LEUCEMIA MIELOIDE CRÓNICA 1. Tablas de resumen de las pruebas genéticas Panel Muestra Observaciones Cariotipo MO Siempre. En SP si aspirado de MO seco FISH MO Muy aconsejable. Obligado si cariotipo no adecuado Diagnóstico RT-nested SP Siempre BCR-ABL (IS) SP Opcional, pero muy recomendado Mutación SP En fase acelerada o blástica Cariotipo MO Muy aconsejable. Mes 3, 6 y cada 6 meses hasta la RCgC. Obligado si no puede usarse la RQ-BCR/ABL1 (IS) Para confirmar RCC cuando no es posible usar la RQ-bcr-abl FISH SP Seguimiento (IS) y no deseamos hacer cariotipo medular BCR-ABL (IS) SP Al menos cada 3 meses hasta RMolM. Luego al menos cada 6 m. Mutación SP Si criterios de fallo o aviso o previo a cambio de ITC Muestra: Cariotipo y FISH en heparina (verde), generalmente MO (2-5 ml). PCR y mutación en EDTA (malva), generalmente SP (5-10 ml) Tiempo máximo deseable. Al diagnóstico FISH: una semana, PCR: 2 semanas, cariotipo: 3 semanas. Durante el seguimiento PCR: 4 semanas, cariotipo: 6 semanas. Si urgencia clínica: FISH en 72 horas, PCR: una semana, cariotipo: 2 semanas. Definiciones de respuesta hematológica, citogenética y molecular L < 10.000/mm3, basófilos <5%, no mielocitos, promielocitos ni R Hematológica completa (RHC) mieloblastos, Plaquetas <450.000/mm3, bazo no palpable R citogenética completa (RCgC) No se detectan metatases Ph + R citogenética parcial (RCgP) 1-35% metafases Ph+ R citogenética menor (RCgmen) 36-65% de metafases Ph+ R citogenética mínima (RCgmin) 66-95% Ph+ R citogenética nula (norcg) 96-100% Ph+ 10%, 1%, 0.1%, 0.01%, 0.0032%, y 0.001% corresponden a un R molecular descenso de 1, 2, 3, 4, 4.5, y 5 logs. R molecular mayor (RMolM) Ratio BCR-ABL/ABL <= 0,1% en IS si enfermedad detectable con <= 0.01% BCR-ABL1 IS o enfermedad RM4 indetectable en cdna con =>10 000 transcritos de ABL1 si enfermedad detectable con <=0,0032 BCR-ABL1 IS o enfermedad RM4.5 indetectable en cdna con =>32000 transcritos ABL1 si enfermedad detectable inferior o igual a 0.001% BCR-ABL1 IS o hay RM5 enfermedad no detectable con un nº de copias ABL >= 100,000 Leucemia indetectable Con especificación del número de tránscritos La RCg en MO se evaluará hasta alcanzar la RCgC a mes 3 y 6, y luego cada 6 meses. Es deseable que la primera RCgC se confirme bien con otro cariotipo o un FISH negativo o una BCR-ABL(IS) <1%. Luego el control citogenético puede sustituirse por la monitorización molecular en SP, pero siempre se indicará un cariotipo medular en fallo de tratamiento o citopenias no explicadas. La evaluación citogenética precisa al menos 20 metafases. FISH no sustituye al cariotipo salvo cuando este no puede realizarse, incluso en este caso solo sirve para confirmar una RCgC, pero no para graduar la respuesta. La R molecular se evalúa cada 3 meses hasta alcanzar la RMolM, luego al menos cada 6 meses. Es altamente aconsejable que la evaluación durante los primeros 12 meses hasta alcanzar la RCgC se realiza tanto con cariotipo medular como RQ-BCR/ABL (IS) pero podría hacerse solamente con BCR-ABL (IS). Protocolo de estudios genéticos en la Leucemia Mieloide Crónica. GEHM. AGHH. Ver 2. Marzo 14. Página 1 de 7
