Practica 4 Métodos para la determinación de grasas Antecedentes Los lípidos se encuentran ampliamente distribuidos en animales y vegetales, formado parte fundamental de membranas celulares. En los alimentos principalmente se encuentran en forma de moléculas de triglicéridos (3 ácidos grasos esterificados a una molécula de glicerol), y presentan diferente composición dependiendo de su fuente de obtención. Son un grupo complejo de moléculas que no necesariamente presentan similitud en cuanto a su estructura química. La característica principal es su insolubilidad en el agua y su alta solubilidad en disolventes no polares, tales como el éter etílico, hexano, benceno, cloroformo y derivados líquidos del petróleo. En el sistema proximal de análisis, las grasas o lípidos se miden como la fracción del alimento que es soluble en un disolvente orgánico. El material extraído contiene diferentes tipos de sustancias, y la variedad de éstas depende del disolvente utilizado. Los métodos más comúnmente usados para la extracción y cuantificación de grasas de los alimentos consisten en la extracción directa con uno o varios disolventes, utilizando un equipo de extracción. Otros métodos para su determinación, consisten en la extracción por solubilización, existen algunos métodos volumétricos y métodos físicos. Investigación previa 1. Investigar los tipos de moléculas que se incluyen en la categoría de lípidos. 2. Investigar cuál es el contenido promedio de grasa en la muestra que se va a analizar en el laboratorio. 3. Investigar al menos tres ventajas y tres desventajas de la extracción de grasas por Soxhlet, por mezcla de disolventes y la extracción por solubilización. Objetivos Conocer el uso del aparato de extracción Soxhlet y aplicarlo en la determinación de grasa en alimentos por el método extracción directa con un disolvente. Determinar el contenido de grasa en el alimento seleccionado mediante el método extracción con mezcla de disolventes.
Comparar los resultados obtenidos por los dos métodos utilizados Muestra a analizar: NOTA: La muestra debe haberse deshidratado previamente, y determinado su contenido de humedad. Procedimientos Para la realización de esta práctica se elegirán alimentos con contenido elevado de grasa como semillas (girasol, cacahuate, ajonjolí, nuez ), alimentos fritos (papas fritas, tostadas); cada una será analizada por duplicado por ambos métodos. I. Método de extracción directa con un disolvente (Soxhlet) También llamado determinación de lípidos crudos, grasa neutra o extracto etéreo; en este método, las grasas de la muestra son extraídas con éter de petróleo, en un equipo Soxhlet de extracción intermitente; posteriormente se evalúa como porcentaje del peso después de evaporar el solvente. Se debe tomar en cuenta que los valores obtenidos en esta determinación dependen en gran medida del método utilizado, por lo que para obtener resultados reproducibles, es importante seguir cuidadosamente el procedimiento indicado. Material Cantidad Descripción 2 Matraces de extracción (matraz de bola de 250 ml con cuello esmerilado) 1 Probeta de 100 ml 1 Desecador 2 Dedales de celulosa para extracción 1 Pinzas para crisol Reactivos
Cantidad Descripción 350 ml Éter de petróleo (40 60 C) 1 par Guantes desechables limpios ---- Papel filtro a peso constante Equipo Cantidad Descripción 1 Aparato de extracción Soxhlet 1 Estufa de secado (ajustar a 105 C) 1 Balanza analítica 1 Campana de extracción Procedimiento 1. Preparar los matraces de extracción con anticipación, ponerlos a peso constante y pesarlos en balanza analítica. 2. Pesar en un trozo de papel filtro a peso constante de 3 a 5 g de la muestra seca y molida, enrollar el papel con la muestra y colocarlo en un dedal. Colocar los dedales en la unidad de extracción. 3. Agregar a cada matraz 150 ml de éter de petróleo, y conectarlos al extractor. 4. Llevar a ebullición y ajustar el calentamiento de tal manera que se obtengan alrededor de 10 reflujos por hora. Permitir la extracción de las grasas durante 8 horas como mínimo. 5. Pasado el tiempo de extracción, tras el último reflujo, retirar el dedal con la muestra de la unidad de extracción (llevarlo a la campana de extracción). 6. Evaporar el éter del matraz por destilación. 7. Completar la evaporación colocando el matraz en la estufa durante media hora para eliminar completamente el éter. 8. Enfriar los matraces en un desecador y pesarlos. 9. Realizar los cálculos de porcentaje de extracto etéreo en la muestra. Peso de matraz con grasa (g) - Peso del matraz limpio (g) Extracto etéreo (%) = ---------------------------------------------------------------------------------- 100
