1. INTRODUCCIÓN La familia de las Orchidaceae, es uno de los grupos de plantas más numerosos del Reino vegetal, contando con más de 600 géneros y cerca de 17.000 especies, la mayor parte de las cuales son tropicales. Para Chile se han descrito siete géneros (HOFFMAN, 1998). Todas las orquídeas chilenas son geófitas, es decir, crecen en tierra, a excepción de una especie, en contraposición a las variedades tropicales que en su mayoría son epifíticas, es decir, que crecen habitualmente sobre los troncos de los árboles, pero sin extraer su alimento de ellos (HOFFMAN, 1998). Chloraea crispa, es una orquídea endémica de Chile, que presenta notables características para su uso como flor de corte, entre ellas destacan altura y duración después de cosecha (RENDICH 2001 y URIBE 2000). Por ser una orquídea presenta semillas de muy pequeño tamaño, contienen pocas reservas de alimento, germinan asociadas a un hongo del género Rhizoctonia la cual constituye una micorriza, formando una relación de simbiosis (MERSEY, 2003, BATTY, 2002 y MITCHELL, 1989). En esta especie, se logra identificar todas las etapas de germinación propuestas por MITCHELL (1989), quien distingue cinco estados durante el proceso, pasando de semillas que no presentan indicios de germinación, hasta protocormos que toman un color verde y comienzan a formar la primera hoja.
2 MERSEY (2003) indica que se logra obtener un protocormo sobre un medio de agar avena al 25 % inoculando el medio con Rhizoctonia, en dicho ensayo la formación de protocormos se obtuvo a 25 ºC y en oscuridad, sin embargo el período de aclimatización de las plantas fue de alta mortalidad. Las plántulas crecen en condiciones ideales de temperatura de 18ºC a 22ºC, con un régimen de luz de 16 horas luz y ocho horas oscuridad (BATTY, 2001 y MITCHELL,1989). Es de vital importancia que en la etapa de aclimatación se conserve una alta humedad relativa en torno a las plántulas, de este modo, se evita la deshidratación producida por el transplante e incentiva la formación de raíces (HARTMANN y KESTER, 1988). Los antecedentes de aclimatación son escasos, lo que conlleva a altas pérdidas, por esta razón, en esta investigación, se han planteado una serie de ensayos para evaluar diferentes formas de aclimatización. En el primer ensayo, el trasplante se realiza en las etapas dos y tres descritas por MITCHELL (1998) en un sustrato de tierra de hoja y perlita, los protocormos son sometidos a tres vías de aclimatación, las cuales incluyen desde una cámara de crecimiento con temperatura y luz controlada, hasta la utilización de un sombreadero. En el segundo ensayo, el trasplante se realiza en la etapa que obtiene mejores resultados del ensayo anterior, con la mejor vía de aclimatación, pero realizando un cambio en el sustrato, el cual varía de tierra y perlita a agar avena y arena. El tercer ensayo, se realiza en la mejor etapa y vía de aclimatación, con sustrato de agar avena y arena sometido a diferentes métodos de esterilización. El objetivo general fue determinar el efecto de estos sistemas en la sobrevivencia y crecimiento de las plántulas.
3 2. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 2.1. Antecedentes de la familia Orquidaceae: Las características generales de las Orquídeas son las siguientes: Hierbas perennes de forma muy variables. Las flores son trímeras, hermafroditas, zigomórficas, es decir, que es una flor irregular que tiene simetría bilateral, provistas de un ginostemo u órgano específico de las orquídeas, que corresponde a una prolongación del eje floral y sobre el cual están insertos los estambres. El fruto es una cápsula llena de numerosas semillas muy pequeñas (HOFFMAN, 1998). Las semillas de las orquídeas son conocidas usualmente como semillas polvo, ya que son muy pequeñas y contienen pocas reservas de alimentos (MCKENDRICK, 2000). Se encuentran entre las semillas más pequeñas de todas las plantas con flores, pesan entre 0,3 y 14 ug, y miden de 0,25 a 1,2 mm en largo y 0,09 a 0,27 en ancho, son producidas en un gran número, los rangos van entre 1.300 a 4.000.000 semillas por cápsulas (ARDITTI, 1967). Las semillas se componen de una testa muy dura que cubre un embrión de pocas células, las semillas de orquídeas no poseen endosperma, por lo tanto, prácticamente no tienen material de almacenamiento que puedan ocupar para su propia germinación y crecimiento (MITCHELL, 1989). Usualmente estas semillas no germinan en el medio natural a menos que sean infectadas por un hongo micorriza, el mismo que abastece a las plantas jóvenes con azúcares y nutrientes que necesitan hasta que sean lo suficientemente grande para fabricar su propio alimento (MCKENDRICK, 2000).
4 2.1.1. Antecedentes del género Chloraea El género Chloraea fue determinado por John Lindley en el año 1827, basándose principalmente en colecciones chilenas (CORREA, 1969). Las especies integrantes de este género son plantas terrestres que crecen exclusivamente en América del Sur. Se encuentran sobre todo en lugares húmedos de las zonas montañosas, pero también en lugares rocosos y arenosos bien expuestos (CORREA, 1969). En 1840 Lindley describió un total de 27 especies chilenas y del sur de Argentina (CORREA, 1969). 2.1.2. Especie Chloraea crispa CORREA (1996) describe a Chloraea crispa como una planta robusta de 40-70 cm de alto. Hojas de 15 cm de largo por 23 cm de ancho aproximadamente, lanceoladas, dispuestas en roseta basal y casi secas al momento de la antesis, Inflorescencia pauciflora de flores grandes, blancas y vistosas (Figura 1).
FIGURA 1. Flor e inflorescencia de Chloraea crispa. 5
6 Según CORREA (1969) Chloraea crispa ha sido descrita en Chile entre Concepción y Valdivia, en terrenos abiertos arenosos. Florece de octubre a enero y es una de las más hermosas del género, junto con Chloraea bletioides y Chloraea gavilu. Según URIBE (2000), Chloraea crispa presenta características en su inflorescencia, que potenciaría su cultivo para ser desarrollada como un producto comercial en el mercado de las flores de corte. Entre estas características se mencionan: Buena producción de botones por inflorescencia, 10 de ellos como mínimo. Buena apertura de flores, produciéndose tan sólo el aborto de un botón apical, lo cual es una característica deseada por tratarse de una inflorescencia única por planta. Buena duración de la inflorescencia, con un número alto de flores abiertas en forma simultánea (nueve flores como mínimo). Altura de vara floral de 90 cm, siendo además muy firme. RENDICH (2001) y URIBE (2000) señalan que a pesar de las sobresalientes características de la especie para usarla como flor de corte, presenta el inconveniente de florecer cada dos temporadas. Según URIBE (2000) el ciclo fenológico de la planta se extiende por 10 meses y dos semanas. De los cuales cinco meses corresponden a desarrollo vegetativo, cuatro meses y una semana para el desarrollo reproductivo y un mes para la senescencia de ésta.
