19 OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPAÑA 11 Número de publicación: 2 229 721 1 Int. Cl. 7 : C12N /00, C12N /12 C07K 14/47, A01K 67/00 A01K 67/027, G01N 33/68 C12Q 1/68 12 TRADUCCIÓN DE PATENTE EUROPEA T3 86 Número de solicitud europea: 999280.9 86 Fecha de presentación: 2.06.1999 87 Número de publicación de la solicitud: 90116 87 Fecha de publicación de la solicitud: 11.04.01 4 Título: Animal transgénico no humano que comprende un gen Peg3 inactivo y la utilización del mismo. Prioridad: 2.06.1998 GB 9813778 73 Titular/es: CAMBRIDGE UNIVERSITY TECHNICAL SERVICES LIMITED The Old Schools, Trinity Lane Cambridge CB2 1TS, GB 4 Fecha de publicación de la mención BOPI: 16.04.0 72 Inventor/es: Surani, Azim 4 Fecha de la publicación del folleto de la patente: 16.04.0 74 Agente: Ponti Sales, Adelaida ES 2 229 721 T3 Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art. 99.1 del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas). Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, 1 28036 Madrid
DESCRIPCIÓN Animal transgénico no humano que comprende un gen Peg3 inactivo y la utilización del mismo. 2 3 4 0 La presente invención se refiere al gen Peg3 y el descubrimiento de que está implicado en termorregulación, obesidad y comportamiento materno, olfato, comportamiento masculino, apoptosis, supervivencia y degeneración celular y enfermedades infecciosas. El gen Peg3 se identificó en una búsqueda de genes cuya expresión está sellada en el ratón. Los genes sellados muestran un patrón inusual de expresión ya que ésta viene determinada estrictamente por su origen parental. Peg3 muestra sellado, siendo la copia paterna del gen la presente en la descendencia mientras la copia materna está silenciada. El gen expresa un mrna de alrededor de 9kb que codifica para una proteína inusual de dedos de zinc con once motivos C2H2 ampliamente espaciados y dos grupos de repeticiones de aminoácidos. El tamaño predicho de la proteína es de 72 aminoácidos. Véase Kuroiwa y col, (1996), Nature Genetics 12; 186-189. La secuencia de Peg3 se puede encontrar en el GenBank, número de acceso AF038939 (NCBI-REF 363877). Peg3 se expresa de forma temprana durante el desarrollo, en los somitas, los arcos branquiales y otros tejidos del mesodermo. En adultos se expresa preferentemente en el cerebro incluida el área preóptica media del hipotálamo, la amígdala, así como el bulbo olfatorio. Se expresa también en otros tejidos adultos como la glándula adrenal. La función del gen es desconocida, aunque en Kuroiwa y col., ibid, se destaca que el gen se localiza en una región del cromosoma 7 murino que es sinténico con la localización cromosómica humana de los genes asociados con la distrofia miotónica y la supresión tumoral. Descripción de la invención Hemos desarrollado un modelo de ratón transgénico en el se ha inactivado el gen Peg3. Hemos observado un número de cambios fenotípicos sorprendentes, particularmente obesidad, menor temperatura corporal, alteración del comportamiento materno, comportamiento masculino anormal, menor tamaño corporal en el momento del nacimiento y reducción de neuronas específicas en el hipotálamo. Además, la obesidad se desarrolla en el ratón a pesar de una menor ingesta de alimentos que en los animales control. Estos descubrimientos sugieren un papel de Peg3 en la regulación del peso corporal y la temperatura, y proporciona un modelo de estudio de las terapias para el tratamiento de la obesidad, los desequilibrios metabólicos, la regulación del crecimiento y el comportamiento. La invención proporciona un procedimiento para analizar un modulador putativo del peso corporal que consiste en la administración de dicho modulador putativo a un animal transgénico no humano que presente una copia inactiva del gen Peg3 como resultado de una modificación genética o que exprese Peg3 a un nivel superior que el nivel normal y determinar el efecto del modulador putativo en el metabolismo corporal. El descubrimiento de la función del gen Peg3 permite la búsqueda de otros genes implicados en la regulación metabólica, y por tanto la invención también proporciona un procedimiento de búsqueda de genes asociados con la regulación del peso o la temperatura corporal, el cual comprende proporcionar una proteína Peg3, poner dicha proteína en contacto con otras proteínas celulares, y determinar con qué proteínas celulares es capaz de unirse la proteína Peg3. Estos genes pueden ser aislados mediante procedimientos determinados, los cuales forman parte de un aspecto de la invención. El papel de Peg3 en el ratón permite la determinación de un genotipo PEG3 en humanos con un trastorno fenotípico asociado a obesidad o termorregulación, mediante un procedimiento que constituye un aspecto adicional de la invención. Dicho procedimiento consiste en: proporcionar un ácido nucleico de un grupo de pacientes obesos y de un grupo control de pacientes no obesos; analizar dicho ácido nucleico; y determinar uno o más aspectos de dicho ácido nucleico asociado con el fenotipo obeso. Un procedimiento análogo puede realizarse a nivel de la proteína, usando anticuerpos para determinar epitopos de PEG3 que difieran entre grupos, tanto en la fuerza relativa de unión como en su presencia o ausencia. 6 Las diferencias en los epitopos proteicos o en los genotipos que se determinan por dicho análisis pueden ser utilizadas para proporcionar un procedimiento que analice desde la susceptibilidad individual a la obesidad o los trastornos de la termorregulación. Dicho procedimiento consiste en el análisis del ácido nucleico de dicho individuo para uno o más aspectos de los trastornos de obesidad o termoregulación asociados con el gen PEG3. Tal y como se usan aquí comprende y comprendiendo deben interpretarse como incluye e incluyendo 2
Descripción detallada de la invención Gen PEG3 2 3 4 0 6 El gen Peg3 que hemos inactivado en el ratón es el gen cuya secuencia corresponde con el número de acceso del GenBank AF038939, (la descripción del mismo se incorpora aquí por referencia), el cual se localiza en el ratón en la región proximal del cromosoma 7. Sin embargo, la referencia aquí a Peg3 incluye las formas alélicas normales de este gen en el ratón, así como sus homólogos hallados en otras especies, incluyendo mamíferos como el hombre. La referencia a PEG3 se refiere específicamente al homólogo humano del gen y se usa aquí en referencia a procedimientos diagnósticos y similares practicados en en el hombre o en muestras humanas. El gen humano PEG3 se ha aislado y su secuencia parcial está disponible en el banco de datos del NCBI (AB00662, mrna de Homo sapiens para el gen KIAA0287, cds parcial). La región del PEG3, incluido el primer exón (nucleótidos del 1-174), está también presente en la entrada del GenBank AC0061, y muestra una gran homología con la secuencia murina del Peg3 correspondiente al número de acceso del Genbank AF262, que con la AF266 representa las secuencias Peg3 adicionales. La secuencia completa puede determinarse usando cebadores basados en la secuencia del banco de datos como sondas para hibridar con librerías de cdna, o para extender por PCR una fuente de mrna de dicho gen. Las ESTs W498 y W90868 (Base de datos Est) proporcionan fuentes adicionales de Peg3 murino, y las HS1228 y HS322 (Base de datos Est) proporcionan fuentes adicionales de secuencias PEG3 humanas. Se considera como secuencia de tipo salvaje a toda aquella secuencia hallada en el ratón u otros animales que fenotípicamente sean normales en lo que a regulación de peso y temperatura se refiere. Las secuencias homólogas pueden ser determinadas mediante metodología de rutina convencional en la materia. Las secuencias de ácidos nucleicos que codifican todo o parte del gen Peg3 y/o sus elementos reguladores pueden prepararse fácilmente por el personal experto usando la información y referencias contenidas aquí y las técnicas conocidas en la materia (por ejemplo, véase Sambrook, Fritsch and Maniatis, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, y Ausubel y col., Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, 1992). Estas técnicas incluyen 1) la utilización de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para amplificar muestras de tales ácidos nucléicos, p.ej., a partir de fuentes genómicas 2) síntesis química, o 3) preparando secuencias de cdna. Por ejemplo las técnicas de clonaje basadas en la PCR (reacción en cadena de la polimerasa) utilizarán cebadores (p.ej., de alrededor de -0 nucleótidos) basados en la secuencia del Peg3 murino de una región del mrna o del DNA genómico que codifica el mrna que se desea clonar. Los cebadores deberán entrar en contacto con el