Peso de la muestra (g) NOTA: el matraz de extracción y el dedal nunca deben tomarse directamente con las manos, sino mediante el uso de pinzas y guantes limpios. Lo anterior con la finalidad de no agregar grasa o humedad al mismo, lo que causaría un error en la determinación. La muestra desengrasada puede usarse para la determinación de fibra cruda. II. Extracción con mezcla de disolventes El método de Bligh y Dyer (1959), modificada por Hanson y Olley (1963) se basa en la homogenización de alimentos húmedos a través del uso de solventes como CHCl 3 y CH 3 OH en una proporción determinada, para formar una sola fase miscible con el agua del alimento. Posteriormente se agregan cantidades mayores de cloroformo y agua para separa los lípidos en la capa de cloroformo. La técnica se puede aplicar en alimentos con un contenido de humedad alrededor del 10%. Material Cantidad Descripción 1 Mortero con mano 4 Tubos para centrífuga de 50 ml 1 Espátula 3 Vasos de precipitados de 50 ml (a peso constante) 1 Desecador 3 Pipetas de 10 ml 1 Pipeta de 5 ml 3 Pipetas pasteur con perilla o jeringas 1 Probeta de 25 ml Reactivos Cantidad Descripción 100 ml CH 3 OH ---- Agua destilada 100 ml CHCl 3
---- Papel filtro grueso Equipo Cantidad Descripción 1 Balanza analítica 1 Centrifuga 1 Campana de extracción 1 Estufa de secado 1 Vórtex 1 Parrilla de calentamiento Procedimiento 1. Pesar y registrar el peso de los tubos para centrifuga de 50 ml. 2. Pesar en cada tubo de 1 a 2 g de muestra, finamente molida. 3. Añadir suficiente agua hasta un total de 4 ml. 4. Agregar 10 ml de CH 3 OH y 5 ml de CHCl 3. 5. Mezclar en vórtex durante 2 minutos. 6. Agregar 5 ml más de CHCl 3 y macerar por 30 segundos. 7. Adicionar 5 ml de agua y macerar por 30 segundos. 8. Centrifugar la mezcla por 10 minutos a 2000-2500 rpm. 9. Utilizando una pipeta Pasteur o jeringa tomar, hasta donde sea posible, la capa inferior del tubo centrifugado. Tener cuidado de no perturbar las capas sobrenadantes. 10. Medir el volumen de dicha capa y filtrar con papel filtro grueso. 11. Para determinar el extracto lípido total, con una pipeta toma 5 ml del filtrado claro y colócalo en un vaso de precipitados seco que este a peso constante. 12. Evaporar el CHCl 3 hasta sequedad dentro de la campana de extracción, sobre una parrilla de calentamiento a temperatura baja. 13. Completar el secado en una estufa a 100ºC durante 30 min. 14. Enfriar en desecador y pesar. 15. Calcular el porcentaje de grasa extraída de la muestra, tomando en cuenta el volumen total de la capa lipídica, el peso de la grasa en 5 ml (paso 14) y el peso de la muestra.
NOTA: El vaso de precipitados a peso constante no debe tomarse directamente con las manos, sino mediante el uso de pinzas y guantes limpios. Lo anterior con la finalidad de no agregar grasa o humedad al mismo, lo que causaría un error en la determinación. Registro de datos Datos de extracción de grasa mediante Soxhlet Muestra Peso de muestra seca (g) Peso del matraz (g) Peso inicial del dedal + muestra + papel (g) Peso final del matraz + grasa (g) Peso final del dedal + muestra+ papel % de grasa Promedio = Desv. Std. = Muestra Peso de muestra (g) Peso constante del vaso (g) Volumen total de extracto lipídico (ml) Peso final del vaso + grasa en 5 ml Peso de grasa en extracto total (ml) % de grasa Promedio = Desv. Std. = Cuestionario 1. Explicar la diferencia entre los métodos de extracción directa con un disolvente, el método con mezcla de solventes y los métodos de extracción por solubilización. 2. Qué modificaciones se puede hacer al método Soxhlet para optimizar la extracción y
determinación de grasa en un alimento? 3. Qué características se deben tomar en cuenta para la elección de un método de determinación de grasa? 4. Qué sucedería si la extracción de grasa por Soxhlet se realizara en la muestra húmeda? 5. Cuál es el papel de los lípidos en los alimentos? Datos y cálculos Desarrollo de la investigación previa Diagrama de flujo Cálculos Discusión de resultados Conclusiones Respuestas al cuestionario Referencias consultados