7 2.2. Métodos de propagación: Mediante la germinación in vitro, se reproducen semillas en frascos de vidrio o plástico, sobre un medio de agar nutritivo que contiene los azúcares y minerales necesarios para que las semillas germinen y crezcan. Hay dos tipos de germinación in vitro: simbiótica y no simbiótica (MCKENDRICK, 2000). Las diferencias entre cultivo simbiótico y asimbiótico, están directamente relacionadas a la presencia del hongo micorriza en el cultivo (MITCHELL, 1989). En la germinación simbiótica, las semillas se siembran con una pequeña porción del hongo micorriza apropiado, perteneciente en este caso al género Rhizoctonia. El hongo crece en el medio, coloniza a las semillas en el proceso de germinación, se origina una relación simbiótica que se espera que alimente al protocormo hasta que este produzca hojas y se vuelva autotrófico. Esta técnica, es ampliamente usada para la propagación de orquídeas terrestres de zonas templadas. Tiene la ventaja de usar un medio simple (uno de los más comúnmente usados consiste en avena polvo con una pequeña cantidad de extracto de levadura), y como resultados las plantas micorrizadas suelen ser más fuertes y resistentes a infecciones que sus contrapartes cultivadas asimbióticamente. Sin embargo, la desventaja es que se necesita seleccionar el tipo de hongo micorriza adecuado para que se origine la simbiosis y prevenir parasitismo y la consecuente muerte de las semillas (MCKENDRICK, 2000). Uno de los mejores medios utilizados para la germinación simbiótica de las semillas de orquídeas es el avena básica al 25% recomendado por CLEMENTS et al. (1986). Este medio ha dado consistentes resultados durante varios años, pero puede ser fácilmente enriquecido o agotado según lo requerido, dependiendo del vigor del aislado fúngico (MITCHELL, 1989).
8 La germinación asimbiótica es usualmente usada en la propagación de orquídeas tropicales, las mismas que tienden a crecer fácilmente en comparación con sus parientes provenientes de zonas templadas. El medio usado para la germinación asimbiótica es más complejo que para la germinación simbiótica, ya que todos los nutrientes orgánicos e inorgánicos y los azúcares deben estar disponibles para la orquídea en una forma apropiada, puesto que ya no existe la intermediación del hongo (MCKENDRICK, 2000). 2.2.1. Recolección y desinfección de las semillas Las semillas pueden ser colectadas a partir de cápsulas verdes o cápsulas maduras. Una cápsula verde que está madurando, y está lista para ser sembrada, se encuentra llena de semillas y no se deforma cuando se aprieta con las pinzas (MCKENDRICK, 2000). Se pueden sembrar semillas a partir de cápsulas verdes o a partir de semillas secas. Si se realiza la siembra a partir de cápsulas verdes, se debe esterilizar la parte exterior de las mismas, donde hongos y bacterias pueden desarrollarse, y se abre la cápsula en condiciones estériles. La ventaja de este método es que no requiere la esterilización de las semillas, lo que podría provocar su deterioro (MCKENDRICK, 2000). Sin embargo, el método más usual es remover las semillas del fruto maduro cuando la dehiscencia se efectúa en forma natural y se les trata con un desinfectante, como peróxido de hidrógeno, o hipoclorito de calcio o de sodio diluido a una concentración de 0.5% hasta 5% (BATTY, 2001, MITCHELL, 1989, HARTMANN Y KESTER, 1988).
9 Para que el contacto entre la semilla y el desinfectante sea completo, se debe agregar un detergente a la solución (MCKENDRICK, 2000, MITCHELL, 1989). El tiempo de esterilización varía dependiendo de la especie, del tiempo de maduración, luego que la semillas es colectada, de las condiciones climáticas al momento de la colección, de los métodos de secado y almacenamiento (MCKENDRICK, 2000). MITCHELL (1989) informa haber esterilizado semillas con hipoclorito de calcio durante tres a cinco minutos. MERSEY (2003), sin embargo, indica que la desinfección, no es necesaria si el hongo micorriza adecuado está presente en el sustrato de siembra, sin embargo, la cantidad de semillas germinadas mediante cultivos simbióticos es mayor cuando estas son desinfectadas. Para realizar la esterilización de las semillas de orquídeas existen diferentes métodos, entre ellos: método de la jeringa, método del tubo y método del paquete. El método del tubo planteado por BATTY (2001), consiste en desinfectar las semillas dentro de un tubo y realizar el enjuague dentro de este mismo (Anexo 1). Para el método de la jeringa, la desinfección y enjuague de las semillas se realiza dentro de una jeringa (Anexo 2). Tiene como ventaja que su realización se puede llevar a cabo en un medio abierto no estéril, sin embargo, para realizar la posterior siembra de las semillas se requiere de un medio estéril (BATTY, 2001).
10 En el método del paquete planteado por MITCHELL (1989), las semillas son envueltas dentro de un papel filtro, el cuál es introducido a la solución desinfectante. La mayor ventaja de este método, es la baja manipulación de las semillas, sin embargo, se necesitan dosis altas de esterilizantes y detergente para que la solución desinfectante penetre el papel (Anexo 3). 2.2.2. Siembra de las semillas Antes de la siembra de las semillas en las placas petri en un medio de agar avena, es necesario la inoculación del hongo micorriza apropiado. La inoculación del hongo en las placas, se realiza desde un aislado del hongo, el cual se obtiene de plantas de la misma especie. Las placas petri por lo tanto son inoculadas con el hongo a través de un pequeño cubo de agar que contiene el hongo libre de toda contaminación. La siembra de las semillas ya desinfectadas se realizará una vez que el hongo infecte por completo la placa (BATTY, 2001). MCKENDRICK (2000), indica que después de la siembra los frascos, deben taparse con papel celofán estériles o cling-film para evitar la contaminación de las placas. Una vez que el hongo invade el interior del embrión de la semilla, se produce la germinación y formación de una masa indiferenciada de célula llamada protocormo. Es de vital importancia que la relación orquídea- hongo se conserve durante los estados tempranos del ciclo de vida de la planta ya que el protocormo enterrado no puede fabricar alimento por sí mismo.
