k 19 OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPAÑA 11 k Número de publicación: 2 166 314 21 k Número de solicitud: 0000 1 k Int. Cl. 7 : A01H 4/00 A01H /00 k 12 SOLICITUD DE PATENTE A1 22 kfecha de presentación: 22.02.00 71 k Solicitante/s: Universidad Politécnica de Madrid C/ Ramiro de Maeztu, 7 280 Madrid, ES Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria 43 kfecha de publicación de la solicitud: 01.04.02 72 k Inventor/es: Manzanera de la Vega, José Antonioy Bueno Pérez, María Angeles k 43 Fecha de publicación del folleto de la solicitud: 01.04.02 k 74 Agente: No consta k 4 Título: Método de propagación del alcornoque (Quercus suber L.) por embriogénesis somática. ES 2 166 314 A1 k 7 Resumen: Método de propagación del alcornoque (Quercus suber L.) por embriogénesis somática. El objeto de la invención es multiplicar plantas de alcornoque a partir de embriones somáticos. El método consiste en el cultivo de embriones zigóticos en condiciones asépticas, en medio suplementado con ácido 2,4-diclorofenoxiacético. Los embriones somáticos producidos se tratan con frío (2 a C) durante dos a diez semanas, para estimular su germinación. Después se pasan a medio basal, suplementado con bencil-adenina, para estimular el desarrollo del tallo y obtener la producción de plantas. Este procedimiento resuelve los problemas de propagación clonal que tenía el alcornoque, recalcitrante a la propagación por estaquillado y otros métodos convencionales de propagación vegetativa. Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, 1 28036 Madrid
1 ES 2 166 314 A1 2 DESCRIPCION Método de propagación del alcornoque (Quercus suber L.) porembriogénesis somática. Sector de la técnica La presente invención se basa en una aplicación de la Biotecnología vegetal a la multiplicación del alcornoque (Quercus suber L.), para obtenerungrannúmero de semillas artificiales, utilizables en la producción de plantas de esta especie. Estado de la técnica: Antecedentes El alcornoque es una especie vegetal que presenta enormes dificultades para la propagación clonal por procedimientos convencionales. En efecto, el estaquillado fracasa cuando se pretende realizar a partir de plantas de más de un año de edad, y los demás métodos (injerto, acodo) son demasiados laboriosos y limitantes para poder realizar una producción de plantas a gran escala, con rentabilidad económica (Natividade, 19). Por ello se ha buscado una alternativa en la producción de embriones somáticos, que es el objeto de la presente invención. El cultivo in vitro del alcornoque se intenta por vez primera en los trabajos de Jaquiot (192). El investigador francés cultivó tejidocambial.el resultado era la formación de un callo parenquimatoso, indiferenciado, después de un períodoinicial de formación de liber. No tuvo más transcendencia, y esta especie no volvería a ser estudiada hastaladécada de los 80. Bellarosa (1981 y 1982) empleó como material inicial embriones desprovistos de sus cotiledones, que estableció enmedio de Durzan (1973) modificado por ella misma. La dilución mineral y, sobre todo, el balance hormonal entre: 6-bencil adenina (BA) y ácido naftil-1- acético (ANA), influyeron en el alargamiento de la raíz, del meristemo apical, o de ambos. Intentos posteriores de repique de la parte caulinar en subcultivos no parecen haber dado buenos resultados generalizados. Intentos de embriogénesis somática de alcornoque fueron realizados por El Maataoui y Espagnac (1987), pero tampoco dieron resultados. Después de consultar numerosas bases de datos de patentes españolas y extranjeras, no se ha encontrado ninguna patente sobre embriogénesis somática de alcornoque. La presente invención expone una alternativa a la micropropagación a partir de yemas, para producir plantas clonales en gran cantidad. Por otra parte, nunca hasta ahora se había podido manejar