norma española UNE-EN ISO 6222 Diciembre 1999 TÍTULO Calidad del agua Enumeración de microorganismos cultivables Recuento de colonias por siembra en medio de cultivo de agar nutritivo (ISO 6222:1999) Water quality. Enumeration of culturable micro-organisms. Colony count by inoculation in a nutrient agar culture medium. (ISO 6222:1999). Qualité de l'eau. Dénombrement des micro-organismes revivifiables. Comptage des colonies par ensemencement dans un milieu de culture nutritif gélosé. (ISO 6222:1999). CORRESPONDENCIA Esta norma es la versión oficial, en español, de la Norma Europea EN ISO 6222 de mayo 1999, que a su vez adopta íntegramente la Norma Internacional ISO 6222:1999. OBSERVACIONES ANTECEDENTES Esta norma ha sido elaborada por el comité técnico AEN/CTN 77 Medio Ambiente cuya Secretaría desempeña AENOR. Editada e impresa por AENOR Depósito legal: M 47264:1999 LAS OBSERVACIONES A ESTE DOCUMENTO HAN DE DIRIGIRSE A: 9 Páginas AENOR 1999 Reproducción prohibida C Génova, 6 28004 MADRID-España Teléfono 91 432 60 00 Fax 91 310 40 32 Grupo 9
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NORMA EUROPEA EUROPEAN STANDARD NORME EUROPÉENNE EUROPÄISCHE NORM EN ISO 6222 Mayo 1999 ICS 13.060.30 Versión en español Calidad del agua Enumeración de microorganismos cultivables Recuento de colonias por siembra en medio de cultivo de agar nutritivo (ISO 6222:1999) Water quality. Enumeration of culturable micro-organisms. Colony count by inoculation in a nutrient agar culture medium. (ISO 6222:1999). Qualité de l'eau. Dénombrement des micro-organismes revivifiables. Comptage des colonies par ensemencement dans un milieu de culture nutritif gélosé. (ISO 6222:1999). Wasserbeschaffenheit. Quantitative Bestimmung der kultivierbaren Mikroorganismen. Bestimmung der Koloniezahl durch Einimpfen in ein Nähragarmedium. (ISO 6222:1999). Esta norma europea ha sido aprobada por CEN el 1999-03-16. Los miembros de CEN están sometidos al Reglamento Interior de CEN/CENELEC que define las condiciones dentro de las cuales debe adoptarse, sin modificación, la norma europea como norma nacional. Las correspondientes listas actualizadas y las referencias bibliográficas relativas a estas normas nacionales, pueden obtenerse en la Secretaría Central de CEN, o a través de sus miembros. Esta norma europea existe en tres versiones oficiales (alemán, francés e inglés). Una versión en otra lengua realizada bajo la responsabilidad de un miembro de CEN en su idioma nacional, y notificada a la Secretaría Central, tiene el mismo rango que aquéllas. Los miembros de CEN son los organismos nacionales de normalización de los países siguientes: Alemania, Austria, Bélgica, Dinamarca, España, Finlandia, Francia, Grecia, Irlanda, Islandia, Italia, Luxemburgo, Noruega, Países Bajos, Portugal, Reino Unido, República Checa, Suecia y Suiza. CEN COMITÉ EUROPEO DE NORMALIZACIÓN European Committee for Standardization Comité Européen de Normalisation Europäisches Komitee für Normung SECRETARÍA CENTRAL: Rue de Stassart, 36 B-1050 Bruxelles 1999 Derechos de reproducción reservados a los Miembros de CEN.
EN ISO 6222:1999-4 - ANTECEDENTES El texto de la norma internacional del Comité Técnico ISO/TC 147 "Calidad del Agua", de la Organización Internacional de Normalización (ISO), ha sido adoptado como norma europea por el Comité Técnico CEN/TC 230 "Análisis del agua", cuya Secretaría desempeña DIN. Esta norma europea deberá recibir el rango de norma nacional mediante la publicación de un texto idéntico a la misma o mediante ratificación antes de finales de noviembre de 1999, y todas las normas nacionales técnicamente divergentes deberán anularse antes de finales de noviembre de 1999. De acuerdo con el Reglamento Interior de CEN/CENELEC, los siguientes países están obligados a adoptar esta norma europea: Alemania, Austria, Bélgica, Dinamarca, España, Finlandia, Francia, Grecia, Irlanda, Islandia, Italia, Luxemburgo, Noruega, Países Bajos, Portugal, Reino Unido, República Checa, Suecia y Suiza.