mrna o el DNA (por ejemplo obtenido de una célula cerebral, particularmente una célula de cerebro fetal) u otros tejidos embrionales o fetales, se realizará una reacción en cadena de la polimerasa en condiciones que permitan la amplificación de la región deseada y el fragmento amplificado se aislará (p.ej., purificando la mezcla de reacción en un gel de agarosa). Los cebadores pueden diseñarse de forma que contengan dianas reconocidas por enzimas de restricción adecuadas con lo que el DNA amplificado puede clonarse en un vector de clonaje adecuado. Tales técnicas pueden utilizarse para obtener todo o parte de un gen Peg3 de otros animales, como anfibios o mamíferos. Los clones genómicos que contienen el gen Peg3 y sus intrones y regiones promotoras pueden obtenerse también de forma análoga, empezando con DNA genómico de una célula primaria como una célula hepática, un cultivo celular o una librería como librerías de fagos, cósmidos, YAC (cromosoma artificial de levadura), BAC (cromosoma artificial bacteriano) o PAC (cromosoma artificial de fago P1/P2 ). Alternativamente, se pueden obtener genes homólogos preparando u obteniendo librerías de cdna o DNA genómico y analizando dichas librerías con sondas que comprendan parte o todo el gen murino Peg3 en condiciones de media a alta astringencia (por ejemplo cloruro sódico 0,03M y citrato sódico 0,03 M a temperaturas de entre 0ºC y ºC). En general, los genes homólogos han de serlo en al menos un %, más preferentemente en al menos un 70%, e incluso mejor un 80%, mucho más preferentemente en un 90%, 9%, 98% o 99% respecto al gen Peg3 murino dentro de la pauta de lectura abierta del mrna. Se prefieren preferentemente homólogos mamíferos. El porcentaje de homología (referido también como co-identidad) del DNA y de secuencias aminoacídicas puede calcularse usando algoritmos disponibles comercialmente. Los siguientes programas (proporcionados por el National Center for Biotechnology Information) pueden utilizarse para determinar homologías: BLAST, BLAST con huecos y PSI-BLAST, que pueden usarse con parámetros por defecto. El algoritmo GAP (Genetics Computer Group, Madison, WI). GAP usa el algoritmo de Needleman y Wunsch para alinear dos secuencias completas maximizando el número de correspondencias y minimizando el número de huecos. Generalmente, se usan los parámetros por defecto, con una penalización por creación de huecos = 12 y una penalización por extensión de huecos = 4. El uso aquí de los términos homología y homólogo no implica ninguna relación de evolución entre las secuencias comparadas, considerando por ejemplo el uso estándar de términos como recombinación homóloga que simplemente requiere que 2 secuencias nucleotídicas sean suficientemente similares como para recombinarse en condiciones adecuadas. 3
Inactivo 2 Para el objetivo de la presente invención, se deberá entender que la referencia a una copia inactiva del gen Peg3 incluye cualquier variante de tipo no-salvaje del gen que resulte en un fenotipo obeso o hipotérmico, o en trastornos del comportamiento. Por tanto, el gen puede suprimirse en su totalidad, o ser mutado, con lo que el animal produce una proteína truncada, por ejemplo, introduciendo un codón de parada y opcionalmente secuencias codificantes cadena arriba dentro de la pauta abierta de lectura del gen Peg3. Igualmente, la pauta abierta de lectura puede estar intacta y la copia inactiva del gen ser consecuencia de mutaciones en regiones promotoras. Generalmente, la inactivación del gen puede realizarse mediante recombinación homóloga dirigida. Se conocen técnicas para ello en la materia. Esto puede conseguirse de muy diversas formas. Una estrategia típica consiste en usar la recombinación homóloga direccionada para reemplazar, modificar o eliminar el gen de tipo salvaje en células madre embrionales (ES). Mediante electroporación, lipofección o microinyección se introduce en las células ES un vector dirigido que consta de un gen Peg3 modificado. En unas pocas células ES, el vector dirigido se aparea con la secuencia de DNA cromosómico conocida y transfiere la mutación deseada portada por el vector al genoma mediante recombinación homóloga. Se usan procedimientos de análisis o enriquecimiento para identificar las células transfectadas, y a continuación se clona una célula transfectada y se mantiene como una población pura. A continuación, las células ES alteradas se inyectan en el blastocito de un embrión de ratón para su preimplantación, o alternativamente se prepara una quimera de agregación en la que las células ES se colocan entre 2 blastocitos que junto con las células ES formarán un único blastocito quimera. El blastocito quimérico se transfiere quirúrgicamente al útero de una madre adoptiva donde se permite que el desarrollo progrese hasta término. El animal resultante será una quimera de células normales y donantes. Típicamente, las células donantes procederán de un animal con un fenotipo claramente distinguible como el color de la piel, por lo que la progenie quimérica se identifica fácilmente. La progenie se cría y sus descendientes se cruzan entre sí, dando lugar a heterocigotos y homocigotos para la mutación obtenida por recombinación homóloga. La producción de animales transgénicos se describe en profundidad por Capecchi, M, R, 1989, Science 244; 1283-1292; Valancius and Smithies, 1991, Mol Cell. Biol. 11; 12-18; y Hasty y col, 1991, Nature ; 243-246, cuyas descripciones se incorporan aquí como referencia. La recombinación homóloga en la modificación dirigida de genes puede utilizarse para reemplazar el gen de tipo salvaje Peg3 por una forma mutante definida específicamente (p.ej., truncada o que contenga una o más sustituciones). El gen inactivo puede ser también aquel en el que su expresión pueda ser bloqueada selectivamente de forma permanente o temporal. 3 4 0 6 El bloqueo permanente puede conseguirse mediante mecanismos que delecionen el gen en respuesta a una señal. Un ejemplo de tales sistemas es el sistema cre-lox en donde se proporcionan sitios lox de un fago en ambos extremos del transgen o al menos entre una porción suficiente (p.ej., en 2 exones localizados a cada lado de uno o más intrones). La expresión de la cre recombinasa causa la excisión y circularización del ácido nucleico entre los dos sitios lox. Varias líneas de animales transgénios, particularmente ratones, están disponibles actualmente en la materia, los cuales expresan la recombinasa cre de manera restringida a desarrollo o tejido, véase por ejemplo Tsien, Cell, Vol.87(7):1317-1326, (1996) y Betz, Current Biology, Vol.6():17-1316 (1996). Estos animales pueden cruzarse con los animales transgénicos lox de la invención para examinar la función del gen Peg3. Un mecanismo de control alternativo consiste en proporcionar un promotor correspondiente al gen de resistencia a tetraciclina, tet, en las regiones control del locus de Peg3 de forma que la adición de tetraciclina a una célula provoca la unión al promotor y bloquea la expresión del gen Peg3. De forma alternativa pueden usarse GAL4, VP16 y otros transactivadores para modular la expresión Peg3, incluido el de un transgen que contenga el gen Peg3. Además Peg3 puede expresarse también en sitios ectópicos, es decir en regiones en las la expresión del gen en términos de espacio y tiempo es nula. Las técnicas de recombinación homóloga para la obtención de transgénicos también pueden utilizarse para delecionar el gen Peg3. Brenner y col., patente internacional WO94/21787 (Cell Genesys) describen procedimientos de delección dirigida de genes diana, cuya discusión se incorpora aquí por referencia. Otra alternativa es insertar en el gen del Peg3 un vector que proporcione la expresión de un gen de tipo salvaje truncado a través del ayuste del mrna de un exón en el sitio aceptor en una secuencia no correspondiente con el gen Peg3. Puede hacerse referencia a ejemplos para la producción de ratones transgénicos adecuados en los cuales el gen se inactiva al ser interrumpido por la introducción de un vector que consta de un gen marcador y un codón de parada. El vector de recombinación homóloga utilizado para ilustrar la presente invención contiene: (1) Un sitio aceptor de ayuste en el extremo, que permite la inserción de un casete de selección βgeo dentro de un intrón; (2) un codón de parada de la traducción en las 3 pautas de lectura que asegure el término de la traducción prematura del gen diana; (3) un sitio de entrada al ribosoma (IRES) localizado cadena arriba de βgeo, que permite reiniciar la traducción de forma preferente en el AUG de βgeo en el transcrito de fusión independientemente del inicio de 4
