10 Evergreen Drive, Suite E, Bozeman, MT 59715 Phone: (406) 585-9535 FAX: (406) 585-9219 www.sgmbiotech.com sporenews@sgmbiotech.com SGM Biotech, Inc. 2009 ALL RIGHTS RESERVED Produced in USA SPORE NEWS Volúmen 7, Número 5 Octubre 2010 Traducido por: Albareda, 6-8 entlo. Barcelona 08004 Tel.: +34 93 322 06 36 Fax: +34 93 441 65 90 Info@tiselab.com www.tiselab.com
Garrett Krushefski Scientific & Technical Services Manager Un usuario experimentado de nuestro indicador biológico (IB) para vapor EZTest empezó recientemente a hidratar y esterilizar por su cuenta sus propios medios de cultivo. Antes solía comprar medios de cultivos ya preparados a un proveedor, pero optó por este cambio como medida de ahorro. Las instrucciones en el cubo de medio de cultivo en polvo decían: "Autoclavar a 121ºC durante 15 minutos". El cliente preparó tres muestras de medio de cultivo para ejecutar su desarrollo del ciclo de esterilización y ejercicios de validación, y obtuvo los siguientes resultados. Todos los IBs mostraban crecimiento negativo una vez concluido el periodo de incubación de 24 horas. No obstante, en los botes de medio de cultivo se constató un crecimiento desenfrenado después de tres días a temperatura ambiente. En SGM Biotech somos partidarios de la afirmación las esporas no mienten. Nos había demostrado lo contrario nuestro cliente? Habían mentido realmente las esporas? Como suele suceder en situaciones como esta, la evaluación del problema empieza con una serie de preguntas. A continuación transcribo la lista de preguntas que planteé al cliente, con sus respuestas en cursiva. Revisa el cuestionario y mira a ver si puedes determinar la causa de que las esporas del IB murieran a pesar de que el medio de cultivo, según la evidencia, no es estéril. P1: Describa la carga: cuántos botes de medio de cultivo hay en el autoclave y cuál es el volumen de contenido de cada bote? R1: La carga está compuesta por un total de treinta botes; diez son de 500ml con 400ml de medio de cultivo, diez son de 1.000ml con 900ml de medio de cultivo, y otros diez de 2.000ml con 1.800ml de medio de cultivo. P2: Cuál es la duración del ciclo y la temperatura? R2: El autoclave se configuró de acuerdo con las instrucciones que aparecen en el cubo de medio de cultivo en polvo... 121ºC durante 15 minutos. P3: Cuál es el número de lote de los IBs utilizados? Puede describir la posición de los IBs en la carga? R3: El número de lote de los IBs es S-407. Los IBs se colocaron en el punto frío... parte delantera del autoclave justo encima de la línea de drenaje.
Una vez recogidas las respuestas a las preguntas, estoy seguro de que nuestras esporas siguen siendo honestas... no han mentido. Empecemos por el número de lote de los IBs. S-407 es un número de lote de IBs EZTest, y cuando se esterilizan líquidos en un autoclave de vapor, debemos utilizar un IB sumergible en líquido. Como ya se ha mencionado antes, este cliente era un usuario experimentado de nuestros IBs para vapor EZTest, y puesto que tenían amplias existencias en su laboratorio, asumieron que el EZTest también sería un IB apropiado para una carga líquida. En este caso, en concreto, el cliente colocó los IBs en la zona de la cámara que creían que tardaría más en calentarse... en la parte delantera de la cámara, justo encima de la línea de drenaje. Las esporas murieron porque el EZTest se colocó en la parte de la cámara donde tendrían contacto directo con el vapor a lo largo de todo el ciclo, que incluye la subida, los 15 minutos de duración del ciclo, y la larga y lenta fase de enfriamiento que se usa cuando se esterilizan líquidos. El líquido dentro de los contenedores no tendrá contacto directo con el vapor. Por el contrario, las moléculas de vapor del autoclave se condensarán en los contenedores Pyrex, más fríos, y transferirán su energía al cristal. Esta transferencia de energía hace que el cristal se caliente y, por lo tanto, que los medios de cultivo también empiecen a calentarse. Uno se podría preguntar, si la agresión del vapor es suficiente para matar las esporas del EZTest, por qué no son estériles