Enzimas: conceptos básicos y cinéticos

ENZIMAS CATALIZADOR BIOLÓGICO Poder catalítico Especificidad S + E ES E + P S= Sustrato P= Producto ES= Complejo enzima-sustrato

Enzyme Nonenzymatic half-life Uncatalyzed rate (k un, s -1 ) Catalyzed rate (k cat, s -1 ) Rate enhancement (k cat /k un ) OMP decarboxylase 78,000,000 years 2.8 10-16 39 1.4 10 17 Staphylococcal nuclease 130,000 years 1.7 10-13 95 5.6 10 14 AMP nucleosidase 69,000 years 1.0 10-11 60 6.0 10 12 Carboxypeptidase A 7.3 years 3.0 10-9 578 1.9 10 11 Ketosteroid isomerase 7 weeks 1.7 10-7 66,000 3.9 10 11 Triose phosphate isomerase 1.9 days 4.3 10-6 4,300 1.0 10 9 Chorismate mutase 7.4 hours 2.6 10-5 50 1.9 10 6 Carbonic anhydrase 5 seconds 1.3 10-1 1 10 6 7.7 10 6 Abbreviations: OMP, orotidine monophosphate; AMP, adenosine monophosphate. Source: After A. Radzicka and R. Wofenden. Science 267 (1995):90-93

1. Anhidrasa carbónica Transporte de CO2-14% es transportada unida a la Hemoglobina - Como bicarbonato (HCO 3- ) en la sangre. A pesar que está reacción ocurre a velocidad razonable en ausencia de catálisis, existe la enzima anhidrasa carbónica que cataliza este proceso. La enzima es requerida ya que la hidratación de CO2 y deshidratación de HCO3-, está asociada a procesos rápidos. Particularmente de transporte, donde el HCO3- debe deshidratada en el pulmón. CO2 debe ser convertido en HCO3- para la generación del humor acuoso y de otras secreciones. CO2 y HCO3- son sustratos y productos de varias enzimas.

2.Enzimas proteolíticas Tripsina (enzima digestiva) Trombina (coagulación sanguinea)

La especificidad de una enzima se debe a la precisa interacción del sustrato con la enzima. Esta precisión es el resultado de la intrincada estructura tridimensional de la enzima (proteína).

Clasificación Class 1. Oxidoreductases 2. Transferases 3. Hydrolases 4. Lyases 5. Isomerases 6. Ligases Type of reaction Oxidation-reduction Group transfer Hydrolysis reactions (transfer of functional groups to water) Addition or removal of groups to form double bonds Isomerization (intramolecular group transfer) Ligation of two substrates at the expense of ATP hydrolysis Example Lactate dehydrogenase Nucleoside monophosphate kinase (NMP kinase) Chymotrypsin Fumarase Triose phosphate isomerase Aminoacyl-tRNA synthetase

Enzimas Sitio activo: lugar en la enzima donde ocurre la catálisis. Sitio catalítico Sitio de Unión E-S SITIO ACTIVO - PUENTES DE H - INTERACCIONES IÓNICAS - ENLACES COVALENTES

Cofactores Cofactor Coenzyme Thiamine pyrophosphate Flavin adenine nucleotide Nicotinamide adenine dinucleotide Pyridoxal phosphate Coenzyme A (CoA) Biotin -Deoxyadenosyl cobalamin Tetrahydrofolate Metal Zn 2+ Zn 2+ Mg 2+ Mg 2+ Ni 2+ Mo Se Mn 2+ K + Enzyme Pyruvate dehydrogenase Monoamine oxidase Lactate dehydrogenase Glycogen phosphorylase Acetyl CoA carboxylase Pyruvate carboxylase Methylmalonyl mutase Thymidylate synthase Carbonic anhydrase Carboxypeptidase EcoRV Hexokinase Urease Nitrate reductase Glutathione peroxidase Superoxide dismutase Propionyl CoA carboxylase

COFACTORES 1.- GRUPOS PROSTÉTICOS: i.- Están fuertemente unidos a la E ii.- Forman parte del sitio activo. 2.- COENZIMAS. i.- Pequeñas moléculas orgánicas consideradas cosustratos que no están permanentemente unidas al sitio activo. Muchas derivan de vitaminas. ii.- Debe reaccionar con la E. iii.- Debe unirse al sitio activo. iv.- Cambia químicamente y se separa del sitio activo.