11 Según MITCHELL (1989) en el proceso de germinación de las orquídeas existen cinco etapas bien definidas (Anexo 4). Etapa 0: no se presentan indicios de germinación en las semillas. Etapa 1: crecimiento del embrión y ruptura de la testa. Etapa 2: comienza el crecimiento del protocormo y las raíces. Etapa 3: el protocormo crece rápidamente y hay desarrollo de un brote. Etapa 4: los protocormos toman un color verde y comienzan a formar la primera hoja, el tiempo que demora en llegar a esta etapa es de dos meses aproximadamente. La etapa 3 según MITCHELL (1989) es el mejor estado para la transferencia a un nuevo medio. Las placas de germinación deben ser iniciadas tres meses antes del comienzo de la estación de crecimiento, de modo que las plantas del semillero estén listas para transferirse al invernadero, durante los meses más fríos del año, para compatibilizar el crecimiento del semillero con la fase natural de crecimiento ( BATTY y BRUNDET, 2001). 2.3. Transplante de las plántulas: La etapa de trasplante abarca la transferencia de la plántula del medio aséptico de cultivo al medio de vida natural en el invernadero y luego en su sitio final. Para que pueda sobrevivir debe pasar por un período de aclimatación.
12 Por tanto, se deben volver autótrofas, tienen que desarrollar raíces, brotes funcionales y aumentar la resistencia a la desecación y al ataque de organismos patógenos ( HARTMANN Y KESTER, 1988). Según BATTY y BRUNDET (2001) los protocormos deben ser transferidos en etapa 3 y 4, desde las placas de crecimiento a recipientes de policarbonato de 60 mm de alto por 100 mm de ancho con una capa de arena/agar. El recipiente de crecimiento de los protocormos, deberá ser incubado a 22ºC con un régimen de 16 horas luz y ocho horas oscuridad. Según MCKENDRICK (2000) las plantas crecen 4 cm bajo tubos fluorescentes de 20 watts en un cuarto de crecimiento regulado a 18ºC con igual régimen de luz. Seguido por la incubación en recipientes por tres meses, éstos pueden ser pasados a invernaderos por una semana previo a la remoción de la tapa. Las plántulas son endurecidas por cinco días antes de la transferencia al suelo. Según HARTMANN y KESTER (1988) durante el período inicial que sigue al transplante, son esenciales varias condiciones ambientales, entre ellas: El mantenimiento elevado de la humedad relativa durante dos a tres semanas, para proteger la planta de la desecación y permitir que inicie nuevas raíces y brotes. El segundo requerimiento, es un medio que permita un rápido enraizamiento, por lo tanto debe ser aireado y poseer buen drenaje. Un tercero, es la protección contra diversos organismos patógenos hasta que haya adquirido resistencia.
13 El cuarto factor, es el control del crecimiento durante el trasplante para superar el letargo o falta de crecimiento resultante. La fluctuación de temperatura entre el día y la noche y entre día y día es crucial. Las plantas que se desarrollan bajo temperaturas uniformes, no crecen ni florecen bien como las que crecen bajo un régimen de temperaturas fluctuantes entre el día y la noche (WHITE, 1996 citado por RENDICH, 2001).
14 3. MATERIALES Y MÉTODO 3.1. Ubicación del ensayo: Esta investigación, se realizó en la estación experimental La Palma, perteneciente a la Pontificia Universidad Católica de Valparaíso, ubicada en la Provincia de Quillota, V Región, Chile, entre el período de agosto 2003 y agosto 2004. Para alcanzar los objetivos propuestos, se realizaron tres ensayos. En el primer ensayo, se trasplantaron los protocormos en las etapa 2 y 3 descritas por MITCHELL (1989) en bandejas de cepellones con tierra de hoja y perlita y tres vías de aclimatación, que incluyen desde el uso de cámara de crecimiento hasta un sombreadero. En el segundo ensayo, el trasplante se realizó en la etapa 3 descrita por MITCHELL (1989) en recipientes de plástico transparente con agar avena y arena sin autoclavar, en este ensayo, se utilizó una vía de aclimatación. Finalmente en el ensayo tres, los protocormos fueron trasplantados en forma individual, en etapa 3 descrita por MITCHELL (1989) en tubos de vidrio con agar avena y arena autoclavada y se realizó un tipo de aclimatación.
15 3.2. Material utilizado: 3.2.1. Material vegetal El material utilizado correspondió a semillas de Chloraea crispa. Dichas semillas fueron recolectadas el 2002 en la localidad de Yumbel, VIII Región, siendo almacenadas por siete meses a 4ºC. 3.2.2. Hongo utilizado Para la micorrización de estas semillas, se empleó la selección denominado MN3, una especie del género Rhizoctonia que fue probado por MERSEY (2002). El hongo utilizado, proviene de orquídeas nativas de Chloraea crispa, de la localidad de Yumbel, VIII Región, el cuál fue aislado en un comienzo en la Universidad de Concepción ( MERSEY, 2002). 3.3. Preparación de las placas: El medio nutritivo utilizado en las placas, se preparó en base a agar avena al 25%, para ello en un vaso precipitado se añadieron 1000 ml de agua destilada y 25 g de avena (producto comercial Avena Quaquer), se calentaron y agitaron durante 20 minutos a 40ºC más menos 5 ºC en un agitador magnético (modelo ANC500). Luego la solución, se filtró con una gasa sobre otro vaso precipitado.