traducción en el gen endógeno (Mountford y Smith, Trends in Genetics II, 179-184, 199); (4) un gen βgeo sin promotor que consiste en una fusión en la misma pauta de lectura entre los genes bacterianos lacz y neo, que codifica para una proteína bifuncional que permite tanto la selección de los clones obtenidos por recombinación homóloga y el análisis del patrón de expresión del gen diana durante el desarrollo; y () una señal de poliadenilación de SV próxima al extremo del casete de término de la transcripción del gen de fusión. Se pueden preparar construcciones similares por los expertos en la materia para proporcionar vectores que permitan la inactivación del locus de Peg3. En una de las construcciones de genes diana modificados por recombinación homóloga, el casete βgeo se inserta cadena abajo del sitio de inicio de la traducción en el exón 3. Ello proporciona una proteína truncada que puede detectarse en la progenie. Se pueden usar procedimientos análogos en otros ratones o en mamíferos no humanos, incluyendo el uso de otras proteínas marcadoras, tales como las luciferasas, la cloramfenicol acetil transferasa o la proteína verde fluorescente (GFP). Animales transgénicos que expresan Peg3 2 3 En un aspecto adicional de la invención, se proporciona el uso de animales no humanos que expresa Peg3 a niveles superiores al animal de tipo salvaje. Preferentemente esto significa que el gen Peg3 se expresa al menos un 1-0% respecto al nivel encontrado en los animales de tipo salvaje de la misma especie, cuando se comparan células que expresen el gen (p.ej., el hipotálamo). También puede expresarse este gen en una localización ectópica en donde normalmente su expresión en términos de espacio y tiempo es nula. Las comparaciones deben hacerse convenientemente por transferencia de Northern y cuantificación del nivel del transcrito. El mayor nivel de expresión más elevado puede deberse a la presencia de uno o más, por ejemplo dos o 3, copias adicionales de Peg3 o por una modificación de los genes Peg3 que proporcione una sobreexpresión, por ejemplo introduciendo un promotor fuerte o un intensificador de la transcripción unido operativamente con el gen de tipo salvaje. La producción de animales con copias adicionales de genes puede obtenerse utilizando las técnicas descritas aquí para la obtención de animales animales knock-out. En otro aspecto de la invención, se utilizan animales en los que el gen Peg3 se expresa en una localización ectópica. Esto significa que el gen se expresa en un lugar o en un momento del desarrollo inhabitual en el animal de tipo salvaje. Por ejemplo, el gen puede estar asociado a un promotor regulado por el desarrollo como el Wnt-1 y otros (Echeland, Y. y col., Development 1,2213-2224, 1998; Rinkenberger, J. C. y col., Dev. Genet. 21, 6-, 1997), o un promotor específico de tejido como HoxB (Machonochie, M.K. y col, Genes & Dev 11, 188-189, 1997). En este aspecto de la invención, se pueden utilizar animales como modelos en el desarrollo de ensayos para moduladores de obesidad, regulación de la temperatura, o trastornos del comportamiento. Dichos animales pueden servir como grupos control adicionales para ensayos de la invención que comprenden un gen Peg3 inactivo. Animales no humanos 4 0 6 Los animales no humanos de la invención pueden ser homocigotos o heterocigotos para el gen Peg3 inactivo. Si se utilizan animales heterocigotos, es preferible que el animal herede del padre el gen inactivo (o de lo contrario modificado para su expresión). Ya que el gen Peg3 de origen materno está reprimido y por lo tanto silenciado. Sin embargo, los heterocigotos en los que el gen modificado se hereda de la madre también forman parte de la invención. Los animales mamíferos, incluyen los primates no humanos, los roedores, los conejos, los corderos, las vacas, las cabras y los cerdos. Los roedores incluyen los ratones, las ratas y los cobayas. Los anfibios incluyen ranas. También pueden utilizarse peces como el pez cebra. Los mamíferos transgénicos no humanos de la invención pueden utilizarse con propósitos experimentales en estudios de obesidad, termoregulación o trastornos del comportamiento, y en el desarrollo de terapias designadas para aliviar los síntomas o la progresión de aquellas condiciones causadas por un defecto en el gen Peg3. El término experimental se refiere a aquello que es permisible para su uso en animales de experimentación, o a objetivos de análisis bajo la legislación vigente aplicable a las instalaciones de investigación donde se lleve a cabo tal experimentación. Procedimientos de análisis La invención puede emplearse en procedimientos diseñados para analizar moduladores putativos del peso, la regulación de la temperatura o el comportamiento. En general, un grupo de ensayo de animales transgénicos no-humanos debe ser analizado junto con un grupo de animales control de la misma especie y preferentemente de la misma cepa, que también tenga una copia inactiva del gen Peg3, y opcionalmente un grupo control de animales de tipo salvaje. Los animales de todos los grupos deberán recibir una dieta que podrá ser hipo, hiper, o isocalórica, y deberá analizarse y compararse con los grupos controles adecuados la ganancia o pérdida de peso. Habitualmente, a los animales en ensayo se les proporciona un exceso de comida, cuya ingesta debe ser deter-
minada midiendo la diferencia entre el alimento proporcionado y el que queda después de un periodo de tiempo determinado. 2 3 4 0 6 El modulador putativo puede ser cualquier sustancia candidata que pueda estar implicada en la regulación del peso, la temperatura o el comportamiento. Por ejemplo, entre las sustancias candidatas se encuentran hormonas, u otros péptidos (incluyendo por ejemplo la leptina, la insulina, la hormona tiroidea y el TNF), (Huang, Q y col., Endocrinology 139, 24-32, 1998; Hwang, C. S. y col., Ann. Rev. Cell. Dev. Biol. 13,231-29, 1997), prostaglandinas, los compuestos químicos de origen sintético o natural, por ejemplo los extractos de plantas, los esteroides, las benzodiacepinas, las dexfluoroanfetaminas u otros derivados anfetamínicos (Popovich, N. G. y col., J Am Pharm. Assoc. Wash. 37,31-39,1997). Los compuestos se pueden administrar a los animales a analizar a través de cualquier vía adecuada, por ejemplo por vía oral o por inyección intravenosa, aunque no excluyen otras vías (p.ej., la vía bucal, nasal, transdérmica, rectal etc.). La dosis del modulador putativo dependerá de su naturaleza y potencia, y su selección puede realizarse por el experto en la materia, teniendo en cuenta la naturaleza de las sustancia a analizar. En uno de los aspectos preferidos de la invención, los animales a analizar se utilizarán en el ensayo de moduladores putativos del peso. Sin embargo, también será útil el estudio de otros efectos fenotípicos del Knock-out de Peg3. Por ejemplo, los moduladores putativos que restauran su propia termorregulación, o compensan una reducción de la temperatura, (Gong y col., J. Biol. Chem. 26, 24129-24132,1997) pueden ser útiles en el tratamiento de condiciones como la hipotermia o la pirexia de cualquier origen, por ejemplo pirexia debido a la estimulación de endotoxinas en procesos infecciosos. (Doig, G. S. y col., Crit. Care. Med. 2, 196-1961, 1997), pirexia asociada con necrosis celular o hiperpirexia como consecuencia de la administración de halotano u otro fármaco (Kim, S. H. y col., J. Trauma 44,48-491, 1998). Adicionalmente, los efectos fenotípicos en el comportamiento, particularmente en el comportamiento materno, pueden utilizarse como un determinante en el desarrollo de terapias farmacológicas contra la depresión, incluyendo la depresión postparto u otros trastornos del comportamiento. Los efectos fenotípicos pueden ser usados también en el desarrollo de terapias para modificar el olfato, la cognición y el comportamiento masculino. En un aspecto adicional, la invención proporciona el uso de animales transgénicos con un gen Peg3 inactivo o modificado. La manipulación de la función de Peg3 o la administración de compuestos reguladores del peso a dichos animales transgénicos puede provocar una alteración del cociente grasa/músculo en el ganado doméstico. En un aspecto adicional de la invención hemos observado que en el núcleo preóptico del hipotálamo de nuestros animales transgénicos se localiza un número significativamente menor de neuronas que contienen menos oxitocina que los animales control. Esto sugiere que ninguna de esas neuronas se han formado o que, en gran medida, pueden haber degenerado a través de un o varios procesos. Peg3 puede ser, por tanto, importante en el control de la muerte o la degeneración celular, particularmente en el