Evaluación de proteínas de estrés térmico en frutos sometidos a tratamientos térmicos poscosecha Autores: GUIDI, Silvina; NANNI, Mariana y POLENTA, Gustavo RESUMEN Los tratamientos térmicos poscosecha han sido utilizados durante muchos años como método alternativo para el control de las enfermedades causadas por los hongos y los insectos en las frutas y los vegetales. En este estudio, se evaluó el efecto de tratamientos térmicos poscosecha en la expresión de las dos familias más importantes de proteínas de estrés térmico (HSPs), las shsps y las HSP70, respectivamente, en tomates cv (Lycopersicon esculentum Mill) cv Beatriz; mangoes (Magnifera indica L.) cv. Keitt y limones (Citrus limon) cv Lisboa. Los análisis fueron realizados al inicio, luego de aplicado el tratamiento térmico y durante la conservación. Los extractos proteicos fueron analizados por SDS-PAGE. La sobreexpresión de las HSPs fue evaluada por Western blot, utilizando un antisuero policlonal anti-shsps contra la principal proteína de tomates tratados térmicamente (HSPC1) y un anticuerpo monoclonal contra la HSP70. Los resultados indican que estas proteínas pueden ser utilizadas para monitorear la intensidad de los tratamientos térmicos aplicados en estas frutas. ABSTRACT Postharvest heat treatments have been used for many years as alternative to chemical control of fungical diseases and insect infestation of fruits and vegetable. In this study, we evaluate the effect of heat shock treatments (HT) on the expression of the two most important families of HSPs, small HSPs and 70 kda respectively, in tomatoes (Lycopersicon esculentum Mill) cv Beatriz; mangoes (Magnifera indica L.) cv. Keitt and lemons (Citrus limon) cv Lisboa. The analyses were performed at harvest, immediately after heat treatment application, and periodically during the conservation. Proteins extracts were analyzed using SDS-PAGE. The overexpression of HSPs was evaluated by Western blot, using a shsp-specific policlonal antiserum raised against the main 1
shsps from heated tomatoes (HSPC1) and a monoclonal antiserum raised against HSP70. The results show that these proteins can be used to monitor heat treatments intensity. INTRODUCCIÓN El desarrollo de técnicas no químicas para mantener la calidad postcosecha de frutas está siendo enfatizado en muchos programas de investigación. Los tratamientos térmicos (TT) se presentan como una alternativa promisoria como método no químico para el control de los desórdenes fisiológicos de las frutas. Varios autores has establecido una relación entre la respuesta al golpe térmico y la protección ejercida contra los diferentes TT (Sabehat et al., 1998; Wang et al., 2004). La aplicación de TT estimula la síntesis de proteínas conocidas como proteínas de estrés térmico ó heat shock proteins (HSPs). Actualmente se reconocen cinco familias de HSP: las chaperoninas (HSP60); la familia de las HSP90; la familia de HSP100; la familia de HSP70 y la familia de proteínas de bajo peso molecular (small heat shock proteins = shsps), siendo las dos últimas las más importantes dentro del reino vegetal. Sin embargo es importante tener en cuenta que en la actualidad muchas de las aplicaciones de los TT en nuestro país ha sido empírico, y no se conoce con suficiente profundidad los fundamentos bioquímicos y/o moleculares que expliquen los resultados obtenidos con la aplicación de los TT, limitando la posibilidad de optimizar los mismos sobre bases científicas definidas. MATERIALES Y MÉTODOS Se evaluaron diferentes frutas: tomates Beatriz (Corrientes), mangos Keitt (Yuto) y limones Lisboa (Famaillá), los cuales fueron sometidas a diferentes tratamientos térmicos poscosecha. Tomate: 1) tratamiento de estrés térmico corto (inmersión por 60 en un baño de agua a 42 C) = HS60m; 2) Tratamiento de estrés térmico largo (incubación en cámara por 24 hs a 39 C y 95% de humedad relativa) = HS24h; 3) No tratadas, utilizados como control = C. Mango: 1) tratamiento por inmersión en baño de agua a 46,1 C por 90 min; 2) No tratadas, utilizados como control = C. Los análisis fueron realizados al inicio, luego de aplicado los TT, y luego de 1 h de exposición a temperatura ambiente. Limones: 1) tratamiento térmico (incubación en cámara por 48h a 37ºC) y 2) No tratadas, utilizadas como control. Los análisis fueron realizados al inicio, luego de aplicado el TT, y durante la conservación a 1 C (4, 8 y 12 días). Extracción de proteínas: extracción fenólica a partir del pericarpio de tomates, pulpa de mangos y flavedo de