16 A la solución resultante, se le agregaron 8 g de agar común (agar agar bacteriológico, fabricado por Algamar), una vez que la solución se entibió, se le agregó el agar. La solución final se calentó y agitó hasta inicio de ebullición. Se esperó que la solución se entibiara y luego se midió el ph ajustándolo a 5,5 con HCL al 0,1%. Posteriormente para esterilizar el medio de cultivo, los 1000 ml se distribuyeron en cuatro matraces de 250 ml, los cuales fueron autoclavados por 20 minutos tapados con algodón y papel aluminio (Anexo 5). Terminado el período de esterilización, los matraces fueron llevados a la campana de flujo laminar, y el medio fue traspasado a placas de petri plásticas estériles (de 5 cm de diámetro), las cuales fueron envueltas en papel estéril y llevadas a refrigerador por seis días. Al séptimo día, las placas fueron inoculadas con el hongo NM3, esto se realizó en un medio estéril bajo la campana de flujo laminar, de modo de reducir la contaminación de las placas. En seguida fueron selladas con parafilm y llevadas a incubadora a 25ºC. El hongo al cabo de siete días cubrió por completo la placa. 3.4. Desinfección y siembras de las semillas: La desinfección de las semillas, se llevó a cabo utilizando el producto comercial Clorinda, el cuál posee una concentración de hipoclorito de sodio de un 5%.
17 Para preparar la solución desinfectante, se diluyeron 20 ml de Clorinda en 80 ml de agua destilada esterilizada, resultando una concentración final de 1% de hipoclorito de sodio. Las semillas fueron sacadas de la cámara a 4ºC, pesando conjuntos de 0,5 mg más menos 0,1 mg en una balanza de precisión, y luego fueron desinfectadas con la solución al 1% de Hipoclorito de sodio más dos gotas de Tween 80 (humectante), durante tres minutos a través del método del tubo planteado por BATTY (2001) y según las observaciones hechas por MERSEY (2002). Dos semanas después de la inoculación, las placas que no mostraban contaminación fueron sembradas con 0.5 mg de semillas de Chloraea crispa. Una vez sembradas las semillas en las placas estas fueron selladas con parafilm y puestas nuevamente en la incubadora a 25ºC (Figura 2). Un mes después de la siembra, se realizó el traspaso (repique) de las semillas que se encontraban al menos en la etapa 1 de germinación descrita por MITCHELL (1989). Las semillas fueron repicadas en forma individual, mediante una pinza de laboratorio a nuevas placas con agar avena no inoculadas, fueron selladas y puestas en cámara de crecimiento a 25ºC, de esta forma, se logra el repique solamente de semillas germinadas y no de un conjunto de semillas.
18 A B C D FIGURA 2. Pasos de la siembras de semillas de orquídeas. A: desinfección realizada a las semillas en tubos eppendorf, B: placa de petri con el hongo inoculado, C: siembra de las semillas y finalmente en D se observan los protocormos obtenidos de las semillas germinadas.
19 3.5. Trasplante y aclimatación de las plántulas: En esta etapa, se realizaron tres ensayo para evaluar estados de trasplante y vías de aclimatación de las plantas. Es necesario señalar que los ensayos se realizaron en períodos consecutivos y se adecuaron al resultado anterior. 3.5.1.Ensayo 1: Evaluación de dos etapas de trasplantes y tres aclimataciones El trasplante, se realizó en noviembre con los protocormos en los estados 2 y 3 descritos por MITCHELL (1989) para germinación de orquídeas, los cuales se sometieron a tres aclimataciones (ANEXO 6). La primera vía de aclimatación fue desde cámara de crecimiento, en que los protocormos se encontraban en oscuridad a 25ºC, a una cámara bioclimática programada con 16 horas luz y ocho horas oscuridad y a una temperatura de 16ºC la mínima y 22ºC la máxima, por dos semanas. Posteriormente, se trasladaron por dos semanas a una habitación ambiente, en este caso se trata del Laboratorio de Plantas Medicinales de la Facultad y finalmente pasaron al sombreadero del Área de Flores del la misma Facultad. Una segunda vía de aclimatación, fue desde la cámara de crecimiento a la cámara bioclimática por dos semanas y finalmente a una habitación ambiente. La tercera vía de aclimatación, fue desde la cámara de crecimiento, luego a una habitación ambiente por dos semanas y finalmente a sombreadero.
20 Para el trasplante, se utilizaron los protocormos que se encontraban en la etapa 2 comienza el crecimiento del protocormo y las raíces. En la etapa 3 el protocormo crece rápidamente y hay desarrollo de un brote, determinada en forma visual, para ello se tomó el protocormo con pinzas de laboratorios y fueron trasplantadas a bandejas de cepellones con cavidades de 16 cc, en un sustrato de tierra de hoja esterilizada y perlita con una proporción de 1:1. La bandeja de siembra se dispuso dentro de una caja de plástico transparente, cuyo fin, es mantener la humedad en el interior y evitar de esta forma la deshidratación de los protocormos en los primeros días después del trasplante, también tiene como finalidad el aislamiento de los protocormos disminuyendo la contaminación en el interior. La bandeja de siembra y la caja de plástico fueron desinfectadas con el producto comercial Clorinda. El transplante, se realizó en un ambiente no estéril, sin embargo, se tomó la precaución de desinfectar los implementos utilizados, mesa y manos con alcohol al 95% (Figura 3).
21 1 cm FIGURA 3. Bandeja de siembra en caja de plástico y altura en la base entre estas para permitir el drenaje.
22 En la base de la caja, se realizaron seis orificios, distribuidos equitativamente y que tuvieron por finalidad permitir la hidratación de los protocormos por infiltración desde la base, de esta forma, se realizó el riego sin la necesidad de abrir la caja, manteniendo el aislamiento (Figura 4). Entre la bandeja de siembra y el fondo de la caja de plástico, quedaron entre 1 y 2 cm de altura de manera de permitir el drenaje una vez que se realizó la hidratación. Se utilizó una bandeja de aluminio para el riego, en la cual se agregó el agua y poniendo luego la caja de plástico en su interior, el nivel de agua de la bandeja de aluminio, debió ser el suficiente para permitir el contacto del sustrato con el agua, de esta forma, se realizó el riego por capilaridad. Para determinar la frecuencia del riego, se tuvo como referencia el color del sustrato, el sustrato húmedo posee un color negro y cuando disminuye el contenido de agua se torna café claro, en ese momento se le proporcionó agua. El tiempo de riego, se determinó una vez que la superficie se encontró nuevamente de color negro, luego se eliminó el exceso de agua de las bandejas por los orificios de drenaje.