- 5 - EN ISO 6222:1999 INTRODUCCIÓN Las aguas, cualquiera que sea su naturaleza, contienen multitud de microorganismos de origen diverso, procedentes por ejemplo del suelo y de la vegetación, cuya estimación global proporciona información útil para la evaluación y control de la calidad del agua. Generalmente se efectúan recuentos independientes de los microorganismos capaces de crecer y formar colonias sobre medio de cultivo de agar nutritivo a 36 C y a 22 C. Los recuentos de las colonias son útiles para la evaluación del estado de los recursos de aguas subterráneas y de la eficacia de procesos de tratamiento del agua como la coagulación, la filtración y la desinfección y proporcionan indicación sobre la limpieza y el estado de los sistemas de distribución. Igualmente, pueden utilizarse para estimar la aptitud de un determinado suministro de agua para la preparación de alimentos y bebidas, en cuyo caso dicho agua no debería contener más que un pequeño número de microorganismos, para evitar la contaminación del producto por gérmenes contaminantes. El principal interés del recuento de las colonias reside en la posibilidad de detectar los cambios en relación a los números esperados, basándose en un control frecuente y a largo plazo. Todo aumento repentino del número obtenido puede advertir anticipadamente de la existencia de un foco serio de polución y requiere su inmediata investigación. 1 OBJETO Y CAMPO DE APLICACIÓN Esta norma europea especifica un método para la enumeración de los microorganismos cultivables presentes en el agua, mediante recuento de las colonias que se forman en un medio de cultivo de agar nutritivo tras incubación, en condiciones aerobias, a 36 C y 22 C. El método está destinado a medir la eficiencia operativa de los procesos de tratamiento de los suministros públicos de agua potable y es de aplicación general para todos los tipos de agua. Principalmente es aplicable al análisis de las aguas destinadas al consumo humano, incluyendo las aguas suministradas en recipientes cerrados y las aguas minerales naturales. 2 NORMAS PARA CONSULTA Esta norma europea incorpora disposiciones de otras publicaciones por su referencia, con o sin fecha. Estas referencias normativas se citan en los lugares apropiados del texto de la norma y se relacionan a continuación. Las revisiones o modificaciones posteriores de cualquiera de las publicaciones referenciadas con fecha, sólo se aplican a esta norma europea cuando se incorporan mediante revisión o modificación. Para las referencias sin fecha se aplica la última edición de esa publicación. EN ISO 3696 Agua para uso en análisis de laboratorio. Especificación y métodos de ensayo (ISO 3696:1987). EN ISO 5667-3 Calidad del agua. Muestreo. Parte 3: Guía para la conservación y la manipulación de las muestras (ISO 5667-3:1994). EN 25667-2 Calidad del agua. Muestreo. Parte 2: Guía para las técnicas de muestreo (ISO 5667-2:1991). ISO 6887 Microbiología. Guía para la preparación de diluciones para examen microbiológico. ISO 8199 Calidad del agua. Guía general para la enumeración de microorganismos en medios de cultivo. 3 DEFINICIONES Para los propósitos de esta Norma europea, se aplica la siguiente definición: microorganismos cultivables: Todas las bacterias aerobias, levaduras o mohos capaces de formar colonias en el medio específico y en las condiciones de ensayo descritas posteriormente.
EN ISO 6222:1999-6 - 4 FUNDAMENTO Se siembra, por mezclado con un medio de cultivo específico en placas Petri, volúmenes medidos de una muestra o de sus diluciones. Se incuban una serie de placas a 36 ºC, durante 44 h y otra serie a 22 ºC durante 68 h. Cálculo del número de unidades formadoras de colonias (u.f.c.) por mililitro (ml) de la muestra, a partir del número de colonias formadas en el medio. 5 APARATOS Y MATERIAL DE VIDRIO Material de uso habitual en laboratorios de microbiología y, en particular: 5.1 Equipo para la esterilización con calor húmedo (autoclave) 5.2 Estufa de incubación capaz de mantener una temperatura de (36 ± 2) ºC. 5.3 Estufa de incubación capaz de mantener una temperatura de (22 ± 2) ºC. 5.4 Placas Petri de vidrio o de plástico con un diámetro de 90 mm o de 100 mm. 5.5 Baño de agua o equipo similar capaz de mantener una temperatura de (45 ± 1) ºC. 5.6 Aparato contador de colonias equipado con un sistema de iluminación sobre fondo negro. 6 MUESTREO Las muestras de agua se toman de acuerdo a las instrucciones de muestreo, manipulación y conservación indicadas en las Normas EN 25667-2 y EN ISO 5667-3. Las aguas suministradas en recipientes cerrados, incluyendo las aguas minerales naturales, se analizan en las 12 h siguientes al embotellado, manteniendo una temperatura de (5 ± 3) ºC durante este período. 7 MEDIOS DE CULTIVO Y DILUYENTES 7.1 Materiales básicos Para la preparación del medio, se utilizan ingredientes de calidad uniforme y productos químicos de calidad analítica; como alternativa puede utilizarse un medio completo deshidratado equivalente y seguir las instrucciones del fabricante. Para preparar el medio se utiliza agua desionizada o destilada en un equipo de vidrio conforme al nivel de calidad 3 de la Norma EN ISO 3696, que esté libre de sustancias que pudieran inhibir el crecimiento en las condiciones del ensayo. NOTA Pueden utilizarse productos químicos de otras calidades siempre que se demuestre que presentan las mismas características de funcionamiento en el ensayo.
