Página 1 Unidad Temática 5 Taxonomía bacteriana (Guía de estudio) Benintende, S; Sánchez, C., Sterren, M. Y Musante, C Objetivo El objetivo de la Taxonomía bacteriana es dar un ordenamiento de las unidades taxonómicas básicas (especies). Especie bacteriana: Es un conjunto de poblaciones clonales que presentan un elevado grado de similitud fenotípica entre sí y que a su vez difieren de otros conjuntos de poblaciones clonales. Caracterización Ideal: caracterización completa del genotipo (es decir de su constitución genética). Real: caracterización parcial del fenotipo (apariencia). Pero además de utilizar propiedades estructurales, se debe recurrir a las propiedades bioquímicas y fisiológicas para la caracterización de especies; es decir que las bacterias se clasifican no solo por su apariencia sino también por lo que pueden hacer. Denominación: uso del sistema binomial de nomenclatura: formado por 2 palabras. Ejemplos: Bacillus subtilis Bradyrhizobium japonicum Bacillus subtilis La segunda palabra cita la especie La primer palabra indica el rango taxonómico inmediato superior, el Género Manual Bergey de Bacteriología Volumen I Bacterias gram (-) de importancia médica e industrial Volumen II Bacterias gram (+) de importancia médica e industrial Volumen III Bacterias gram (-) restantes Volumen IV Actinomicetes y bacterias relacionadas 1
Taxonomía clásica Página 2 La taxonomía clásica está basada en la caracterización: morfológica, fisiológica y bioquímica. Entre los caracteres taxonómicos morfológicos: Negativo: se observan bacilos aislados de color rosado (coloración dada por la safranina). Coloración de gram Positivo: se observan cocos agrupados en estafilos (estafilococos) de color violeta, típico de una coloración de Gram (+). Agrupamientos Esporas Estructuras especiales Cápsulas 2
Página 3 Entre los caracteres bioquímicos y fisiológicos Pruebas de: Rojo de metilo, Voges Proskauer, Catalasa. Rojo de Metilo Principio: fermentadores ácido-mixtos que producen una descenso de ph por debajo de 4,3. Se agrega el indicador Rojo de Metilo al medio de cultivo, luego de la incubación. Si ocurre un descenso de ph por debajo de 5, se produce un viraje al color rojo y la prueba se considera (+). Resultados (-) se observan por lo general de color amarillo. Se utiliza para diferenciar Escherichia sp. (+) de Enterobacter sp. o Klebsiella sp. (-) Voges-Proskauer Principio: producción de 2 3 butanodiol (fermentadores butanodiólicos). Reactivo: α-naftol. Resultados: reacción color rojo (+) reacción color amarillo (-) Se utiliza: para separar bacterias de los géneros Klebsiella y Enterobacter (+) de Escherichia (-). Catalasa Principio: propiedad de la enzima catalasa de descomponer el peróxido de hidrógeno (H 2 O 2 ). Se añade al cultivo unas gotas de H 2 O 2 para observar la formación de burbujas. La observación de burbujas (tubo +) indica la presencia de la catalasa. + Se utiliza para diferenciar los géneros Bacillus (+) de Clostridium (-), Stresptococcus (-) de Staphylococcus (+) 3
Página 4 Existen sistemas comerciales que permiten la rápida identificación de una bacteria en base a la capacidad de utilización de determinados sustratos, presencia de determinadas enzimas, etc. Técnicas 4
Técnicas serológicas Página 5 Utilización in vitro de las reacciones antígeno-anticuerpo para la identificación de un microorganismo (virus, bacterias, hongos). Testigo Placas de inmunodifusión Antígeno (cepas de rizobio) Agar Antígeno ( cepas de rizobio) Testigo Antisuero Enzima Test de ELISA Anticuerpo Microorganismo Sustrato 5
Página 6 Antígeno Célula bacteriana Anticuerpo antibacteriano marcado fluorescentemente Anticuerpos fluorescentes Aplicaciones de la biología molecular a la identificación bacteriana 1.- Composición de bases del ADN: Determinado por la cantidad de G+C respecto del total de bases. 2.- Técnicas basadas - en la hibridación del ADN-ADN y ADN-ARN: Permite evaluar el grado de homología genética entre bacterias - en la amplificación de sectores del ADN (por ejemplo PCR): Permite ver si existe o no homología entre sectores del genéforo bacteriano aumentando del número de copias de un determinado sector de ADN. 6
Página 7 Amplificación de sector de ADN (PCR) (Ver movie pcwin en material complementario) 7
Complemento Teórico Práctico Identificación de Bacterias Página 8 El trabajo en microbiología se basa en el estudio de poblaciones microbianas debido a la dificultad en la manipulación y la limitada información que se puede obtener a partir de los individuos microbianos. Los pasos que se siguen para determinar la identidad de un microorganismo es la IDENTIFICACIÓN. Un microorganismo se identifica adecuadamente cuando se encuentra que la descripción de una especie es idéntica a las características observadas en dicho microorganismo. La unidad taxonómica de clasificación que comúnmente se utiliza es la especie. Esta categoría sistemática se define como el conjunto de poblaciones clonales 1 de elevada similitud fenotípica 2 que a su vez difieren de otras poblaciones clonales. Una característica de los microorganismos es que en un corto período de tiempo ocurren considerables aumentos de las poblaciones, lo que determina que se puedan establecer cambios genéticos que adquieren continuidad. Ello