FIGURA 4. Bandeja de aluminio para implementar el método de riego por infiltración. 23
24 En este ensayo, se utilizaron 360 protocormos, de los cuales 180 se encontraban en etapa 2 y 180 en etapa 3. Los protocormos en estado 2 y 3 se distribuyeron respectivamente en nueve cajas de plástico con la bandeja de siembra, se trasplantaron 20 protocormos en cada unidad de siembra. En la etapa de aclimatación en condiciones ambientales, se realizaron en las cajas pequeños orificios en la parte superior. Cada mes, se realizó un orificio por caja. Las cajas permanecieron cerradas hasta el término del verano, para evitar la deshidratación de las plantas, en el mes de abril, se abrieron parcialmente las cajas y finalmente en el mes de mayo, se abrieron completamente. Las evaluaciones que se realizaron en este ensayo, correspondió al porcentaje de sobrevivencia de los protocormos al trasplante y al porcentaje de protocormos que llegaron a formar clorofila, lo cual, se determinó en forma visual por la aparición del color verde. El ensayo se condujo como un modelo factorial, con un diseño completamente al azar con dos factores. Factor 1: con tres niveles: * aclimatación 1 (cámara de crecimiento- cámara bioclimática- habitación ambiente-sombreadero) * aclimatación 2 (cámara de crecimiento- cámara bioclimática- habitación ambiente) *aclimatación 3 (cámara de crecimiento- habitación ambiente- sombreadero)
25 Factor 2: con dos niveles: * trasplante en estado 2 de crecimiento para semillas de orquídeas descrito por MITCHELL (1989). * trasplante en estado 3 de crecimiento para semillas de orquídeas descrito por MITCHELL (1989). El ensayo tuvo seis tratamientos con tres repeticiones cada uno, la unidad experimental estuvo constituida por un grupo de 20 plantas. Para determinar el efecto de los tratamientos, se realizó un análisis de varianza. Posteriormente, si hubo efecto de algún tratamiento, se aplicó un test de separación de medias de Tukey con 95 % de confiabilidad, para identificar diferencia (s) en los tratamientos. 3.5.2. Ensayo 2: Trasplante realizado en etapa 3, aclimatación 2 y sustrato de agar avena y arena En este ensayo, se usó el estado tres de trasplante que corresponde a un crecimiento rápido del protocormo con el desarrollo de un brote (MITCHELL, 1989) y se realizó aclimatación en conjunto de 20 protocormos empleando arena entre el medio de agar avena y el protocormo. El material utilizado, correspondió al mismo del ensayo anterior, la forma de preparación de placas y la desinfección de las semillas se repite en este ensayo.
26 Para el trasplante, realizado en febrero del 2004, se utilizaron las semillas que se encontraban en la etapa adecuada, determinada en forma visual, para ello, se tomó el protocormo con pinzas de laboratorios y fueron transplantadas a recipientes de plástico transparente de 7 cm de diámetro y 10 cm de alto. El sustrato utilizado correspondió a 1 cm de agar avena y 0,5 cm de arena. La preparación del agar, correspondió al mismo descrito en el primer ensayo. Para desinfectar la arena se hirvió durante cinco minutos en abundante agua. Los recipientes fueron preparados en una cámara de flujo laminar, con mechero, para proporcionar un ambiente aséptico y disminuir de esta forma la contaminación. Los recipientes con los protocormos trasplantados, fueron llevados a una cámara bioclimática con una temperatura constante de 16ºC la mínima y 22ºC la máxima, y con un fotoperíodo de 16 horas luz y ocho horas oscuridad. La hidratación de las plántulas, se realizó mediante un pequeño agujero realizado con una jeringa y con esta misma se proporcionó el agua, de esta forma se evitó la apertura de los recipientes. 3.5.3. Ensayo 3: Trasplante realizado en etapa 3 de desarrollo, aclimatación 2 y sustrato de agar avena y arena con dos diferentes métodos de esterilización El material vegetal fue el mismo mencionado anteriormente al igual que la preparación de las placas.
27 Se trasplantaron 50 protocormos en la etapa 3 descrita por MITCHELL (1998), en frascos de vidrio de 1 cm de diámetro y 5 cm de alto, estos poseían de sustrato agar avena y arena. El ensayo se dividió en tratamientos originados en la forma de esterilización del sustrato. TRATAMIENTO 1 (25 tubos) Preparación de agar avena y vaciado en tubos (1 cm c/u) TRATAMIENTO 2 (25 tubos) Preparación de agar avena y autoclavada en matraces de 250 ml por 20 minutos a 121ºC. Sellados de los tubos con papel aluminio Envueltos en papel de diario y autoclavados por 20 minutos a 121 ºC cuatro días Esterilización de los tubos y papel aluminio cuatro días El agar es vaciado a los tubos en una cámara de flujo laminar (1cm). Sellado de los tubos con papel aluminio Se abren los tubos bajo una cámara de flujo laminar, se agregan 0,5 cm de arena autoclavada con anterioridad 2 veces por 20 minutos a 121ºC. Hidratación de la arena y trasplante de los protocormos en estado 3 Sellado de los tubos
28 Los 50 tubos, se llevaron a una cámara bioclamática, con una temperatura constante de 16ºC la mínima y 22ºC la máxima y un fotoperíodo de 16 horas luz y ocho horas oscuridad. El trasplante, se realizó las primeras semanas de marzo del 2004 y se llevó a cabo bajo condiciones asépticas en una cámara de flujo laminar. Los protocormos, se mantuvieron dentro de la cámara bioclimática hasta la formación de la primera hoja, 45 días después fueron nuevamente trasplantados, esta vez a macetas de tamaño Nº5 (aproximadamente 100 cc), con un sustrato de tierra de hoja y perlita, autoclavada por 40 minutos a 121ºC, este segundo trasplante, se realizó bajo condiciones ambientales, sin descuidar la desinfección de pinzas, mesa, manos con alcohol 95% y el lavado de los maceteros con el producto comercial Clorinda. Una vez realizado el trasplante a los maceteros, estos fueron llevados a una habitación con temperatura ambiente, en este caso nuevamente se utilizó el Laboratorio de Plantas Medicinales de la Facultad. Cuando las plantas formaron la 3ª hoja, aproximadamente 60 días después, fueron llevadas al invernadero del Área de Flores de la Facultad. Las evaluaciones que se realizaron en este ensayo, correspondieron al porcentaje de sobrevivencia de los protocormos al trasplante, porcentajes de protocormos que formaron al menos una hoja, altura de las plántulas, y número de hojas de las plántulas.