sistema nervioso. Por consiguiente, la presente invención proporciona animales transgénicos para procedimientos de análisis de compuestos con la capacidad de aumentar o disminuir la degeneración de neuronas en el cerebro u otros tejidos. La cuantificación de la actividad, la cantidad o la integridad de Peg3 puede también servir como diagnóstico o para establecer el estadio de enfermedades que impliquen la muerte y la degeneración celular, como la enfermedad de Alzheimer. Además, los compuestos que alteran la degeneración celular a través de la vía de Peg3 pueden emplearse en procedimientos para el tratamiento del cáncer. Por consiguiente, en otra realización de la invención, los animales transgénicos pueden utilizarse en un procedimiento para analizar el potencial carcinogénico de compuestos mediante la administración de la sustancia a analizar a un animal transgénico de la invención y determinando si dicho animal ha incrementado el riesgo de desarrollar tumores en comparación con los controles no transgénicos y/o con los controles de transgénicos no tratados. Los animales de la presente invención pueden ser utilizados también como receptores de xenógrafos, particularmente xenógrafos de células tumorales humanas. El FXC de los compuestos anti-tumorales candidatos puede entonces analizarse en dichos animales transgénicos para determinar el mecanismo de acción del compuesto analizado y determinar si dicho mecanismo de acción se produce a través de una vía regulada o requiere Peg3. Cribaje génico La identificación de Peg3 como regulador del peso, la temperatura y el comportamiento proporciona un medio para identificar más genes que puedan interaccionar con Peg3 para regular los fenotipos observados. Por tanto, la invención proporciona procedimientos de ensayo y mecanismos para conseguir este propósito. Generalmente, dichos ensayos están basados en la detección de la interacción a nivel de proteína Peg3 con otras proteínas. Un sistema para alcanzar este objetivo es el uso de un sistema de ensayo de doble híbrido. Los ensayos de doble híbrido pueden estar de acuerdo con los descritos por Fields y Song, 198 Nature 3;24-246. En dichos ensayos, el dominio de unión al DNA (DBD) y el dominio de activación transcripcional (TAD) del factor de transcripción GAL4 de levaduras se fusionan con la primera y la segunda moléculas, respectivamente, cuya interacción se está investigando. Un factor de transcripción GAL4 funcional sólo se restaura cuando interaccionan las dos moléculas de interés. Por tanto, la interacción de las moléculas puede cuantificarse mediante el uso de un gen reportero unido operativamente al sitio de unión del DNA de GAL4, el cual es capaz de activar la transcripción de dicho gen reportero. Se pueden utilizar otros dominios activadores transcripcionales en lugar del GAL4 TAD, por ejemplo el dominio de activación 6
viral VP16. En general, se pueden preparar, proteínas de fusión que comprenden dominios de unión a DNA y dominios de activación. En el caso presente, los polipéptidos de la invención pueden expresarse como proteínas de fusión con un dominio apropiado y los segundos polipéptidos candidatos con quienes han de asociarse los polipéptidos de la invención pueden producirse como proteínas de fusión con el dominio apropiado correspondiente. Esto se puede llevar a cabo en células adecuadas, tales como líneas celulares de levaduras, insectos o mamíferos. Como alternativa se pueden analizar librerías, p.ej., librerías de expresión en fagos de dichas proteínas de fusión con un polipéptido de fusión de la invención. El uso de la estrategia del doble híbrido permite el aislamiento del gen (o al menos una porción del mismo que pueda utilizarse para clonar el gen completo) que codifica la proteína que interacciona con la proteína Peg3. Un enfoque alternativo es la inmunoprecipitación. Se pueden preparar anticuerpos contra Peg3 y usarlos para inmunoprecipitar esta proteína a partir de las células en las que se produce, en condiciones que faciliten la coprecipitación con Peg3. La proteína puede analizarse mediante química tradicional de proteína y a continuación su secuencia primaria puede emplearse para diseñar sondas que permitan clonarla. Como alternativa, la información sobre la secuencia primaria puede compararse con bancos de datos EST, para la obtención de genes candidatos. Las secuencias de ácidos nucleicos obtenidas mediante este sistema son un aspecto adicional de la invención. 2 3 4 0 6 Genotipos de Peg3 El descubrimiento de que Peg3 está asociado con los trastornos fenotípicos mencionados aquí permite el desarrollo de marcadores genéticos para determinar la susceptibilidad de un individuo a la obesidad u otros trastornos. Por tanto, en un aspecto adicional de la invención el gen Peg3 de sujetos obesos, incluido el hombre, puede ser analizado y comparado al gen encontrado en individuos no obesos. En el caso del hombre, los individuos obesos son preferentemente aquellos con un índice de masa corporal (IMC calculado como el peso (kg) dividido por la altura (m) al cuadrado) por encima de 2, y preferentemente por encima de. Es posible analizar el ácido nucleico, bien el mrna de células que expresan Peg3 o bien el DNA de cualquier célula mediante cualquier procedimiento adecuado y con ello detectar las variaciones individuales. Dichos procedimientos adecuados incluyen la determinación de la los polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción (RFLPs), los polimorfismos de productos de PCR (p.ej., la longitud de una región amplificada del gen producida usando un par de cebadores), la secuenciación directa de todo o parte del gen o el análisis de heterodúplex. Uno o más de uno de estos procedimientos puede usarse para determinar aquellas características del gen Peg3 en individuos obesos que estén asociadas a la obesidad. De forma similar, también se pueden determinar asociaciones con otros trastornos. La asociación no tiene porqué hallarse en el 0% de los sujetos obesos y en el 0% de los no obesos. Los marcadores predictivos de características fenotípicas pueden ser aquellos que se encuentren con mayor frecuencia en la población objeto de estudio frente a los controles. Por tanto, se pueden desarrollar marcadores para indicar un incremento en el riesgo de obesidad u otros rasgos asociados con la deficiencia en Peg3, con lo que los individuos de bajo riesgo podrían ser tratados antes de la aparición de los síntomas. De forma análoga, se podría analizar la presencia de proteína Peg3 en aquellos individuos que muestren síntomas de cualquiera de los trastornos asociados con la inactivación de Peg3, por ejemplo usando anticuerpos contra la proteína. Los anticuerpos pueden obtenerse mediante técnicas estándar. Entre los procedimientos para la producción de anticuerpos se incluye la inmunización de un mamífero (p.ej., ratón, rata, conejo) con un polipéptido de la invención. Los anticuerpos pueden obtenerse a partir de los animales inmunizados usando cualquiera de las técnicas conocidas, y analizados, preferentemente mediante la unión del anticuerpo al antígeno de interés. Por ejemplo, pueden usarse las técnicas de transferencia de Western o la inmunoprecipitación. (Armitage y col, Nature, 37:80-82, 1992). Como alternativa o complemento a la inmunización de un mamífero con un péptido, puede obtenerse un anticuerpo específico para una proteína recombinante a partir de una librería de expresión de los dominios variables de inmunoglobulinas p.ej., usando el bacteriófago lambda o el bacteriófago filamentoso que expresa dominios de unión de inmunoglobulinas funcionales en su superficie; por ejemplo véase la patente internacional WO92/047. Los anticuerpos según la presente invención pueden modificarse de muy diversas formas. En realidad el término anticuerpo debería ser interpretado como toda aquella sustancia capaz de unirse a otra que tenga un dominio de unión con la especificidad requerida. Por tanto, la invención abarca los fragmentos de anticuerpo capaces de unirse al antígeno o a otra pareja de unión como un fragmento Fab consistente en los dominios VL, VH y CHI; el fragmento Fd que consiste en los dominios VH y CHI; el fragmento Fv que consiste en los dominios VL y VH de un brazo simple de un anticuerpo; el fragmento dab que consiste en un dominio VH; las regiones CDR aisladas y los fragmentos F (ab )2, un fragmento bivalente que incluye dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la región bisagra. También se incluyen los fragmentos Fv de cadena sencilla. 7