Evaluación de la respuesta en LMC en primera línea según ELN 2013 Optima Aviso Fallo Basal Alto riesgo o CCA/Ph+ ruta mayor 3 meses BCR-ABL1 <=10% y/o Ph+<=35% BCR-ABL1 >10% y/o Ph+ 36-96% No RHC y/o Ph+>95% 6 meses BCR-ABL1<=1% y/o Ph+ 0% BCR-ABL1 1-10% y/o Ph+ 1-35% BCR-ABL1>10% y/o Ph>35% 12 meses BCR-ABL1<=0,1% BCR-ABL1 >0,1-1% BCR-ABL>1% y/o Ph+> 0% Luego y en cualquier momento BCR-ABL1<=0,1% CCA/Ph- (-7, o 7q-) Pérdida de la RHC; Pérdida de la RCC; Pérdida confirmada de la RMM con al menos un valor>=1%; Mutaciones; CCA/Ph+ Este criterio se aplica en LMC FC, FA o CB cuando se tratan con ITC en primera línea, también en segunda línea si el cambio fue por intolerancia. Basal Criterios ELN 2013 de respuesta a DA ó NI después de fallo a IM Optimo Aviso Fallo No RHC o pérdida de la RHC con IM o ausencia de alguna RCg al ITK de primera línea o alto riesgo 3 meses BCR-ABL1 <=10% y/o Ph+<65% 6 meses BCR-ABL1 <=10% y/o Ph+<35% 12 meses BCR-ABL1 <1% y/o Ph+< 0% Luego y en BCR-ABL1 <=1% cualquier tiempo BCR-ABL1 >10% y/o Ph+ 66-95% No RHC o Ph>95% o nuevas mutaciones Ph+ 35-65% BCR-ABL1 >10% y/o Ph+>65% y/o nuevas mutacioines BCR-ABL1 1-10% y/o Ph+ 1- BCR-ABL1 >10% y/o Ph+ 35% >35% y/o nuevas mutaciones CCA/Ph ( 7 or 7q ) Pérdida de la RHC o Pérdida o BCR-ABL1 >0.1% de la RCC o RCP; Nuevas mutaciones; Pérdida confirmada de la RMM (en dos test consecutivos, uno de ellos >=1%); CCA/Ph+ 2. Estudios al diagnóstico Panel: Siempre citogenética en MO (en SP solo si no se dispone de MO) con análisis de al menos 20 metafases. Siempre PCR para bcr-abl en SP por RT-nested para identificar el transcrito. Opcional la PCR cuantitativa para bcr-abl en SP. La utilización de la escala internacional IShace innecesaria la cuantificación del BCR-ABL al diagnóstico, pues la cantidad de transcrito se compara con un patrón de referencia. Sin embargo la IS solo se aplica para el p210. FISH siempre es deseable como confirmación del hallazgo citogenético e imprescindible cuando no se dispone de cariotipo (aspirado seco) o cuando el cariotipo es normal pero la citología es sugestiva de LMC (5% de falsos negativos por cariotipo convencional). También Protocolo de estudios genéticos en la Leucemia Mieloide Crónica. GEHM. AGHH. Ver 2. Marzo 14. Página 2 de 7
es obligado si no está disponible la PCR, pues el hallazgo citogenético del cromosoma Ph siempre debe ser confirmado por un FISH y/o una PCR. Mutaciones solamente si la LMC se presenta en fase acelerada o crisis blástica Muestra: Cariotipo y FISH: heparina (verde), al menos 2 ml, preferiblemente en MO PCR para RT-nested. EDTA (malva), 3 ml de SP. PCR cuantitativa para BCR-ABL. EDTA (malva) 3 ml de SP. Durante el seguimiento de paciente tratado con ITC se precisa mayor volumen, especialmente cuando interesa cuantificar el grado de respuesta molecular profunda, en estos casos se aconseja 10 ml. Mutaciones. SP, EDTA (malva), 3 ml Interpretación de los estudios genéticos al diagnóstico El estudio genético para la traslocación 9;22 (BCR-ABL) está indicado cuando la hematimetría y morfología son compatibles con LMC. También se solicitará antes aparentes casos de TE, mielofibrosis, SMD, LMMC ó leucemia aguda. El cariotipo, la PCR y/o FISH deben ser positivos. El FISH es un método muy rápido, y permite confirmar en 48-72 horas una sospecha