29 El ensayo se condujo como un diseño completamente al azar con dos tratamientos (diferentes métodos de esterilización) y cinco repeticiones por tratamiento, la unidad experimental estuvo constituida por una planta. Para determinar el efecto de los tratamientos se realizó un análisis de varianza, posteriormente cuando hubo efecto de algún tratamiento se aplicó un test de separación de medias de Tukey con 95 % de confiabilidad, para identificar diferencia (s).
30 4. PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS 4.1. Resultados ensayo 1: Evaluación de dos etapas de trasplantes y tres vías de aclimatación: En la Figura cinco se visualiza el porcentaje de sobrevivencia de los protocormos al trasplante, realizados en los estados 2 y 3 descritos por MITCHELL (1989) para la germinación de orquídeas, utilizando la aclimatación 1, cámara de crecimientocámara bioclimática- habitación ambiente- sombreadero, aclimatación 2, cámara de crecimiento cámara bioclimática- habitación ambiente, y aclimatación 3, cámara de crecimiento- habitación ambiente- sombreadero. El trasplante se realizó la última semana de noviembre del 2003. Sólo la aclimatación 2, cámara de crecimiento- cámara bioclimática- habitación ambiente, permitió la sobrevivencia de los protocormos por 90 días aproximadamente. El Cuadro 1 detalla la sobrevivencia de los protocormos en estado 2 y 3 para la aclimatación 2. Las vías de aclimatación 1 y 3 no se utilizaron en el modelo estadístico por no presentar sobrevivencia al trasplante.
31 % de sobrevivencia 120 100 80 60 40 20 estado 2, vía 1 estado 2, vía 2 estado 2, vía3 estado 3, vía 1 estado 3, vía 2 estado 3, vía 3 0 0 30 60 90 120 150 días post trasplante FIGURA 5. Porcentaje de sobrevivencia de los protocormos trasplantados en dos estados de desarrollo. Sólo se observan tres líneas debido a que los protocormos aclimatados por la vía uno y tres ( en ambos estados de trasplante dos y tres ) presenta la misma curva de sobrevivencia, a los 30 días de trasplante la sobrevivencia es nula.
32 CUADRO 1. Porcentaje de sobrevivencia de protocormos en dos estados de desarrollo al momento del trasplante, evaluado en cuatro fechas. Aclimatados en la secuencia: cámara de crecimiento, cámara bioclimática, habitación. Protocormos 30 días 60 días 90 días 120 días Estado 2 75,0 a 48,3 b 26,6 a 1,7 a Estado 3 83,3 a 75,0 a 46,6 a 5,0 a Promedios con letras distintas en cada columna presentan diferencias significativas al nivel de probabilidad p=0.05 según Test de Tukey. Los estados 2 y 3 de desarrollo, presentaron similares porcentajes de sobrevivencia al trasplante en la aclimatación 2, cámara de crecimiento cámara bioclimáticahabitación ambiente. Sin embargo, existió diferencia significativa a los 60 días posttransplante. Ambos estados no fueron exitosos en la sobrevivencia de protocormos evaluados durante 120 días. En la Figura 6, se observa el porcentaje de formación de clorofila de los protocormos transplantados en estado 2 y 3 de desarrollo, en esta ocasión se eliminó la aclimatación 1, cámara de crecimiento- cámara bioclimática- habitación ambiente- sombreadero y la aclimatación 3, cámara de crecimiento- habitación ambiente- sombreadero, por no resultar exitosas para la sobrevivencia. Los protocormos trasplantados en estado 3 de crecimiento, fueron capaces de formar clorofila a diferencia de los protocormos en estado 2 de desarrollo. En el estado 3 los protocormos son capaces de evolucionar a otro estado de desarrollo, sin embargo, los protocormos que lograron la formación de clorofila no sobrevivieron en el tiempo (Figura 7 ).
33 La formación de clorofila en los protocormos trasplantados en etapa 3, a diferencia de los protocormos trasplantados en etapa 2, se debió a que los primeros se encontraban con el crecimiento de un brote al momento en que fueron trasplantados. En un comienzo los protocormos se encontraban en la cámara de crecimiento, la cual permaneció en oscuridad y con una temperatura constante de 25ºC. Luego del trasplante, los protocormos fueron sometidos a un régimen 16 horas luz y ocho horas oscuridad, con temperatura entre 16 y 22ºC. El estímulo de luz provocó la formación de clorofila en los brotes de los protocormos trasplantados en la etapa 3. Los protocormos en trasplantados en etapa 2 no lograron la formación de brote ni de clorofila.
34 % formación de clorofila 35 30 25 20 15 10 5 0 30 60 90 120 días Estado 2 Estado 3 FIGURA 6. Porcentaje de protocormos que llegaron a formar clorofila (color verde) trasplantados en estado 2 y 3 de crecimiento descritos por MITCHELL (1989) sometidos a aclimatización (cámara de crecimiento- cámara bioclimática -habitación a temperatura ambiente)
35 A B FIGURA 7. A: Protocormos trasplantados en estado 3 de desarrollo descrito por MITCHELL (1989) aclimatados mediante la vía dos ( cámara de crecimiento- cámara bioclimática- habitación ambiente). B: Formación de la primera hoja, obtenido de protocormos trasplantados en etapa 3 y con la vía dos de aclimatización.
36 Es interesante destacar, que aunque no se observó sobrevivencia de los protocormos luego de 120 días transcurrido el trasplante, los protocormos utilizados en la etapa 3 presentaron formación de clorofila, con lo cual, se podría decir que el estado 3 es el que presentó mejores resultados al trasplante. Esto concuerda con lo propuesto por MITCHELL (1989) quien indica que la etapa 3 es el estado óptimo de trasplante a una nuevo sustrato. La nula sobrevivencia de los protocormos a los 120 días, se pudo deber a la época de trasplante, por consiguiente a la temperatura y luminosidad. El trasplante de los protocormos desde las placas, se realizó a finales del mes de noviembre, aún cuando BATTY (2001) y MCKENDRICK (2002) aconsejan el trasplante en la época de crecimiento normal de la especie, en este caso corresponde a los meses de invierno. El trasplante de los protocormos no se realizó en la época óptima debido a la fecha en que se llevó a cabo la investigación. Por lo tanto eso pudo haber sido lo que gatilló la muerte de los protocormos, ya que el trasplante, se realizó en noviembre época en la cual las condiciones ambientales no son las apropiadas. Temperaturas registradas en la Estación Climatológica de Quillota, muestran máximas de hasta 33ºC en el mes de noviembre del año 2003 (Anexo 7), la habitación a la cual fueron llevados los protocormos presentó temperaturas entre 5-7ºC menos que las máximas registradas por la Estación climatológica, y el sombreadero a su vez presentó temperaturas 2-4 ºC menos en relación a las temperaturas máximas de la Estación. Los protocormos pasaron por lo tanto en pocos días de temperaturas de 16-22ºC ( temperatura de la cámara bioclimática) a temperaturas de hasta 31ºC (sombreadero).