2 3 Los anticuerpos pueden prepararse contra epitopos de la proteína Peg3 y pueden compararse sus diferencias en la unión de los anticuerpos con muestras procedentes de individuos obesos (o aquellos que presenten hipotermia o sufran de un trastorno del comportamiento) e individuos control para determinar un epitopo cuya unión sea distinta entre los dos grupos. La identificación de ácidos nucleicos o marcadores proteicos del gen Peg3 asociados con la obesidad, la regulación de la temperatura, los trastornos del comportamiento, la apoptosis, la supervivencia celular o la resistencia a enfermedades infecciosas proporciona un aspecto adicional de la invención. Pueden usarse procedimientos de diagnóstico y marcadores sobre muestras de sujetos individuales, para determinar el riesgo para cada individuo de desarrollar una de estas condiciones, o el pronóstico de que se cree dicha condición. Por ejemplo, si se hallaran polimorfismos particulares como deleciones, truncamientos o sustituciones del gen Peg3 de tipo salvaje asociados a una de estas condiciones, entonces puede prepararse una sonda de ácido nucleico para detectar la presencia o ausencia del polimorfismo en particular. Las pruebas para detectar ácidos nucleicos consisten en general en poner en contacto una muestra corporal humana o de animal que contenga DNA o RNA con una sonda que comprende un polinucleótido o un cebador de la invención en condiciones de hibridación y detectar cualquier dúplex formado entre la sonda y el ácido nucleico presente en la muestra. Esta detección puede conseguirse usando técnicas como la PCR o inmovilizando la sonda sobre un soporte sólido, eliminando el exceso de ácidos nucleicos en la muestra que no hibriden con la sonda y por último detectando el ácido nucleico que ha hibridado con la sonda. Como alternativa, el ácido nucleico de la muestra puede inmovilizarse sobre un soporte sólido y detectarse la cantidad de sonda unida a tal soporte. Pueden encontrarse procedimientos de ensayo adecuados en muy diversos formatos, véase por ejemplo las patentes internacionales WO89/03891 y WO90/13667. Las sondas utilizadas en dichas técnicas pueden ser sondas cortas (por ejemplo de a 0, tales como 18 a 24 nucleótidos) capaces de hibridar con la secuencia de tipo salvaje y no con la secuencia asociada a la enfermedad o viceversa. La sonda puede empaquetarse en un equipo con reactivos adecuados de control, instrucciones y demás. En otra realización de la invención, la muestra de ácido nucleico puede tratarse de cromosomas completos, por ejemplo como una extensión de metafases. La sonda de ácido nucleico o el cebador de la invención pueden marcarse con un marcador fluorescente para detectar la localización cromosómica del gen Peg3 en la preparación cromosómica: Asimismo, los anticuerpos que son capaces de unir epitopos de Peg3 con significación diagnóstica pueden empaquetarse en un equipo con controles, instrucciones y demás. Son bien conocidos en la materia los procedimientos de inmunoensayo que por lo general consistirán en: (a) proporcionar un anticuerpo capaz de unirse a un epitopo de Peg3; (b) incubar una muestra biológica con dicho anticuerpo en condiciones que permitan la formación de un complejo antígeno-anticuerpo; y (c) determinar que se haya formado el complejo antígeno-anticuerpo que comprende Peg3. 4 0 Terapia con Peg3 La identificación de un papel para Peg3, tal como se describió anteriormente, proporciona una nueva diana para los agentes terapéuticos. Se pueden usar moduladores de Peg3 obtenidos mediante procedimientos de ensayo de la invención para el tratamiento de diversas condiciones, incluyendo, por ejemplo, la depresión, la alteración del cuidado materno, una termorregulación anómala y la obesidad. Esta última, en la forma de obesidad tardía puede manifestarse con la edad, debido parcialmente a los cambios en el equilibrio energético y a la falta de termorregulación y por tanto Peg3 constituye una diana terapéutica que vincula a ambos y que puede ser crítico para concebir tratamientos apropiados para tales condiciones. La identificación de alelos o polimorfismos de Peg3 en poblaciones humanas asociados con la obesidad proporcionará un medio para identificar individuos con bajo riesgo de obesidad en un estadio temprano, y por tanto puede proporcionar un tratamiento adecuado o introducir cambios en el estilo de vida que pueden reducir el efecto de un alelo o fenotipo de riesgo asociado. La invención se ilustra mediante los ejemplos siguientes. Material y metodología Construcción de los vectores para recombinación homóloga 6 A partir de dos librerías genómicas (λko y λps) (Nehls, 1994) de la cepa de ratón 129/Sv se aislaron clones genómicos del Peg3 usando como sondas los clones de cdna del Peg3. El inserto de DNA de los fagos se escindió en la forma de plásmido (en PKS-) después de la infección de la cepa de E. coli BNN132 que expresa la cre recombinasa. La estructura del gen Peg3 se estableció parcialmente; la posible pauta abierta de lectura empieza en el exón 3 y todos 8
los motivos de dedo de zinc estan codificados por el último exón codificante, el exón 9 (Li, 1997). Un clon genómico pb* que se expande desde el exón 3 al 9 del Peg3 se utilizó como el esqueleto para servir de vector de recombinación homóloga. Un fragmento de 4.8 kb generado por digestión con XhoI del casete de selección IRES-βgeo a partir del pifstop se insertó en el sitio XhoI del PB* en la misma orientación transcripcional que Peg3 para generar el vector de recombinación homóloga Peg3 βgeo. Electroporación y rastreo de los clones de células ES 2 3 Las células ES se manipularon fundamentalmente, tal y como se describió previamente (Robertson, 1987; Joyner, 1993). Las células R1 ES (Nagy 1993) se cultivaron sobre una capa basal de células que proporcionan nutrientes consistentes en fibroblastos primarios embrionales (PEFs) tratados con mitomicina C en medio ES/LIF a 37ºC con un 6% de CO 2. Se electroporaron 0 µg del vector de recombinación homóloga linealizado con NotI en 7 células ES en 1 ml de medio de cultivo a 2 µf y V. A continuación, las células se cultivaron sobre una capa basal de células de alimentación NeoPEF en medio ES/LIF durante un día, seguido por la selección en presencia de 0 µg/ml de G418 durante días. Los clones resistentes se crecieron y expandieron por duplicado en placas de 24 pocillos, una para obtener material almacenado congelado y la otra para preparar DNA para realizar el análisis de transferencia de Southern. Generación de ratones quiméricos, heterocigotos y homocigotos Los clones ES obtenidos por recombinación homóloga se cariotiparon (Tada, M. y col EMBO J. 21, 6-6, 1997) y se inyectaron en blastocitos 2, dpc MF1 (o C7BL/6J), que fueron tranferidos a hembras pseudopreñadas. La progenie masculina quimérica se cruzó con hembras MF1 o (C7BL/6J) y la transmisión de la línea germinal de se reconoció por la capa de color agouti en la prole. Los heterocigotos que heredaron el alelo mutado del padre se detectaron por tinción con β-gal o mediante análisis de DNA por transferencia de Southern de la base de la cola o del saco vitelino (para embriones) o dedos de los pies (para neonatos a dpp). La progenie de los entrecruzamientos de heterocigotos se genotipó conmbinando la combinación la tinción con β-gal y, o bien la transferencia de Southern, o bien el análisis del DNA por PCR. Análisis por transferencia de Southern y Northern Los DNAs genómicos se aislaron usando la solución de lisis de Proteinasa K/SDS tal y como se describió por Hogan y col., (1994). El RNA total de los embriones o de las células ES se preparó usando el reactivo GIBCO BRL TRIzol y el RNA poli A se purificó usando el equipo de mrna directo Qiagen Oligotex TM. Los análisis de transferencia de Northern y Southern se realizaron en base a protocolos estándar (p.ej., Sambrook y col. 1992 citado anteriormente). Reacción de transcripción inversa acoplada a reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR) y PCR 4 0 La reacción de transcripción inversa se realizó usando 0,-1 µg de RNA total en un volumen de µl que contenía 1,0 µm de cebador hexámeros aleatorios, 1,0 U/µl de inhibidor de RNAsa, 1 X de tampón de reacción, y,0 U/µl de transcriptasa inversa MMLV (Clontech) a 42ºC durante 1h. La reacción de PCR se realizó usando 1 ml del producto de reacción de transcripción inversa o una dilución 1/0 en volumen de DNA de la cola (1 cm de longitud a dpp) en 0 ml de reacción que contiene 1x de tampón de PCR, 0 mm de dntp, 0, mm de cada cebador y 0,0 Unidades/ml de Taq DNA polimerasa (Boehringer Mannheim). La reacción se sometió a una etapa de desnaturalización (3 min a 93ºC), ó 3 ciclos [ s a 93ºC, s a (TM de los cebadores -ºC), y 1 min por kb de longitud de los productos de PCR a 72ºC] y una fase de extensión ( min a 72ºC). Se usaron los siguientes cebadores: Histología y análisis histoquímico Los embriones o tejidos se fijaron en formaldehído/pbs al 4% a 4ºC durante la noche: (para histología de rutina) o unas horas (para tinción β-gal e inmunohistoquímica para muestras de criosección). Tinción de β-gal de animales enteros Los embriones y tejidos se fijaron en solución de fijación (Formaldehído al 2%, glutaraldehído al 0,2%, NP- al 0,02%, MgCl2 a 1 mm y deoxicolato sódico a 0,24 mm en PBS) durante 1-2 h a 4ºC y se tiñeron con solución de tinción de β-gal (1mg/ml de X-gal, 4 mm de K 4 Fe(CN) 6, 2 mm de MgCl 2 y 0.02% de NP- en PBS), a ºC en la oscuridad hasta la aparición de color. A continuación, se fijaron los embriones en formaldehído al 4% en PBS a 4ºC, se deshidrataron y guardaron en etanol al 70%. Tinción β-gal de criosecciones 6 Los tejidos fijados se equilibraron en sacarosa al % en PBS a 4ºC durante toda la noche y se congelaron en hielo seco. Las secciones de mm de grosor se tiñeron con solución de tinción β-gal, a continuación se fijaron y se contratiñeron con eosina o rojo nuclear rápido. 9
