Genética molecular y su aplicación al estudio del paiche Arapaima gigas en la Amazonía peruana

Instituto de investigaciones de la Amazonía Peruana Instituto de Investigación para el Desarrollo Laboratorio de Biología y Genética molecular - LBGM Genética molecular y su aplicación al estudio del paiche Arapaima gigas en la Amazonía peruana Dra. Carmen Rosa García Dávila Jefe del LBGM Agosto - 2009 Pucallpa - Ucayali

Pesqueria CONSERVACION Caracterización Manejo sostenido Piscicultura Genética Biologia Poblaciones Especies Medio ambiente

Genotipo Fenotipo y genotipo Fenotipo Set de características físicas expresadas por un organismo Ambiente Set de genes presentes en un organismo

Relacionamiento genotipico y fenotipico Gran variación fenotipica = gran variabilidad genética? Heredabilidad Rango de heredabilidad: 0 = cuando toda variación es completamente ambiental. 1 = cuando toda variación es debido a diferencias genéticas.

Genética = Heredabilidad Reproductores Progenie Fenotipo = Genotipo?

Susceptibilidad al medio ambiente Altos niveles de variación fenotipica Baja heredabilidad Gran susceptibilidad al medio ambiente Crecimiento: - Disponibilidad de comida - asinamiento Temperatura: - Metabolismo

La diversidad biológica a sido rápidamente destruida en nuestro planeta debido directa o indirectamente a las actividades humanas. A medida que los tamaños de las poblaciones de animales y plantas son reducidos, la perdida de diversidad genética limita sus potencialidades de adaptarse a los cambios del ambiente. Además de eso la depresión por endocruzamiento se torna una consecuencia inevitable para muchas especies.

Lenguaje de la vida lenguaje en el que se especifican las instrucciones para la síntesis de proteínas. Síntesis de proteínas RNAm Codons Proteína caracter Transcripción Val ala leu Traducción Expresión

Evaluación de la variabilidad

Morfológica: Variabilidad en caracteres detectables ejemplo: Pez disco

Citogenética: Estudio de la morfología del cromosoma Bandeamiento Tinción Fish Cariotipo Ventajas: -Importante a falta de otras tecnicas Desventajas: -Tamaño y nº de cromosomas en peces - Tiempo, dificultad y costo

Izoenzimas: múltiples formas moleculares de una misma enzima Interpretación de bandas: Ventajas: Amplia información genética. Técnica relativamente barata y accesible. Carácter codominante Limitaciones: Número de loci limitado. Ausencia de polimorfismo genético para uno o varios loci. Enzima monomérica Enzima dimérica Enzima trimérica Enzima tetramérica Baja resolución cuando comparado a otras técnicas mas modernas. Diferencias en la movilidad de la enzima representan diferencias en el ADN

Marcadores basados en el análisis directo del ADN

Pesado de muestra (100mg) Digestión y maceración en buffer CTAB y proteinasa K Separación del material genómico EXTRACCIÓN DE ADN Protocolo CTAB (Doyle & Doyle, 1987) ADN Precipitado Resuspensión del ADN Agua Milli-q Secado y resuspensión del DNA Lavado

Polimorfismo a lo largo de fragmentos de restrinción - RFLP Ventajas: Carácter codominante Mayor detección de polimorfismo que las isoenzimas Puede cubrir todo el genoma Limitaciones: Sondas Gran nº de pasos Elevado costo

Marcadores moleculares basados en PCR

Reacción en cadena de la polimerasa - PCR Cebador o primer P C R Cebador o primer ADN polimerasa

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) Primers Palumbi & Benzie (1991) Condiciones de amplificación: MIX Para 30 l DNA molde (50ng/ l) Tampón de PCR Mix DNTPs (1mM) COIa (5 M) COIf(5 M) Taq (5 unidades /l) Agua miliq 2,7 l 3,0 l 3,0 l 3,0 l 3,0 l 0,15 l 15,15 l COIa 5, -AGT-ATA-AGC-GTC-TGG-GTA-GTC-3, COIf 5, -CCT-GCA-GGA-GGA-GGA-GAY-CC- 3, Perfil de temperatura 92ºC 1 30 ciclos 57ºC 1 72ºC 1 72ºC 5 Gel de agarosa 1,0% (brometo de etídeo)

RAPD (polimorfismo de ADN amplificado arbitrariamente) Ventajas: Simplicidad, rapidez y bajo costo. Detecta diferencias directamente en el gel. No requiere de biblioteca genomica. Limitaciones: Bajo contenido de información obtenida por loci. Apenas un alelo es detectado (segmento amplificado). Variaciones alelicas son clasificadas conjuntamente como un alelo nulo (dominancia de RAPD). No reproducible.