37 Otra posible causa de la pérdida de protocormos, pudo ser el sustrato utilizado, los protocormos en las placas de petri se encontraban con agar avena y fueron trasplantados a tierra y perlita en relación 1:1, los protocormos trasplantados en las etapas 2 y 3 de desarrollo no presentaban crecimiento de raíces, por lo tanto el protocormo no logró fabricar alimento por sí mismo y dependió de la relación simbiótica con el hongo micorriza, sin embargo, el hongo no encontró en el sustrato una fuente rica en carbono, impidiendo de esta forma que la relación orquídea - hongo se mantuviera en el tiempo (SMITH, 1966 y RASMUSSEN, 1995). 4.2. Resultados ensayo 2: Trasplante realizado en etapa 3 de desarrollo, aclimatación 2 y sustrato de agar avena y arena. El trasplante de los protocormos desde las placas de petri a los recipientes de plástico con agar avena y arena se realizó en febrero del 2004, sin embargo a los 14 días del trasplante no se observó sobrevivencia de protocormos, esto se debió a una alta contaminación, a pesar que al séptimo día a partir del trasplante la totalidad de los protocormos presentaban clorofila. La contaminación, se debió probablemente a que la arena que se utilizó, se sometió a un proceso sencillo de esterilización, no autoclavada, en conjunto con la cantidad de protocormos trasplantados a un mismo recipiente, lo que provocó una contaminación en cadena, perdiendo en pocos días todos los protocormos.
38 4.3. Resultados ensayo 3: Trasplante realizado en etapa 3 de desarrollo, aclimatación 2 y sustrato de agar avena y arena con dos métodos de esterilización: El trasplante desde las placas de petri a los tubos de vidrio, se realizó en marzo del 2004, 45 días después, se realizó el trasplante desde los tubos de vidrio a los maceteros (Figura 8 y 9). En el Cuadro 2, se observa la sobrevivencia de protocormos al trasplante. El trasplante se realizó en el estado 3 de desarrollo descrito por MITCHELL (1989). Se evaluó dos tratamientos de esterilización, en el tratamiento 1, el agar se autoclavó en los tubos de vidrio que posteriormente fueron utilizados para el trasplante, y el tratamiento 2 de esterilización, en que el agar se autoclavó independiente de los tubos de vidrio y éstos se esterilizaron en forma separada. CUADRO 2. Sobrevivencia de los protocormos en estado 3 al trasplante, con dos tratamientos de esterilización del medio. 30 días 60 días 90 días 120 días Tratamiento 1 80 a 44 b 32 a 24 a Tratamiento 2 76 a 76 a 60 a 28 a Promedios con letras distintas en cada columna presentan diferencias significativas al nivel de probabilidad p=0.05 según Test de Tukey.
FIGURA 8. Plántulas obtenidas en el ensayo 3, y con el tratamiento 1 de esterilización ( agar autoclavado en los tubos de vidrio). 39
FIGURA 9. Plantas correspondientes al ensayo 3, y con el agar autoclavado en forma independiente del los tubos de vidrio. 40
41 No se observan diferencias significativas en la mayoría de las fechas evaluadas, sin embargo, en la evaluación realizada a los 60 días, se manifiesta un incremento en la sobrevivencia de los protocormos trasplantados en un medio esterilizado según el tratamiento 2. Finalizadas las mediciones a los 120 días, no hay diferencia entre la esterilización mediante el tratamiento 1 o 2. En el Cuadro 3, se observan las plántulas que lograron la formación de al menos una hoja (%). CUADRO 3. Efecto de dos tratamientos de esterilización del medio en el porcentaje de plantas que forman al menos una hoja. 30 días 60 días 90 días 120 días Tratamiento 1 28 a 36 a 32 a 24 a Tratamiento 2 52 a 52 a 60 a 28 a Promedios con letras distintas en la columna presentan diferencias significativas al nivel de probabilidad p=0.05 según Test de Tukey. No existe diferencia entre los tratamientos de esterilización del medio en relación con la formación de al menos una hoja de los protocormos. Es interesante mencionar, que en las mediciones que se realizaron en el tratamiento 2, a los 90 días el porcentaje de plantas que formaron al menos una hoja, es de un 60% el cuál a los 120 días bajó a 28%, se debe recordar que el transplante desde los tubos con agar avena a maceteros ocurre a los 45 días, y en ese momento el 52 % de las plantas presentaban al menos una hoja al momento del trasplante.
42 Las condiciones en que se encontraban las plantas en ese período varían notablemente, pasando desde la cámara bioclimática, con una temperatura entre 16º a 22ºC y con un régimen lumínico de ocho oscuridad y 16 horas luz, a una habitación ambiente en la cuál la temperatura y luz varían constantemente, pero lo más importante es la modificación de la humedad relativa de las plantas ya que los tubos se encontraban cerrados, por lo que mantenían una elevada humedad, al realizar el trasplante a maceteros, esta condición cambia drásticamente. El porcentaje de formación de al menos una hoja disminuye debido a la mortalidad de las plantas, ya que durante ese período debieron aclimatarse a las nuevas condiciones a las que fueron sometidas, logrando sólo un 28 % establecerse a los 120 días. El Cuadro 4 compara la altura final de las plántulas y el número de hojas formadas dependiendo del tratamiento utilizado para la esterilización del medio. CUADRO 4. Efecto de dos tratamientos de esterilización del medio en la altura de las plantas (cm) y número de hojas por plantas. Altura (cm) Nº de hojas Tratamiento 1 2,03 a 20,6 a Tratamiento 2 1,55 a 1,6 b Promedios con letras distintas en igual columna presentan diferencias significativas al nivel de probabilidad p=0.05 según Test de Tukey. No existe deferencia de los tratamientos en cuanto a la altura de las plantas pero si existe diferencia significativa en relación al número de hojas formadas. El tratamiento 1 (agar autoclavado en los mismos frascos) alcanzó mejores resultados al obtener plántulas con mayor número de hojas.