Inmunohistoquímica La inmunotinción se realizó usando el equipo Vectastain ABC Elite. A continuación, las secciones se fijaron en formaldehído al 4% en PBS, se digirieron con tripsina al 0,2% durante min a temperatura ambiente y se bloquearon con la solución de bloqueo ABC durante 1h. Las secciones se incubaron con anticuerpos policlonales contra la prolactina de ratón (UCB), la hormona de crecimiento de ratón (UCB), o la hormona adrenocorticotrópica (ACTH 1-24) (Biogenesis) diluidos 00 veces en solución de bloqueo, Tritón X-0 al 0,3% y NaN 3 al 0,02% a temperatura ambiente durante la noche. Los anticuerpos se detectaron usando el sistema de IgG de cabra anti-conejo biotinilada/avidina DH/biotina conjugada con peroxidasa de rábano H/DAB-NI. Antes de incubar con peroxidasa de rábano H, las secciones se trataron con H 2 O 2 al 0,3% en metanol durante min para inactivar la peroxidasa endógena. Finalmente las secciones se deshidratan y montaron en DPX. Análisis del comportamiento materno 2 Se analizó el comportamiento materno de 3 grupos de hembras, hembras vírgenes de 0- días de edad, hembras primíparas en postparto reciente y hembras multíparas cíclicas (Yeo y Keverne, 1986). Las crías de las hembras en postparto fueron temporalmente extraídas de las jaulas. Tres crías recién nacidas se situaron separadamente en el lado opuesto del nido de cada hembra analizada y los materiales del nido se colocaron en el centro de la jaula. Durante los siguientes min, se registraron las respuestas de las hembras: (1) Recuperación: la hembra recogió una cría y la transportó a su zona de nido. (2) Construcción del nido: la hembra llevó materiales para el nido a su zona de nidificación. (3) Acomodamiento sobre las crías: la hembra cubrió las 3 crías y arqueó su espalda adoptando una postura de crianza. Se registraron los tiempos en recuperar la primera cría (latencia de recuperación) y en recuperar las 3 (tiempo de recuperación, en mostrar la construcción del nido (latencia de construcción del nido) y en acomodarse sobre las crías (latencia de acomodamiento). Comportamiento sexual masculino 3 4 Para analizar el comportamiento sexual masculino, se analizaron individualmente machos mutantes o vírgenes control con hembras en celo en una prueba de interacción estándar de minutos. Como alternativa, individuos control y machos mutantes vírgenes se introdujeron en una jaula grande con cinco hembras de las cuales sólo una estaba en celo. Se monitorizó la capacidad de los machos para detectar esta hembra y en iniciar el comportamiento sexual. Peso corporal y análisis de la alimentación Para este experimento los animales se analizaron individualmente para evitar competencia entre ellos, en condiciones estándares de estabulación: temperatura 21º±1ºC con renovaciones de aire/h e iluminación invertida (luces encendidas durante 1900 h, luces apagadas durante 700 h). Cada animal recibió 0 g de EXPANDED DIET. La comida se halló siempre en exceso. Cada animal recibió 0 g de RM3 de EXPANDED DIET. En intervalos semanales, se pesó la comida restante y se reemplazó por 0 g adicionales de alimento. El consumo medio fue 27-3 g/semana/ratón. En estos intervalos semanales los animales se pesaron y se registró su temperatura rectal a las 9:00 h de cada semana. Los machos control y los mutantes se agruparon por edad, la cual fue de 17 meses. Se monitorizaron durante un período de 16 semanas. Resultados Modificación del gen Peg3 por recombinación homóloga 0 6 Los análisis de RT-PCR indicaron que el Peg3 se expresa en células ES. Para inactivar el gen Peg3 y simultáneamente seguir su patrón de expresión,se construyó el vector para recombinación homóloga de Peg3 βgeo, el cual contiene un casete de selección sin promotor IRES-βgeo insertado en el exón del Peg3. El sitio de entrada al ribosoma interno (IRES) permite la iniciación traduccional preferente en el AUG del βgeo en el transcrito de fusión (Mountford y Smith, 199). Este casete consiste en los codones de parada traduccional en 3 pautas de lectura en el extremo y una señal de poliadenilación del SV en el extremo 3 para finalizar la expresión de genes endógenos y de fusión, respectivamente. El vector linearizado se electroporó en células R1 ES (Nagy y col., 1993). Se detectaron 17 de 8 (2%) clones resistentes a G418 como recombinantes homólogos mediante análisis de transferencia de Southern con una sonda externa y 3. La sustitución de copia simple de la construcción se confirmó usando un fragmento de βgeo. La alta frecuencia de recombinación homóloga obtenida reflejó el enriquecimiento selectivo tanto del promotor trap como de la función IRES. Generación de los ratones mutantes Peg3 βgeo Se inyectaron dos clones con un número normal de cromosomas en blastocitos MF1 y otros cuatro, en blastocitos C7BL/6J. Los machos quimeras se cruzaron con hembras MF1 (o C7BL/6J). Los machos quimeras con un 0% de transmisión germinal se aparearon con hembras 129/Sv para establecer el alelo Peg3 βgeo en un fondo genético
2 endogámico. Como la expresión de Peg3 procede únicamente del alelo parental (Kuroiwa y col., 1996, ibid) es de esperar que el fenotipo de la mutación Peg3 βgeo y la expresión lacz se detecten tras la transmisión paterna de este alelo (De ahora en adelante, los heterocigotos que hereden Peg3 βgeo del padre o de la madre se nombrarán como ratones +/- o -/+ respectivamente). El ratón +/- se identificó con tinción con β-gal de los dedos de los pies o por análisis de transferencia de Southern del DNA de la cola. Estos fueron más pequeños y se recuperaron según la proporción Mendeliana esperada (0%). Además, el entrecruzamiento de ratones +/- segregó cuatro genotipos (+/+, +/-, -/+ y -/-) aproximadamente en una proporción de 1:1:1:1. La expresión de Peg3 en los embriones mutantes Peg3 βgeo se examinó mediante análisis de transferencia de Northern usando como sonda un cdna de Peg3 que hibrida en una región 3 del sitio de inserción β-geo. En los embriones +/+ y -/+ con una copia paterna intacta, se detectó claramente el mrna de Peg3 completo de 9kb. Por el contrario, en embriones +/- y -/- no se observó transcrito o sólo apenas. La misma membrana se rehibridó con el cdna de la GAPDH humana para confirmar que se usaron aproximadamente cantidades iguales de las 4 muestras. Por otro lado, un fragmento del casete βgeo hibridó con el transcrito mayoritario de -6 kb únicamente en los embriones -/- y en los mutantes -/-. El tamaño de este transcrito concuerda con el transcrito de fusión Peg3 βgeo esperado que termina en el sitio de poliadenilación del SV en el extremo 3 del casete βgeo. Análisis de RT-PCR adicionales detectaron transcritos aberrantes Peg3 βgeo en los embriones mutantes +/-: uno amplificado por el par de cebadores específicos para los exones 4 y 6 del Peg3 y flanqueando el sitio de inserción βgeo y el otro, por el par de cebadores específicos para neo y exón 6 y flanqueando el sitio de integración 3 de βgeo. La secuenciación del DNA reveló que en el primero se delecionó gran parte del casete βgeo y el exón y que al último le falta la mitad del extremo 3 del exón, ambos debidos a ayuste alternativo. No obstante, ambos transcritos contienen los codones de parada traduccional dentro de la pauta abierta de lectura de Peg3 que empieza en el exón 3. En este momento no se dispone de anticuerpos contra el extremo C-terminal de la proteína Peg3 y por tanto no podemos probar si Peg3 βgeo actúa como un alelo nulo real o como un hipomorfo. Sin embargo la función de Peg3 debe estar alterada debido a la dramática reducción observada en