGCTCACACAAAGAATGTTCCATTCAAGTGTAAGAGATGTAAAAAGGAATTTCAACAACAGTGTGAGCTT CAAACGCATATGAAGACCCACAGTAGCCGAAAAGTCTATCAGTGTGAGTACTGTGAATATAGCACCAAAGA TGCCTCAGGTTTTAAGCGTCACGTTATCTCCATTCATACGAAAGACTATCCTCACCGCTGTGACTTCTGCAAG AAAGGATTCCGGAGACCCTCGGAAAAGAATCAACACATAATGCGACAT Luego, levantamos la secuencia delimitada por los primers al programa NEB CUTTER (www.tools.neb.com) y continuamos con la digestión con las ER detalladas en el punto anterior. Así determinamos que: a) Los sitios de reconocimiento para las enzimas de restricción que posee el fragmento amplificado son: En la Tabla 1, se observa en la fila Cuts, los sitios de reconocimiento para las enzimas de restricción. Para la enzima TaqI, no se detectaron sitios de reconocimiento en la secuencia amplificada: 11

b) La posición de los diferentes sitio diana para las diferentes ER son: Sequence digested with: AluI, DdeI, HaeIII, HinfI, MboI Sequence digested with: AluI, DdeI, HaeIII, HinfI, MboI ALu I Ddel 12

HaeIII HinfI Mbol e) Corridas electroforéticas electrónicas para cada ER: Alu I 13

Ddel 14

Hae III 15

HinfI 16

Mbol I 17

d) Compare con los datos de las digestiones realizadas en las fotografías entregadas. Al comparar las corridas electroforéticas electrónicas con las fotografías entregadas observamos que: La enzima HaeIII presenta un patrón de bandas muy similar, en la especie 7, al presentado en la electroforesis electrónica para ésta. Asimismo, la enzima MboI presenta un patrón equivalente al de la electrónica en aquellas especies con dos bandas. La enzima AluI exhibe un patrón de bandas análogo al de su electroforesis electrónica pero, sin embargo, los tamaños de las bandas difieren. HinfI y DdeI no son parecidas a sus equivalentes electrónicos. La enzima TaqI no exhibe sitio de corte en la corrida electrónica. 18

Bibliografía Sitios de internet consultados: http://www.biodynamics.com.ar/enzimas.html (Página de biodynamics donde se encuentran las enzimas de restricción especificando cantidad (u) y precio en dólares más IVA) http://worldwide.promega.com/products/cloning-and-dna-markers/restrictionenzymes/haeiii/?activetab=0 http://worldwide.promega.com/resources/product-guides-and-selectors/restriction-enzymeresource/ http://worldwide.promega.com/resources/product-guides-and-selectors/restriction-enzymeresource/restriction-enzyme-reference-information/ (página donde se encuentra la composición de los buffers de reacción que se especifican para cada enzima) 19