43 Es de gran dificultad la interpretación final de este ensayo, ya que los tratamientos no difieren en lo relacionado a la sobrevivencia de los protocormos, a la formación de clorofila ni a la altura de las plantas, sin embargo, existe diferencia significativa en relación al número de hojas obtenidos. Esta diferente tasa de crecimiento, pudo deberse a las diferentes características del medio provocada por los distintos tipos de esterilización, lo que a su vez pudo influir en la concentración de las micorrizas, mayor concentración, obteniéndose un mejor resultado. Sin embargo esta variable debe ser corroborada en futuros estudios.
44 5. CONCLUSIONES La sobrevivencia de las plántulas al trasplante disminuye a través del tiempo, a los 60 días el estado 3 de germinación, es superior al estado 2, algunos protocormos lograron formar clorofila. El trasplante en verano a una mezcla de perlita y turba no es efectivo para la sobrevivencia de las plántulas. Usar tubos individuales con medio agar avena al 25 % más aplicación de arena, todo autoclavado, colocando los protocormos en estado 3 en cámara bioclimática hasta la formación de la primera hoja, posteriormente, trasplante a maceteros con suelo perlita (1:1) dejarlos a temperatura ambiente hasta desarrollo de un nuevo follaje permite un 24-28 % de plantas sobrevivientes.
45 6. RESUMEN El programa de mejoramiento genético que lleva a cabo la Facultad de Agronomía de la Pontificia Universidad Católica de Valparaíso y la Universidad de Talca, financiado por la Fundación para la Innovación Agraria, comenzó hace cinco años, con el estudio agronómico y económico de la especie Chloraea crispa, durante el cuarto año de estudio, se estableció un protocolo de siembra y germinación simbiótica de semillas, mediante la utilización de un hongo perteneciente al género Rhizoctonia denominado como NM3. El quinto año del proyecto, tuvo como objetivo general el establecimiento de dichas plántulas en terreno. Para lograr con éxito el objetivo propuesto, se realizaron tres ensayos consecutivos. En el primero se evaluó el estado de trasplante de los protocormos, realizados en los estados 2 y 3 descritos por MITCHELL (1989), y tres vías de aclimatación que incluyen desde el uso de una cámara de crecimiento al empleo de un sombreadero. El segundo ensayo, evaluó en el mejor estado y vía de acimatación, una modificación del sustrato. Finalmente en el tercer ensayo, se evaluaron dos formas de esterilización del sustrato, ya que en el ensayo anterior, se produjo una contaminación generalizada que provocó la muerte de los protocormos. Mediante estos ensayos, se logró el establecimiento de las plántulas de Chloraea crispa a partir de semillas inoculadas.
46 7. ABSTRACT The genetic improvement program that carries out the Pontificia Universidad Católica de Valparaíso and the Universidad de Talca, financed by the Fundación para la Innovación Agraria, began five years ago with the agronomic and economic studies of the Chloraea crispa species. During the fourth year of study one settled down a protocol of sowing and symbiotic germination of seeds by means of the use of a Rhizoctonia fungus sort denominated like NM3. The fifth year had like general mission, in this species to improve the establishment of this plants in land. In order to obtain the proposed objective successfully, three consecutive tests were made. In first the state of trasplant of the protocormos, made in the states 2 and 3 described by MITCHELL (1989) was evaluated and three routes of acclimatization that include from the use of camera of growth the use of a shadow structure. The second test evaluated, in the best state and via, a modification of the substrate. Finally, in the third test two forms of sterilization of the substrate were evaluated, since in the previous test a generalized contamination took place that caused the failure plant. From the tests the establishment of Chloraea crispa plants was obtained from inoculated seeds with reasonable percentage of acclimatization.
47 8. LITERATURA CITADA ARDITTI, J. 1967. Factors affecting the germination of orchid seeds. The botanical Review. 33 (1) : 1-97. BATTY, M. and BRUNDETT, M. 2001. Orchid conservation techniques manual. Canberra. Plant Science, Kings Park and Botanic Garden. First International Orchid Conservation Congress - Training Course. Perth, Western Australia, 20 September 2001. sp. CORREA, M. 1969. Chloraea, género sudamericano de Orchidaceae. Buenos Aires, Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. 499p. HARTMANN, H y KESTER, D. 1998. Propagación de plantas. Principios y Prácticas. Segunda edición. México D.F., C.E.C.S.A. 760p. HOFFMAN, A. 1998. Flora silvestre de Chile zona central. Santiago, Fundación Claudio Gay. 254p. Cuarta edición. MCKENDRICK, S. 2000. Manual para la germinación in vitro de orquídeas, (Online). www.ceiba.org/documents/cftcpropman(sp).pdf MERSEY, L. 2003. Diseño y validación de un protocolo para germinación de semillas de Chloraea crispa inoculadas con hongos micorrícicos. Taller de Licenciatura. Ing. Agr. Quillota, Pontificia Universidad Católica de Valparaíso. Facultad de Agronomía. 50p. MITCHELL, R. 1989. Growing hardy orchids from seeds at Kew. Plantsman. 11(3): 152-169. RASMUSSEN, H. 1995. Terrestrial orchids from seed to mycotrophic plant. Press. Cambridge, Cambridge University. 444p.
48 RENDICH, A. 2001. Evaluación de crecimiento y floración de orquídeas nativas de la especie Chloraea crispa. Taller de Licenciatura. Ing. Agr. Quillota, Universidad Católica de Valparaíso. Facultad de Agronomía. 81p. SMITH, S. 1966. Physiology and ecology of orchid mycorrhizal fungi with reference to seedling nutrition. New Phytologist. 65: 488-499. URIBE, E. 2000. Descripción del ciclo fenológico de orquídeas nativas Perteneciente al género Chloraea y registro de características de interés Agronómico de la especie. Taller de Licenciatura. Quillota, Universidad Católica de Valparaíso. Facultad de Agronomía. 65p.
49 ANEXO 1. Método del tubo para la esterilización de semillas de orquídeas planteado por BATTY (2001).
50 ANEXO 2. Método de la jeringa para la esterilización de semillas de orquídeas según BATTY (2001).