cítricos (Hurkman & Tanaka, 1986). Concentración de proteínas: método de Lowry et al. (1951). Separación de proteínas por SDS-PAGE (12%): según técnica de Laemmli (1970). Detección de HSPs por Western Blot (WB) y cuantificación por densitometría: Membranas de Nitrocelulosa (MNC). Revelado con Ab primario (Ab-HSPC1) [antisuero policlonal obtenido contra una proteína de estrés de 21 kda de tomates tratados por calor (Polenta et al., 2007)] ó con Ac monoclonal comercial antihsp70 (Sigma); Ac secundario conjugado con fosfatasa alcalina (BioRad) (Stott, 1989). Cuantificación de proteínas por densitometría (BioRad GS-800), y evaluación de las intensidades con el programa Quantity One 1-D. 2
RESULTADOS Y DISCUSIÓN A continuación se muestra el análisis de las muestras de frutas sometidas a los diferentes tratamientos térmicos poscosecha (SDS-PAGE y Western blot) donde se observa la expresión de las dos familias más importantes de HSPs. Tomate Beatriz Figura 1: Análisis por SDS- PAGE de los extractos proteicos de tomates Beatriz no tratados (C) y tratados térmicamente (HS24 y HS60), evaluados a la salida del tratamiento térmico (0) y luego de 1 h de exposición a temperatura ambiente (+1h). Figura 2: Análisis por WB de tomates Beatriz no tratados (C) y tratados térmicamente (HS24 y HS60), evaluados a la salida del tratamiento térmico (0) y luego de 1 h de exposición a temperatura ambiente (1h). La membrana fue revelada con el antisuero policlonal Ab-HSPC1. Figura 3: Análisis por WB de tomates Beatriz no tratados (C) y tratados térmicamente (HS24 y HS60), evaluados a la salida del tratamiento térmico (0) y luego de 1 h de exposición a temperatura ambiente (1h). La membrana fue revelada con el anticuerpo monoclonal HSP70. Mango Keitt Figura 4: Análisis por WB de pulpa de mangos no tratados evaluados al inicio (C 1 y C 2 ), luego de aplicado el tratamiento (PHT 0 ) y luego de 10 días a TA (PHT 10 ). La membrana fue revelada 3
con el anticuerpo HSPC1 (inferior). monoclonal HSP70 (superior) y con el antisuero policlonal Ab- Limón Lisboa (4, 8, 12 días). Figura 1: Análisis por SDS-PAGE de los extractos proteicos de limón no tratado (C) y tratados térmicamente (HS48), evaluados a la salida del tratamiento térmico (HS) y luego de la frigoconservación Figura 4: Análisis por WB de los extractos proteicos de limón no tratados (C), evaluados al inicio (C o ), luego de aplicado el tratamiento (HS) y durante la conservación frigorífica (4, 8 y 12 días) La membrana fue revelada con el anticuerpo monoclonal HSP70 (superior) y con el antisuero policlonal Ab-HSPC1 (inferior). CONCLUSIONES Las técnicas electroforéticas e inmunológicas aquí aplicadas probaron ser herramientas útiles para la detección de proteínas de estrés presentes en los extractos de las frutas tratadas térmicamente. Se demostró un importante grado de reactividad cruzada entre proteínas de distintas especies, inclusive entre animales y vegetales (tomates vs. limones/mango y bovinos vs. limones/tomate/mango). Se comprobó el aumento de las proteínas de estrés de mayor importancia en el reino vegetal (HSP70 y shsps) en los frutos tratados térmicamente. El desarrollo de métodos inmunológicos basados en los anticuerpos capaces de detectar las HSPs de las frutas, puede ser utilizado como herramienta de monitoreo para evaluar la efectividad e intensidad de los tratamientos térmicos, y poder desarrollar programas de manejo integrado para llevar un control más efectivo de los desordenes y las enfermedades poscosecha. 4
BIBLIOGRAFÍA Hurkman, W.; Tanaka, C. (1986). Solubilization of plant membrane proteins for analysis by two-dimensional gel electrophoresis. Plant Physiol. 81: 802-806. Laemmli, U.K. (1970). Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.Nature. 227: 680-684. Lowry, O.H.; Rosebrough, N.J.; Farr, A.L. & Randall, R.J. (1951). Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 193: 265-275. Polenta, G.A.; Calvete, J.J.; González, C.B. (2007). Isolation and characterization of the main small heat shock proteins induced in tomato pericarp by termal treatment. FEBS Journal 274 6447 6455 Sabehat, A., Lurie, S. and Weiss, D. (1998). Expression of small heat shock proteins at low temperatures. Plant Physiol. 117: 651-658. Stott, D.I. (1989). Immunoblotting and dot blotting. J. Immunological Methods. 119(2): 153-187. Wang, W., Vinocur, B., Shoseyov, O, and Altman, A. (2004). Role of plant heat-shock proteins and molecular chaperones in the abiotic stress response. TRENDS Plant Science 9(5): 244-252. 5