EPIC (Exon Primer Intron Crossing) Gen Exon Intron Exon CTAGCAAATTCATTACA CTAGCAAGCATTGGCA Exon Intron Exon Exon Exon Intron Intron Exon Exon Ventajas: TAGCAATCATTCA Utiliza primers que son diseñados en zonas conservadas de los exones. Es fácil de realizar. tiene un bajo costo con relación a otras técnicas. Desventaja: Muchas veces sus padrones de bandas son de difícil interpretación.

Amplificación Directa de Polimorfismo de Longitud (DALP) Ventajas: Amplia información genética para estudios a nivel poblacional. Limitaciones: Disponibilidad de información (en términos de secuencias nucleotidicas) a respecto de regiones que posean repeticiones para el organismo que se desea estudiar. Altos costos economicos. Tununtunumba Shica Habana Cerro alto Gel de agarosa 2% Gel de poliacrilamida 6% 3 ACTTTCACAGGAAACAGCTATGACTT 5 Dirección de la amplificación Primer selectivo Primer reverso Dirección de la amplificación 5 TGAAAGTGTCCTTTGTCGATACTGAA 3

SECUENCIAMIENTO NUCLEOTÍDICO Ventajas: Rapidez. Uno de los mas eficiente para estudiar la variabilidad. No requiere de biblioteca genomica. Limitaciones: Alto costo Requiere laboratorios altamente implementados y personal tecnico especializado.

Microsatélites Sitio de restricci ón A B C CTAGCAAATTCATTACA 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 D 1 2 3 4 1 2 Limitaciones: Ventajas: Mayor contenido de información de polimorfismo para estudios a nivel poblacional. Codominante y multialelico Gran trabajo previo para el desarrollo de los marcadores. Altos costos económicos.

Arapaima gigas Alcanza tallas de 3 metros y pesos de mas de 200 Kg. Se encuentra bajo fuerte explotación comercial. Desde los años 70 Reducción significativa de tamaño poblacional cerca de grandes ciudades amazónicas. Actualmente las poblaciones naturales están protegidas (Listada como especie con datos deficientes por la CITES desde 1975).

Caracterización molecular del paiche en el lago Imiria Objetivo: Estimar la variabilidad y diversidad genética de la población de paiche existente, para compararla con la variabilidad genética de los paiches que serán sembrados en la laguna.

Metodología de trabajo: Colecta de material biologico (nativos y a sembrar). Extracción y cuantificación de ADN. Amplificacion y lectura de 14 locis microsatelites.

Utilidad de los resultados obtenidos: Monitorear la evolución de la variabilidad genética de la población con el tiempo y determinar el grado de adaptación de los paiches sembrados. Conocer la proporción de individuos sembrados que participan efectivamente al aumento de la población (es decir a la producción de las nuevas generaciones), y si se están reproduciendo con los paiches nativos.

Caracterización molecular del paiche en el lago el Dorado - RNPS Objetivo: Evaluar la variación genética en el lago el dorado entre diferentes anos.

Estudios moleculares del paiche en la Reserva Nacional Pacaya-Samiria Evaluar la distribución de la variación genética dentro y entre localidades de muestreo. Estimar efectos de procesos demográficos pasados sobre la distribución de la diversidad genética. Estimar flujo génico (Nm) y tamaños poblacionales efectivos (Ne). Identificar áreas prioritarias de conservación y manejo sostenido.

Metodología de trabajo: Colecta de material biologico en cuatro puntos de la RNPS. Extracción y cuantificación de ADN. Amplificación y lectura de 14 locis microsatelites.

Poblaciones con baja diversidad genetica son (en promedio) las mas divergentes (por efecto de la deriva genetica) Allele diversity micsat r=0.9348 F=34.6626 P =0.0020 0.30 0.25 0.20 0.15 0.10 0.05 0.00 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 Fst (F ST = 0.1745, P < 0.001) (Bayesian exact test N.S.)

Utilidad de los resultados Estructura genética en el paiche es también causada por acción antropogénica? Reducción de la variación genética esta asociada con sobrepesca? Existe intercambio entre las poblaciones? (Flujo génico) Valores de Ne (Que proporción de la población esta contribuyendo al mantenimiento de la variabilidad) La mayor fracción de variación genética se encuentra lejos de grandes centros urbanos?.

Autocorrelacion espacial Estimar la distancia geográfica a la cual las poblaciones se diferencian genéticamente Aplicable a especies con distribución continua, o con poblaciones discretas conectadas por flujo génico (existe aislamiento por distancia) Análisis basado en correlaciones entre una matriz de distancias genéticas con una matrix binaria (0,1) de distancias geográficas (0=mayor o 1=menor que un valor umbral) F st1,2 480 1 F st1,3 F st2,3 1600 1120 0 1 F st1,4 F st2,4 F st3,4 2113 1633 513 0 0 1 F st1,5 F st2,5 F st3,5 F st4,5 2770 2290 1170 657 0 0 1 1

Gracias por su atención