TRABAJO PRACTICO Nº 3 ENZIMOINMUNOANALISIS ELISA Docentes encargados: Bioq. Natalia Guiñazú Bioq. Maria Sol Renna Biol. Virginia Andreani Bioq. Mauricio Figueredo Bioq. Vanina Garrido Bioq. Laura Dulgerian
Interacción Antígeno-Anticuerpo Naturaleza de la interacción No covalente Reversible Específica Podemos diferenciar 3 etapas Primaria Secundaria Terciaria
Etapas de la interacción Ag-Ac Primaria: Primer reconocimiento Ag-Ac No visible Rápida Ac Poco influenciada por Tº, electrolitos T. cruzi
Secundaria: Interacción de los complejos Ag-Ac Visibles Influenciados por Tº, electrolitos,viscosidad AGLUTINACIÓN Y PRECIPITACIÓN Terciaria: Trabajos prácticos Nº 1-2 Sólo ocurren in vivo Fenómenos biológicos (Reacción de Arthus, efectos vasógenos)
Etapas de la interacción Ag-Ac Primaria: Primer reconocimiento Ag-Ac No visible Rápida Ac Poco influenciada por Tº, electrolitos T. cruzi ELISA Trabajo práctico Nº 3 Inmunofluorescencia Trabajo Práctico Nº4
Objetivo Trabajo Práctico Nº3 Evaluar la presencia de IgG específica para Bordetella pertussis y virus Rubeola Determinar la concentración de IgG purificada Determinar la composición de la IgG purificada por Western blot. Detección de cadena pesada γ y µ.
Qué estrategias permiten detectar la reacción primaria Ag-Ac in vitro? Como en el medio reaccionan antígenos y anticuerpos entonces puedo detectar la reacción marcando el antígeno o el anticuerpo????? Yuhu!!!!!!!!
El Ag o el Ac se marcan covalentemente con distintas sustancias Radioactivas Enzimas Fluorocromos Radioinmunoanálisis Medición de radioactividad Enzimoinmunoanálisis Medición de color Inmunofluorescencia Medición de fluorescencia
ELISA Fundamento: Un anticuerpo conjugado con una enzima reacciona con un sustrato sin color produciendo un producto coloreado Permite la detección de Ag o Ac Cualitativo, semicuantitativo y cuantitativo Sensible y específico
Diferentes ELISA Detección de anticuerpos específicos: ELISA indirecto ELISA doble sandwich IgG especifica para el virus Rubeola Detección de antígenos: ELISA directo competitivo ELISA sandwich IgG total citoquinas
ELISA Tres etapas comunes: Sensibilización de la placa de ELISA Incubación con la muestra problema Revelado de la reacción Ag-Ac, mediante reacciones enzimáticas
Objetivo Trabajo Práctico Nº3 Evaluar la presencia de IgG específica para Bordetella pertussis y virus Rubeola ELISA indirecto Determinar la concentración de IgG purificada ELISA sandwich
ELISA indirecto Cómo determinamos la presencia de Acs específicos? Antígeno: Bordetella pertussis: Homogeneizado del microorganismo Proteínas purificadas Proteínas recombinantes
1º paso inmovilización del antígeno a la fase sólida Fase sólida: Placas de ELISA (poliestireno o cloruro de polivinilo- PVC) Alta capacidad de unión Baja desorción Alta transparencia Tipos de unión: Covalente, tratamiento previo de la placa No covalente interacción carga del antígeno
LAVADOS Siempre entre paso y paso, debemos lavar la placa de ELISA para eliminar las moléculas que no interaccionan lo suficientemente fuerte. Soluciones salinas tamponadas, como PBS mas detergente como Tween 20, se utilizan para lavar.