su transcripción. Expresión de Peg3 βgeo durante el desarrollo del ratón La expresión de lacz se examinó en heterocigotos +/- de Peg3 βgeo en varios estadios del desarrollo mediante tinción del animal completo con β-gal y/o criosección con inmunohistoquímica. Las muestras salvajes se tiñeron en paralelo y, a menos que más adelante se especifique lo contrario, no se observó actividad β-gal. Expresión de lacz durante la embriogénesis 3 4 La actividad β-gal se detectó en primer lugar débilmente en tejidos extraembrionales de forma temprana en embriones de postimplantación de 6, dpc. Más tarde, la tinción se observó en el saco vitelino, en las membranas amnióticas y coriónicas y en el alantoides, donde persistió durante el resto de la gestación. En embriones de 7, dpc, la actividad β-gal se encontró en el ectodermo del pliegue nucal, el mesodermo lateral y en la línea primitiva. Un patrón similar se observó para la expresión del mrna de Peg3 mediante hibridación in situ con el animal completo. En el estadio 8, dpc, la tinción de β-gal fue fuerte en las regiones prospectivas del intestino, débil en los somites y ausente en el tubo neural. En el estadio 9, y 12, dpc, el patrón de tinción se correspondía con el patrón de mrna de Peg3 descrito previamente por Kuroiwa y col., 1986, ibid; un nivel elevado de actividad se localizó en primer lugar en los tejidos derivados del mesodermo y del endodermo, tales como el intestino en desarrollo y el esqueleto. Zonas adicionales que mostraron expresión lacz fueron la base del limbo, las vesículas ópticas y de audición y la superficie del ectodermo. Expresión de lacz durante la vida postnatal 0 6 El patrón de expresión de lacz en neonatos fue similar al observado en los embriones, mientras que el patrón cambió considerablemente en la etapa adulta. La tinción de β-gal fue intensa en la lengua, costilla, musculatura intercostal, y en la pared intestinal de los neonatos, pero en los adultos las señales disminuyeron o quedaron retenidas únicamente en un subgrupo de células. Se detectó una actividad β-gal débil en el intestino de neonatos de tipo salvaje. Excepto en las regiones como el hipotálamo, donde es bien sabido que Peg3 se expresa intensamente (Kuroiwa y col., 1996), el cerebro mostró un nivel relativamente bajo de actividad β-gal en neonatos. Sin embargo, la actividad aumentó en el estado adulto. Se observó también una fuerte señal para β-gal en el atrium del corazón, la pitutitaria intermedia y anterior y en la médula adrenal, persistiendo los patrones de tinción durante la vida postnatal. No se detectó tinción β- gal en el timo, bazo e hígado. Reducción del crecimiento en mutantes Peg3 βgeo Los ratones Peg3 βgeo +/- fueron más pequeños que las crías del mismo sexo de tipo salvaje. Fueron enanos proporcionales como se demostró por el menor peso relativo de sus órganos (y cuerpos). Para determinar cuando se afectó su crecimiento, las crías de los cruces (+/+ x +/-) se pesaron en el estadio 1,, y dpp. En el estadio 1 dpp los mutantes +/- mostraron un peso de alrededor del 80-8% del peso normal. Esta proporción se mantuvo relativamente constante en los fondos de mezcla MF1/129/Sv o C7BL/6J/129/Sv, pero disminuyó hasta el 6% en el fondo endogámico 129/Sv en el momento del destete. Sin embargo los mutantes adultos 129/Sv alcanzaron el 80-8% del peso normal. También se analizaron las crías de los cruces (+/- x +/-) con un fondo genético MF1/129/Sv. Respecto a la tasa de crecimiento, los heterocigotos paternos (+/-) fueron similares a los homocigotos (-/-), mientras 11
que los heterocigotos maternos (-/+) fueron indistinguibles de los ratones de tipo salvaje (+/+); el primer grupo fue menor que el último. Un examen adicional durante la embriogénesis mostró que el retraso en el crecimiento de los embriones +/- fue aparente (8%) a 16 dpc pero significativo (%) a 18 dpc. Además, sus placentas fueron un -% menores en esos dos estadios. Estos resultados muestran que la transmisión paterna de Peg3 βgeo causó retrasos en el crecimiento fetal y placentario, así como un retraso en el crecimiento postnatal crías con fondo genético endogámico Alteración del comportamiento materno en hembras mutantes Peg3 βgeo 2 3 4 0 Sorprendentemente, todas las crías de los cruces iniciales entre mutantes 129/Sv +/- murieron en los primeros días, lo que no se observó con crías de fondo genético mixto. Las crías nacieron intactas y pudieron rescatarse por madres adoptivas, sugiriendo un problema con las madres mutantes +/-. Por tanto, las hembras mutantes se compararon con sus hermanas de tipo salvaje, respectivamente, apareadas con los machos mutantes con respecto a su capacidad de alimentar. (Tabla 1, +/- x +/- vs +/+ x +/-). de 12 (83%) hembras de tipo salvaje sacaron a flote sus primeras crías y un 68% de su progenie creció hasta el destete. Por el contrario, sólo 1 de cada 12 (8%) de las primeras crías y el 7% de las crías nacidas de madres mutantes sobrevivieron. Una disminución de veces en la supervivencia de las crías apoya el hecho de que el fenotipo es atribuible a la mutación Peg3 βgeo más que a un efecto de la pobre capacidad de reproducción de la cepa 129/Sv. Se obtuvieron resultados similares para hembras de meses de edad cuando se aparearon con machos de tipo salvaje (Tabla 1, +/x +/+vs +/+ x +/+); sólo 1 de 8 hembras mutantes amamantó a sus primeras crías comparadas con la mayoría (6/7) de las hembras salvajes. Esto confirmó que la muerte de las crías fue causada por las madres mutantes, algo que incluso ocurre en ausencia del padre mutante y las crías (Peg3 βgeo se silencia después de la transmisión materna) y mostró que el defecto en el amamantamiento de las madres mutantes era independiente de su tamaño. No obstante, su capacidad de amamantamiento mejoró al aumentar el número de partos; un 0% (/) de las hembras mutantes mostró capacidad de cría en el segundo y un 70% (7/) en el tercer parto. Se sabe que las crías de roedores, nacidas de forma inmadura, requieren considerables cuidados maternos incluyendo, por ejemplo, el proporcionar un nido cálido, el traslado de las crías al nido, el acomodarse sobre ellas y amamantarlas para que sobrevivan (Numan, 1994a). En contraste con las crías recién nacidas que normalmente son acicaladas por las madres, aquellas nacidas de hembras primíparas mutantes Peg3 βgeo se encuentran dispersas por las jaulas, lo que indica la falta de cuidado materno. Por lo tanto, analizamos el comportamiento maternal de las mutantes primíparas postparto (+/-) y las hembras de tipo salvaje hacia 3 crías recién nacidas. Las hembras salvajes recuperaron la primera y todas las crías en 28 ± 11,6 s y 190 ± 7 s, respectivamente. Por el contrario, las hembras mutantes necesitaron entre 11 y 3 veces más tiempo respectivamente, para llevar a cabo y completar este comportamiento. Después de 97,8±8 s tras ser presentadas ante las crías, las hembras salvajes empezaron a construir un nido mientras las hembras mutantes mostraron una latencia 8 veces más larga. Las hembras mutantes nunca mostraron el inicio del acomodamiento sobre las crías durante los 900 s de duración del análisis, mientras que las hembras de tipo salvaje lo hicieron al cabo de 390 ± 121 s. El deterioro en su respuesta materna no se debió a un fallo en la observación de las crías, puesto que las olisqueaban tanto como las hembras salvajes. Los ratones hembras que no están preñadas también mostraron un comportamiento materno aunque su respuesta no es tan inmediata como lo es en las hembras después del parto (Numan, 1994a). Para determinar si la mutación afecta al comportamiento materno fuera del contexto del parto, se examinaron hembras vírgenes y multíparas en ciclo. De acuerdo con el hecho de que la experiencia materna previa facilita la expresión del comportamiento materno (Numan, 1994a), las hembras multíparas (con experiencia materna) mostraron una latencia intermedia entre las vírgenes y las hembras después del parto en muchas de las medidas analizadas tanto en el fondo genético de tipo salvaje como en el Peg3 βgeo +/-. Cuando se compararon los dos genotipos, las hembras mutantes tanto con o sin experiencia requirieron tiempos más largos para recoger todas las crías y mostrar la construcción del nido. Aunque estas hembras en ciclo rara vez se acomodan sobre las crías dentro del tiempo del análisis, muchas (/6) de las hembras multíparas de tipo salvaje mostraron este comportamiento después de 1, h de exposición a las crías, mientras pocas (1/6) de las hembras multíparas mutantes lo hizo. Todos estos datos muestran que las hembras mutantes Peg3 βgeo fueron menos maternales que las de tipo salvaje a pesar de haber tenido partos previos. 6 12