Vitaminas

Sustratos Productos

"I think that enzymes are molecules that are complementary in structure to the activated complexes of the reactions that they catalyze, that is, to the molecular configuration that is intermediate between the reacting substances and the products of reaction for these catalyzed processes. The attraction of the enzyme molecule for the activated complex would thus lead to a decrease in its energy and hence to a decrease in the energy of activation of the reaction and to an increase in the rate of reaction. - Linus Pauling Nature 161(1948):707

Formación complejo enzima-sustrato Grupos catalíticos

Puentes de H, refuerza la especificidad

Modelos del complejo Enzima-sustrato

Nociones de Cinética Química (Recordatorio) B A

Cinética Enzimática

Estado Estacionario

Ecuación de Michaelis-Menten Tiene unidades de concentración K M es una importante característica de la interacción E-S y es independiente de las concentraciones de enzima y sustrato

[S] > > K M, entonces V 0 = V max [S] = K M, entonces V 0 = V max /2 [S] < < K M, entonces V 0 = (V max / K M ) [S] Por lo tanto, la K M es igual a la concentración de sustrato a la cual la velocidad de reacción es la mitad de su velocidad máxima. O dicho de otra forma, la concentración de sustrato a la que la mitad de los sitios activos de la Enz están ocupados.

K M para algunas Enz y sustratos Enzyme Chymotrypsin Lysozyme β-galactosidase Threonine deaminase Carbonic anhydrase Penicillinase Pyruvate carboxylase Arginine-tRNA synthetase Substrate Acetyl-l-tryptophanamide Hexa-N-acetylglucosamine Lactose Threonine CO 2 Benzylpenicillin Pyruvate HCO - 3 ATP Arginine trna ATP K M (µm) 5000 6 4000 5000 8000 50 400 1000 60 3 0.4 300

Resumen Representación de la Ecuación de Michaelis-Menten

Linearización de la Ecuación de Michaelis-Menten

Significados de la KM

Significados de V max y de k 2 (k cat )

Ejemplo: Una solución 10-6 M de anhidrasa carbónica cataliza la formación de 0,6 M H 2 CO 3 por segundo cuando está saturada con sustrato. Por lo tanto, k 2 es 6 x 10 5 s -1. Este número de recambio es uno de los mas grandes conocidos. Cada reacción catalizada toma lugar en un tiempo igual a 1/k 2, lo cual es 1.7 µs

Eficiencia Catalítica (k cat /K M )

Eficiencia Catalítica (k cat /K M ) k cat /K M está determinada por la velocidad de formación del complejo ES. Límite de k 1 está dada por la difusión (10 8 y 10 9 s -1 M -1 ) Enzyme Acetylcholinesterase Carbonic anhydrase Catalase Crotonase Fumarase Triose phosphate isomerase β-lactamase Superoxide dismutase k cat /K M (s -1 M -1 ) 1.6 10 8 8.3 10 7 4 10 7 2.8 10 8 1.6 10 8 2.4 10 8 1 10 8 7 10 9 Source: After A. Fersht, Structure and Mechanism in Protein Science: A Guide to Enzyme Catalysis and Protein Folding (W. H. Freeman and Company, 1999), Table 4.5.

Complejos multienzimáticos Proteínas andamio (scafolding) Microdominios de membrana

Sustratos Múltiples Desplazamiento secuencial. Lactato deshidrogenasa Doble desplazamiento (Ping-Pong).

Enzimas Alostéricas Enzimas que no responden a la cinética de Michaelis-Menten.

Efecto Temperatura y ph

Inhibición Enzimática

Inhibición Reversible Competitiva

Inhibición Reversible No Competitiva

Análisis de las Inhibiciones

Mecanismos moleculares de la regulación enzimática 1. 2. 3. 4.

1. Isoenzimas

2. Vida Media y disponibilidad de la Enzima

3. Control Alostérico

4. Modificación covalente

Regulación de Rutas Metabólicas

Enzimas Alostéricas Aspartato Transcarbamoilasa

Aspartato Transcarbamoilasa

Proteína Alostéricas Unión cooperativa de Oxígeno a la Hemoglobina.

Grupo prostético Hem de la Hemoglobina.

Estructura de la Hemoglobina y transición estado T a R.

Efecto de 2,3-Bifosfoglicerato Hemoglobina fetal Cadena γ Estado T

Efecto del ph y CO 2 en la liberación de Oxígeno: Efecto Bohr

Efecto del ph y CO 2 en la liberación de Oxígeno: Efecto Bohr Estabiliza la estructura de la deoxihemoglobina, favoreciendo la liberación de O 2