los medios de cultivo? Las condiciones que prevalecen en la atmósfera de la cámara son MUY distintas a las condiciones de los medios de cultivos líquidos propiamente dichos. Las masas líquidas tendrán un lapso de tiempo determinado para adaptar su temperatura, y dicho lapso será mayor cuanto mayor sea la masa líquida. La Figura 1 muestra un gráfico que fue elaborado utilizando datos de temperatura reales procedentes de termopares de penetración. Aunque los volúmenes de líquido que aparecen en la Figura 1 son distintos a los de nuestro cliente, el gráfico muestra de forma efectiva el fenómeno del lapso de tiempo de adaptación de la temperatura en comparación con una situación de temperatura ambiente. El gráfico también muestra por qué se debe usar un IB sumergible para monitorizar este tipo de cargas. Un EZTest ubicado dentro de la cámara, monitoriza las condiciones de la misma, y no es representativo de los líquidos que estamos intentando esterilizar. Tan solo un IB sumergible en líquido, suspendido en la masa líquida, nos proporcionará información precisa sobre el grado de esterilidad de los medios de cultivo. Ahora tomemos en consideración las instrucciones para el autoclave indicadas en el cubo de medios de cultivo, las cuales dicen: "Autoclavar a 121ºC durante 15 minutos". Esta indicación podría ser precisa si especificamos que esta condición (121ºC durante 15 minutos) se refiere a la temperatura de los medios de cultivo propiamente dichos, y no a las condiciones de la cámara. En mi opinión, una indicación más adecuada para ayudar al usuario sería: Espere a que los medios de cultivo alcancen una temperatura de 121ºC y manténgala durante 15 minutos o tal vez, Esterilice los medios de cultivo hasta alcanzar una letalidad de 15Fo según lo indicado por los termopares de penetración. Mi última observación se refiere a la selección de volúmenes que el cliente intentó procesar en una misma carga. Vuelve a mirar la Figura 1 y observa la gran diferencia en tiempo de esterilización requerido para los distintos volúmenes de llenado. En el caso de la muestra de agar de 250ml se alcanzó una letalidad de 12Fo a los 16 minutos y medio aproximadamente, mientras que para la muestra de agar de 1.600ml se necesitaron 29 minutos aproximadamente para alcanzar el mismo grado de letalidad. Mezclar volúmenes no es un problema si las diferencias en volumen no son sustanciales. Sin embargo, si nuestro cliente ejecuta un ciclo suficiente para esterilizar una masa de 400ml, la masa de 1.800 ml probablemente no se llegue a esterilizar. Por el contrario, si se ejecuta un ciclo lo suficientemente largo para que la masa de 1.800ml quede esterilizada, la de 400ml correrá el riesgo de "quemarse". Lo ideal es que los volúmenes de llenado de líquidos sean similares y se desarrollen dos (o más) ciclos de esterilización distintos: un ciclo más corto para esterilizar los volúmenes pequeños, y otro más largo para los volúmenes más grandes.
A modo de resumen, los problemas se resolvieron y el cliente pudo realizar de forma adecuada la esterilización de los medios de cultivo aplicando lo siguiente: 1) Asegúrese de que los volúmenes de llenado de líquidos son similares para que el lapso de adaptación de temperatura sea similar para todos ellos. 2) No tome al pie de la letra todo lo que lea. Las instrucciones de los medios de cultivo indicaban un ciclo de 15 minutos de duración. Por medio de ejercicios apropiados de validación del ciclo, el cliente determinó que para alcanzar 15 minutos de letalidad equivalente a sus 1.800ml de volumen de carga, era necesario un ciclo de 40 minutos de duración. Selecciones y ubique los IBs de forma correcta. La esterilización de contenedores llenos de líquido requiere el uso de IBs sumergibles en líquido. La ubicación correcta del IB es el centro geométrico de la masa líquida, punto en el que el IB deberá situarse suspendido, aproximadamente a 1/3 ó 1/2 de la altura del líquido por encima de la base del contenedor, tal y como se muestra en el siguiente dibujo: 1/2 _ 1/3 _
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