2 La alteración de la respuesta materna después del parto puede contribuir a la muerte de las crías. 3 4 0 6 La alteración de la respuesta materno en las hembras mutantes Peg3 βgeo se correlaciona con una fuerte expresión de Peg3 en el cerebro adulto, lo que nos llevó a investigar más a fondo el patrón de expresión de Peg3 en cerebro. La expresión del mrna de Peg3, ampliamente distribuida en las regiones cerebrales, se observó fuertemente en el núcleo hipotalámico, incluido el área preóptica media (MPOA) así como en el sistema límbico, por ejemplo la amígdala media, la estría del núcleo basal, el hipocampo y la circunvolución dentada. Estudios realizados con experimentos de lesiones, o lesiones producidas por bisturí mostraron claramente la implicación de estas regiones en el comportamiento materno (Numan, 1994a). Este patrón de expresión del Peg3 observado aquí, sugiere que el gen puede actuar en aquellas regiones para afectar al comportamiento maternal. Uno de los marcadores moleculares usados para determinar los circuitos neuronales implicados en el comportamiento materno es la familia del gen Fos, ya que miembros de esta familia como c-fos y FosB se activan en el MPOA de hembras después del parto o hembras vírgenes a las que se les ha inducido un comportamiento materno tras ser expuestas a las crías. (Brown y col., 1996; Calamandrei y Keverne, 1994). Además ratones deficientes en FosB muestran un comportamiento materno alterado (Brown y col., 1996). Por ello, examinamos si los circuitos neurales activados por FosB-positivo son normales en los mutantes Peg3 βgeo. La inmunotinción con un anticuerpo contra FosB mostró que se produce un aumento en las células neurales positivas para FosB en las vírgenes mutantes tras ser expuestas a las crías con un nivel comparable al de las de tipo salvaje. Por tanto este circuito neural no parece verse afectado por la mutación Peg3 βgeo. A diferencia de la inducción de FosB, la tinción β-gal de criosecciones de cerebro de mutantes mostró un patrón similar al de la expresión de Peg3 sin que se detectara un cambio obvio tras la sensibilización materna hacia las crías. Además no se observaron anomalías anatómicas en los cerebros de los mutantes durante estos estudios. Reducción en las células productoras de oxitocina en las madres mutantes Peg3 βgeo Se observó que las crías de las hembras mutantes ganaban menos peso durante el período de lactancia, comparado con el correspondiente a las crías de madres de tipo salvaje. Esto puede deberse a la alteración de la respuesta maternal (descrita más arriba) y/o a problemas de lactancia en las hembras mutantes. Para analizar estas posibilidades, medimos la ganancia de peso de las crías nacidas de dichas hembras. Tras 2 h de separación de las crías, las madres mutantes fueron más lentas en adoptar el comportamiento de acomodación sobre las crías que las madres de tipo salvaje (,3 vs 8,7 min, p<0,004). Las crías de las hembras de tipo salvaje aumentaron de peso tras 6 h y 24 h. Por el contrario, las crías de las madres mutantes no ganaron peso al cabo de 6 h y sólo lo hicieron después de 24 h. Puesto que todas las crías se agarraron a los pezones 1 h después de la separación, el defecto en la ganancia de peso en el último grupo debe atribuirse a problemas de lactancia en las hembras mutantes. 13
Las hembras mutantes parece que tienen glándulas mamarias relativamente normales, como se deriva de su morfología histológica tanto en el preparto como en el postparto. La eyección de la leche depende tanto de la estimulación por succión realizada por las crías como de la función de la oxitocina. Se observó por inmunotinción que presentaban menos células que expresan oxitocina en el hipotálamo comparado con las hembras de tipo salvaje. Comportamiento sexual del macho El apareamiento de un macho y una hembra en celo en un análisis de interacción estándar de minutos no mostró diferencias significativas entre los machos Peg3 y los controles 129. Sin embargo, si se introduce un macho virgen en una jaula grande con hembras, de las que sólo una de ellas está en celo, se producen diferencias significativas entre el comportamiento de los machos mutantes comparado con los controles 129. Los machos mutantes mostraron interés por las hembras pero fueron mucho más lentos en la identificación de la hembra en celo y en la iniciación del comportamiento sexual. Latencia en el tiempo de monta (min) Machos mutantes 11,8 ± 0,96 t=2,3 df Machos control 8,03 ± 1,02 P<0,02 Peso corporal y alimentación 2 Se examinó el consumo total de comida, la ganancia de peso y la temperatura rectal en grupos de ratones transgénicos y controles. El grupo control ( animales) y el mutante (6 animales) se aparearon por edad y sexo (machos) (17 meses). Se monitorizaron durante un período de 16 semanas. Su peso, consumo de comida y la temperatura rectal se registraron en intervalos semanales. Esto resultó en una ganancia de peso marcada comparada con el grupo control (p>0,003), mientras que al mismo tiempo el consumo de comida de los animales mutantes fue inferior a la observada en los animales control. La temperatura corporal (rectal) de los ratones mutantes fue también significativamente inferior a la observada en los animales control p>0,00. Referencias 3 Nehls, M., y col (1994) Biotechniques 17,770-77 Li, E., y col (1993) Nature 36:362-36 Robertson, E. J., (1987). Teratocarcinoma and embryonic stem cells: A practical aproach., IRL Press, Oxford University Press, Oxford, UK. Joyner, Al., Ed (1993) Gene targeting. A practical aproach. IRL Press, Oxford University Press, Oxford, UK Nagy, A., y col (1993) Proc Natl. Acad. Sci. USA 90, 8424-8428 4 Hogan, B., y col (1994). Manipulating the mouse embryo. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York. Yeo, J. A. G. y Keverne, E. B., (1986) Physiol Behav.37, 23-26 0 Mountford, P. S. y Smith, A. G., (199) Trends-Genet. 199:11:179-184 Numan-M. y Numan-MJ., (1994) Behav-Neurosci. 1994 8:379-394 Numan M., (1994) Acta Paediatr Suppl 397:19-28 Brown y col., (1996) Cell 86:297-9 Calamandrei, G. y Keverne, E. B., (1994) Behav-Neurosci. 1994 Feb:8(1):113-1 6 14
REIVINDICACIONES 2 3 1. Procedimiento para el ensayo de posibles moduladores del peso corporal o la temoregulación que consiste en la administración de dicho posible modulador tanto a (a) un animal transgénico no humano que comprende una copia inactiva del gen Peg3 como resultado de una modificación genética o (b) un animal transgénico no humano que exprese Peg3 en niveles superiores al de los animales de tipo salvaje; y la determinación del efecto de este posible modulador sobre el peso corporal o la termorregulación de dicho animal no humano. 2. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en donde se determina el efecto sobre el peso corporal. 3. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en donde se determina el efecto sobre la termorregulación 4. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde dicho animal es un roedor.. Utilización de un animal no humano que comprende un gen como resultado de una modificación genética, teniendo alterada dicho animal la termorregulación y/o la regulación del peso comparado con un control tipo salvaje, para el ensayo de un posible modulador del peso corporal y/o de la termorregulación. 6. Utilización de acuerdo con la reivindicación, en donde el gen Peg3 está inactivo 7. Utilización de acuerdo con la reivindicación ó 6, en donde el gen Peg3 contiene una mutación. 8. Utilización de un animal transgénico no humano que expresa Peg3 na un nivel más elevado que el de tipo salvaje para el ensayo de un posible modulador del peso corporal y/o la termorregulación, en donde dicho animal presenta alteraciones en la termorregulación y/o el peso corporal comparado con un control de tipo salvaje. 9. Procedimiento in vitro para determinar la asociación del genotipo Peg3 en sujetos humanos o animales con obesidad o alteraciones en la termorregulación, el cual comprende: analizar el ácido nucleico Peg3 en una muestra de ácido nucleico que contiene el gen Peg3 de un grupo de sujetos obesos y un grupo control de sujetos no obesos; y determinar una o más características de dicho ácido nucleico asociado con el fenotipo obeso.. Procedimiento para determinar la asociación de un genotipo Peg3 en sujetos humanos o animales con obesidad o aberraciones en la termorregulación, el cual comprende: analizar la proteína Peg3 en una muestra corporal que contiene proteína Peg3 de un grupo de sujetos obesos y un grupo control de sujetos no obesos;y determinar una o más características de dicha proteína asociada con el fenotipo obeso. 4 0 6