material clonal vegetal como semillas. Explicación o descripción de la invención El presente método consiste en la obtención de gran número de embriones de alcornoque, sin necesidad de recurrir a la reproducción sexual, sino a partir de células somáticas. La reproducción sexual, o propagación por semilla, es un método lento a la hora de obtener nuevos cruces y variedades, y la fructificación del alcornoque es vecera, con una recurrencia de 2 ó 3años. Las ventajas que presenta este nuevo método permiten una producción de embriones todos los años, y que se puedan clonar genotipos de interés. Método por el cual se toman embriones zigóticos inmaduros, y se cultivan en condiciones asép- 2 1 6 ticas, en medio con sales minerales macronutrientes (SO 4 (NH 4 ) 2,NO 3 KóNO 3 Na, Cl 2 Ca.2H 2 O, SO 4 Mg.7H 2 O, KCl, y PO 4 H 2 Na.H 2 OoPO 4 H- Na 2 ). Como solución de micronutrientes se emplea la de MURASHIGE y SKOOG (1962), además se añade hierro quelado en forma de Fe-ED- TA, adicionando SO 4 Fe.7H 2 OyNa 2 EDTA (etilendiamino tetraacetato de sodio). Los cofactores empleados son los siguientes: Acido ascórbico, Acido nicotínico, Pantotenato cálcico, Piridoxina, Tiamina y Glutamina. Como fuente de carbono se utiliza sacarosa y el ph del medio de cultivo se ajusta entre, y,7. La esterilización se realiza en autoclave entre 0, y 1 atmósferas (11 a 1 C) durante minutos. Después del establecimiento, los cultivos se mantienen en una cámara bajo condiciones ambientales definidas de luz. El fenómeno de embriogénesis se estimula aplicando ácido 2,4 diclorofenoxiacético (2,4-D) añadido al medio de cultivo. La duración óptima del tratamiento es de días, y a continuación, el material vegetal se transfiere a medio sin 2,4-D. Los embriones inducidos, una vez alcanzada la madurez, se someten a un tratamiento de ruptura del letargo, consistente en almacenarlos a baja temperatura(2a C) durante dos a diez semanas. A continuación, se trasladan a una cámara a C, con iluminación, para estimular la germinación. El desarrollo del tallo se mejora añadiendo 6-benciladenina. Las plantas germinadas se pueden transplantar a envases normales, y se aclimatan en invernadero. Modo de realización Se toman embriones zigóticos inmaduros, y se cultivan en condiciones asépticas, en medio con la siguiente fórmula de sales minerales macronutrientes: SO 4 (NH 4 ) 2 0,13 a 0, g/l NO 3 KóNO 3 Na 0,7 a 1,00 Cl 2 Ca.2H 2 O 0,12 a 0,1 SO 4 Mg.7H 2 O 0, a 0,31 KCl 0, a 0,9 PO 4 H 2 Na.H 2 O 0,09 a 0,1 PO 4 HNa 2 (opcional) 0,03 Como solución de micronutrientes se emplea la de MURASHIGE y SKOOG (1962): BO 3 H 3 6,0 mg/l SO 4 Mn.H 2 O 16,900 SO 4 Zn.7H 2 O,90 IK 0,8 MoO 4 Na 2.2H 2 O 0,2 SO 4 Cu.H 2 O 0,0 Cl 2 Co.6H 2 O 0,0 Además se añade hierro quelado en forma de Fe-EDTA, adicionando 27,8 mg/l de SO 4 Fe.7H 2 O y 37,3 mg/l de Na 2 EDTA (etilendiamino tetraacetato de sodio). Los cofactores empleados son los siguientes:
3 ES 2 166 314 A1 4 Acido ascórbico µm Acido nicotínico Pantotenato cálcico Piridoxina Tiamina 3 Glutamina 3 mm Como fuente de carbono se utiliza sacarosa (90 mm), y el ph del medio de cultivo se ajusta entre, y,7. La esterilización se realiza en autoclave entre 0, y 1 atmósferas (11 a 1 C) durante minutos. Después del establecimiento, los cultivos se mantienen en una cámara bajo condiciones ambientales definidas de luz, a un fotoperíodo de 14 a 16 horas, y temperatura a C durante las horas iluminación, y a C durante las de oscuridad. El fenómeno de embriogénesis se estimula aplicando ácido 2,4 diclorofenoxiacético (2,4-D) de 2 a µm, añadido al medio de cultivo. La duración óptima del tratamiento es de días, y a continuación, el material vegetal se transfiere a medio sin 2,4-D. Los embriones inducidos, una vez alcanzada la madurez, se someten a un tratamiento de ruptura 1 del letargo, consistente en almacenarlos a baja temperatura(2a