hace problemático diferenciar especies sobre la base de un pequeño número de caracteres. La esencia de la identificación la integran dos clases de operaciones: Aislamiento, que es el tipo de siembra que permite la separación de microorganismos a partir de una población mixta (constituida por más de una clase de microorganismos) Cultivo, que es el crecimiento de la población microbiana en ambientes artificiales (medios de cultivo), bajo condiciones de laboratorio. Estas operaciones son las mismas independientemente de los microorganismos con los que se trabaje. Para comenzar la identificación se parte de un cultivo puro 3, lo que previamente ha implicado el aislamiento del microorganismo a partir de una población microbiana natural mixta (leche, suelo, etc.). Para obtener un cultivo puro se utilizan técnicas como el enriquecimiento selectivo y la siembra en placas. El aislamiento para la obtención de un cultivo puro por métodos de siembra en placa implica la separación e inmovilización de las células individuales sobre un medio nutritivo solidificado con agar. Cada viable da origen, al crecer, a una colonia cuya transferencia puede hacerse fácilmente con ansa. La siembra en estría para la purificación de cultivos es el método empleado. El inóculo 4 tomado con el ansa se va agotando progresivamente con cada sucesiva estría. Así las estrías iniciales proporcionan un crecimiento confluente y a lo largo de las últimas estrías se van desarrollando colonias aisladas. Pero, si toma material de una de estas colonias y se transfiere a un medio apropiado a esto no se le puede denominar un cultivo puro, ya que por cada colonia visible en la primera placa puede haber células de otros microorganismos que quedaron depositadas en el agar y no lograron dar un crecimiento macroscópico a pesar que son viables. Por lo tanto nunca se debe tomar la colonia de la primera placa para preparar un cultivo puro, sino que a partir de esta se hace una segunda siembra denominada purificación. Si todas las colonias de esta 1 Un clon es una población de células bacterianas derivadas del crecimiento de una sola célula parental convenientemente aislada. 2 Fenotipo es el conjunto de caracteres hereditarios que se expresan, mientras que se conoce como genotipo a toda la información contenida en el genoma de los individuos de una determinada especie, y que no necesariamente siempre se expresa. 3 Cultivo que contiene una sola clase de microorganismos 4 Material microbiano utilizado para sembrar 8
Página 9 segunda placa resultan idénticas, una colonia bien aislada puede utilizarse para establecer un cultivo puro. Es necesario que una vez que se logró el aislamiento se mantenga al microorganismo y a su descendencia en un ambiente artificial que impida el acceso de otros microorganismos. Este ambiente se puede crear en la caja de petri o en el tubo de ensayo. Obtenido el cultivo puro es posible hacer la identificación del microorganismo utilizando los caracteres morfológicos y bioquímicos y fisiológicos. Lo ideal sería una descripción completa de su fenotipo (expresión de los caracteres), o mejor aún por su genotipo (información genética). Como metodología habitual se utilizan criterios de fácil determinación como los morfológicos, por su practicidad. Algunos de ellos son forma, tamaño, movilidad, reproducción, tinción a colorantes especiales como la de Gram, presencia o ausencia de estructuras como esporas, cápsulas y flagelos, crecimiento en medios geleficados en los que se puede observar forma, tamaño, color y aspecto de las colonias producidas. Sin embargo este criterio ofrece elementos de juicio insuficientes para la caracterización definitiva y por lo tanto se tienen en cuenta otros criterios como son los mecanismos fisiológicos y bioquímicos, entre los cuales se incluyen información sobre crecimiento, muerte y supervivencia en diferentes condiciones de cultivo (temperatura de crecimiento, ph, concentración de sales, etc.), ausencia o presencia de enzimas (catalasa, amilasa, etc.), como toman, utilizan y /o almacenan la energía. Prueba diagnóstica Crecimiento a diferentes temperaturas Crecimiento anaeróbico Producción de ácidos a partir de carbohidratos Reducción de nitrato a nitrito Hidrólisis de almidón Utilización de citrato Principio Detectar la habilidad para crecer a distintas temperaturas determinando la óptima para el crecimiento. También permite verificar la plasticidad para crecer a diferentes temperaturas Intenta comprobar los requerimientos de oxígeno de los microorganismos Se fundamenta en la producción de ácido durante el crecimiento por la fermentación de azúcares o alcoholes azucarados del medio de cultivo - Se fundamente en que algunas bacterias utilizan el NO 3 como aceptor alterno de electrones, reduciéndolo a NO - 2 o N 2 Detecta la presencia de la enzima amilasa, por la formación de un complejo azul en el medio de cultivo al combinarse el yodo con el almidón Se basa en la capacidad de las bacterias para utilizar el citrato como única fuente de carbono, pudiendo además utilizar el N de la sal de amonio del medio, con la producción de amoníaco. Este último compuesto se convierte OHNH 4 que alcaliniza el medio por arriba de ph 6.7 virando el indicador de medio de verde a azul 9