2º paso bloquear los sitios libres de unión En la placa pueden quedar sitios libres que son ocupados por las proteínas presentes en la solución de bloqueo. Solución de bloqueo, bufffer salino con proteínas que no reaccionan o interfieren en el sistema Ag-Ac. Proteínas: Leche en polvo Albúmina
3º paso incubación con la muestra problema y controles Se diluyen las muestras en el líquido de bloqueo y se permite la interacción por un tiempo determinado. OCURRE LA INTERACCIÓN PRIMARIA Ag-Ac
4º paso incubación con el conjugado enzimático Ha ocurrido la interacción específica Ag- Ac que queremos detectar, pero no es visible. Agrego un anticuerpo marcado con una enzima para detectar al anticuerpo (muestra problema) que está reaccionando.
5º paso revelado de la reacción Revelamos la presencia de la reacción Ag-Ac mediante el empleo del sustrato de la enzima y un cromógeno que permita visualizar la reacción.
Esquema Paso 1, sensibilización y lavado Antígenos de Bordetella
Paso 2, bloqueo Lavado
Paso 3, incubación con la muestra IgG purificada por columna de afinidad Alguno de estos anticuerpos reconoce específicamente a la Bordetella?
Paso 3 incubación con la muestra y lavado
Paso 4, incubación con el conjugado y lavado Conjugado anticuerpos anti-igg marcados con una enzima
Paso 5, agregado del cromógeno y el sustrato Determino la reacción por la medición de la densidad óptica
ELISA cuantitativos ELISA sandwich ELISA competitivo Cómo logramos medir concentración? Utilizando testigos de concentración conocida En el práctico como determinamos la concentración de IgG...el testigo es una muestra con IgG de concentración conocida...si quisiera determinar concentración de TNFα podría usar el mismo testigo que para IgG?
Práctico Nº3 Objetivo: Medición de la concentración de IgG purificada ELISA Sandwich 1º Sensibilización de la placa con anticuerpo anti-igg y lavado 2º Bloqueo y lavado 3º Incubación con la muestra problema y lavado 4º Incubación con anti-igg marcada con una enzima y lavado 5º Revelado
Esquema Paso 1, sensibilización y lavado Anticuerpos específicos anti-igg
Paso 2, bloqueo Lavado
Paso 3, incubación con la muestra IgG purificada por columna de afinidad Que concentración de IgG obtuve??
Paso 3 incubación con la muestra y lavado
Paso 5, agregado del cromógeno y el sustrato Determino la reacción por la medición de la densidad óptica
Paso 4, incubación con el conjugado y lavado Conjugado anticuerpos anti-igg marcados con una enzima
Que controles se incluyen en el ELISA? Controles NEGATIVOS de matriz similar a la matriz muestra problema que no reaccionan en el sistema Controles POSITIVOS que contienen Ag o Ac a detectar Blancos de reacción SIEMPRE DA REACCIÓN NEGATIVA SIEMPRE DA REACCIÓN POSITIVA
Curva del testigo o standard Solución de concentración conocida de IgG Se realizan diluciones seriadas de conc. conocida Se obtiene una curva de calibración dosis respuesta Densidad Optica DO MP 500 mg % Concentración de IgG Por extrapolación de la DO obtenida en el problema se determina la concentración
Cuales son las características de un testigo? De concentración conocida Estable en el tiempo Reaccione específicamente en el sistema Matriz similar a la muestra problema
Sistemas de detección más utilizados Enzimas Peroxidasa Fosfatasa alcalina Sitemas avidina-biotina/estreptavidina-peroxidasa
Aglutinación Precipitación ELISA RIA Límite de detección (ug( ug/ml) 0,3 10-50 0,01-0,0001 0,006-0,0006 Costo + + +++ +++++ Complejidad del laboratorio - - ++ +++++ Descrita por 1950 Coombs (hemaglutinacion) 1897 R.Kraus 1946 Oudin 1947 Oucht. 1965 Mancini 1960 S.A. Berson R. Yalow (Premio Nobel)
Para pensar en casa Qué ocurre si no bloqueamos la placa de ELISA? Cómo serian las densidades ópticas si no lavamos antes de revelar la reacción? Que podemos medir con un ELISA sandwich...ag o Ac? Cómo seria un ELISA para determinar concentración de la hormona TSH?