- 7 - EN ISO 6222:1999 7.2 Diluyente Para las diluciones, se utiliza el diluyente a base de peptona indicado en la Norma ISO 8199. 7.3 Agar de extracto de levadura Triptona (Peptona de caseína, pancr.) Extracto deshidratado de levadura Agar, en polvo o granulado Agua 6,0 g 3,0 g de 10 g a 20 g (según el poder gelificante) 1 000 ml Se añaden los ingredientes, o el medio completo deshidratado, al agua y se disuelve calentando. Se ajusta el ph si fuera necesario de modo que, tras la esterilización, tenga un valor de 7,2 ± 0,2 a 25 ºC. Se distribuyen en tubos, botellas u otros recipientes, volúmenes de medio de 15 ml a 20 ml. Para la conservación de volúmenes mayores se utilizan recipientes de hasta 500 ml de capacidad. Se esteriliza en autoclave (5.1) a (121 ± 3) ºC durante (15 ± 1) min. Para su empleo, se funde el medio, se deja enfriar y se mantiene a (45 ± 1) ºC en el baño de agua (5.5). Es recomendable no mantener el medio durante más de 4 h a 45 ºC. Transcurrido este tiempo el medio debe desecharse. 8 PROCEDIMIENTO 8.1 Preparación y siembra La preparación de la muestra, las diluciones y la siembra de los medios de cultivo se lleva a cabo conforme a las Normas ISO 8199, EN ISO 5667-3 e ISO 6887. Se utiliza el método de siembra en profundidad en placa (ISO 8199). Se pone un volumen de la muestra de ensayo (o de su dilución) que no supere los 2 ml en la placa Petri, se añaden de 15 ml a 20 ml de medio fundido (7.3) y se mezcla cuidadosamente mediante una suave rotación. Se deja solidificar el medio. El tiempo transcurrido entre la adición de la muestra de ensayo (o de su dilución) y la adición del medio fundido no debe superar los 15 min. Debe sembrarse como mínimo una placa para cada temperatura de incubación. 8.2 Incubación y examen Se invierten las placas y se incuba una serie a (36 ± 2) ºC durante (44 ± 4) h; la otra serie de placas se incuba a (22 ± 2) ºC durante (68 ± 4) h. Se examinan las placas tan pronto como se sacan de las estufas de incubación. Si no es posible realizar el examen de inmediato, se conservan a (5 ± 3) ºC y se examinan en las 48 h siguientes. Debe rechazarse toda placa que presente un crecimiento confluente. 8.3 Recuento de colonias Para cada temperatura de incubación, y siguiendo el procedimiento descrito en la norma ISO 8199, se cuentan las colonias que se observan en cada placa y se calcula el número estimado de unidades formadoras de colonias presentes en 1 ml de muestra.
EN ISO 6222:1999-8 - 9 EXPRESIÓN DE RESULTADOS Los resultados se expresan como el número de unidades formadoras de colonias por mililitro (ufc/ml) de muestra para cada temperatura de incubación. Si no hay colonias en las placas sembradas con los volúmenes de ensayo de la muestra sin diluir, los resultados se expresan como: no detectado en un mililitro. Si hay más de 300 colonias en las placas sembradas con las mayores diluciones utilizadas, los resultados se expresan como: > 300 o solamente como valores aproximados. 10 INFORME DE ENSAYO El informe de ensayo debe hacer referencia a esta norma europea y debe proporcionar toda la información relevante, incluyendo: a) todos los detalles necesarios para la identificación completa de la muestra; b) la técnica (siembra en profundidad en placa) y el medio utilizado; c) el tiempo y la temperatura de incubación; d) los resultados del recuento expresados de acuerdo al capítulo 9; e) toda incidencia observada en el transcurso del análisis y cualquier otro hecho relevante que concierna al procedimiento seguido.
- 9 - UNE-EN ISO 6222 ANEXO NACIONAL Las normas que se relacionan a continuación, citadas en esta norma europea, han sido incorporadas al cuerpo normativo UNE con los siguientes códigos: Norma Internacional Norma UNE EN ISO 3696:1995 UNE-EN ISO 3696:1996 EN ISO 5667-3:1995 UNE-EN ISO 5667-3:1996 EN 25667-2:1993 UNE-EN 25667-2:1995
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