C) durante dos a diez semanas. A continuación, se trasladan a una cámara a C, con iluminación, para estimular la germinación. El desarrollo del tallo se mejora añadiendo 6-benciladenina (BA) 0,4 a 0, µm almedio de germinación. Las plantas germinadas se pueden transplantar a envases normales, y se aclimatan en invernadero. Aplicación industrial La técnica descrita se puede aplicar industrialmente mediante la organización de un laboratorio, donde se puedan efectuar las operaciones anteriormente descritas. Para ello requiere cámaras de flujo laminar, autoclaves, estufas de esterilización, y el instrumental de manipulación y envases de cultivo, etc. Dicho laboratorio debe tener anexo un invernadero con suficiente capacidad, para la aclimatación y acondicionamiento de las plantas producidas. Dicho invernadero debe tener un ambiente de control de humedad ambiental, y otro de endurecimiento. En ambos se debe disponer de un sistema de regulación de la temperatura, instalaciones de riego, etc. 6 3
ES 2 166 314 A1 6 REIVINDICACIONES 1. Método de propagación del alcornoque por embriogénesis somática caracterizado por el cultivo de embriones zigóticos en condiciones asépticas, en medio de cultivo. 2. Método según reivindicación 1 caracterizado por aplicar técnicas biotecnológicas de propagación clonal por cultivo de embriones inducidos a partir de células somáticas. 3. Método según reivindicaciones 1 y 2 caracterizado porque los embriones inducidos se someten a un tratamiento de ruptura del letargo, consistente en almacenarlos a baja temperatura 1 (2 a C) durante dos a diez semanas. 4. Método según reivindicaciones 1 y 2 caracterizado porque los embriones maduros se trasladan a una cámara a temperatura ambiente con iluminación, para estimular la germinación.. Método según reivindicaciones 1, 2 y 4 caracterizado porque el desarrollo del tallo se mejora añadiendo citoquinina al medio de germinación. 6. Método según reivindicaciones 1 a caracterizado por transplantar las plantas germinadas a envases normales, y aclimatarlas en invernadero. 6 4
OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPAÑA k 11 ES 2 166 314 k 21 N. solicitud: 0000 k 22 Fecha de presentación de la solicitud: 22.02.00 k 32 Fecha de prioridad: INFORME SOBRE EL ESTADO DE LA TECNICA k 1 Int. Cl. 7 : A01H 4/00, /00 DOCUMENTOS RELEVANTES Categoría Documentos citados Reivindicaciones afectadas X BUENO, M.A. et al.: Plant regeneration through somatic 1-6 embryogenesis in Quercus suber, 1992, Physiologia Plantarum, Vol. 8, n 1, páginas -34, ISSN 0031-9317, todo el documento. A EL MAATAOUI, M. et al.: Histology of callogenesis and somatic 1-6 embryogenesis induced in stem fragments of cork oak Quercus suber cultured in vitro, 1990, Annals of Botany (London), Vol. 66, n 2, páginas 183-190, ISSN 0-7364, todo el documento. A FERNANDEZ-GUIJARRO, B. et al.: Influence of external factors 1-6 on secondary embryogenesis and germination in somatic embryos from leaves of Quercus suber, 199, Plant Cell Tissue and Organ Culture, Vol. 41, n 2, páginas 99-6, ISSN 0167-687, todo el documento. A ENDEMANN, M. et al.: Factors influencing the induction and 1-6 viability of somatic embryos of Quercus robur L., 1999, Biologia Plantarum (Prague), Vol. 42, n 4, páginas 499-4, ISSN 0006-3134, todo el documento. Categoría de los documentos citados X: de particular relevancia Y: de particular relevancia combinado con otro/s de la misma categoría A: refleja el estado de la técnica O: referido a divulgación no escrita P: publicado entre la fecha de prioridad y la de presentación de la solicitud E: documento anterior, pero publicado después de la fecha de presentación de la solicitud El presente informe ha sido realizado para todas las reivindicaciones para las reivindicaciones n : Fecha de realización del informe Examinador Página 0.03.02 A. Maquedano Herrero 1/1