diagnóstica. El cariotipo a veces es normal (translocación críptica en 5%). Las translocaciones variantes ( 2-10%) no tienen significado clínico, las más frecuentes son: t(3;9;22)(p21;q34;q11) y la t(17;9;22)(q25;q34;q11) Las anomalías citogenéticas adicionales (ACC) en el clon Ph+ ocurren en el 5% de FC al diagnóstico y en el 60%-80% en las crisis blásticas y en el 45% de los casos resistentes a ITC. Las más frecuentes son +8 (34%), +Ph (30%), i(17q) (20%), +19 (13%), Y(8% de los hombres), +21 (7%), +17 (5%), y el 7 (5%). Al diagnóstico se consideran un aviso, cuando surgen durante el tratamiento son un criterio de fase acelerada. El punto de rotura de ABL1 es constante pero el de BCR varía, dando lugar a proteínas con diferente número de aminoácidos, la más frecuente es BCR mayor (p210), luego la BCR minor (p190) y muy rara la p230. El reordenamiento p190 tiene una peor respuesta a los ITC. Entre las p210 puede haber diferentes trascritos, sobre todo el e13a2 (b2a2) y el e14es (b3a2), no está claro si ello tiene implicaciones clínicas. Recordar que el reordenamiento BCR-ABL1 también ocurre en la LAL. En la LAL el reordenamiento casi siempre genera una p190, pero el estudio genético no permite diferenciar las dos entidades. Nivel de RQ-BCR/ABL: no tiene significado al diagnóstico, pero es imprescindible para evaluar la respuesta molecular. 3. Seguimiento. Cariotipo en MO (véase tablas). A mes 3, 6 y 12 hasta alcanzar la RCgC. Para que la evaluación sea correcta se precisan 20 metafases En paciente que no alcanza la RCgC se aconseja repetir el cariotipo cada 3-6 meses mientras se disponga de opciones terapéuticas, es decir se estén evaluando distintos ITC. Una vez que se agoten las opciones, generalmente después de dos años de terapia, se indicará solo si sospecha de progresión a FA-CB. Protocolo de estudios genéticos en la Leucemia Mieloide Crónica. GEHM. AGHH. Ver 2. Marzo 14. Página 3 de 7
Una vez alcanzada la RCgC el seguimiento se hará por RQ-PCR y el estudio citogenético en MO se debe individualizar. La principal indicación de repetir el cariotipo es la pérdida de la respuesta morfológica, o molecular, y en presencia de citopenias inesperadas (posible evolución a un SMD). Interpretación del grado de respuesta. Véase la tabla. El alcanzar la RCgC es el principal factor pronóstico para supervivencia ACC/PH+ de la ruta mayor son un warning cuando aparecen al diagnóstico y un fracaso y FA si aparecen durante el tratamiento. Estas anomalías son: trisomía 8, trisomía Ph (+der(22) t(9;22)(q34;q11)), isocromosoma 17 (i(17)(q10)), trisomía 19, y ider(22)(q10)t(9;22)(q34;q11). Cualquier ACC/Ph+ debe ponernos en alerta y es una indicación de búsqueda de donante. Las ACC/Ph- son muy frecuentes (5-10%) en la mayoría de los casos no tienen significado clínico. Sin embargo consideraremos un warming si se asocian con citopenias, displasia morfológica o cuando afectan al cromosoma 7 (-7, o 7q-). En estos casos puede ocurrir una evolución a un SMD o una LMA. FISH para bcr-abl. Prueba complementaria a la citogenética. No indicado de rutina durante el seguimiento pues la RQ-BCR/ABL1 aporta más sensibilidad Puede considerarse en la LMC p190 dado que no podemos hacer el seguimiento por RQ- BCR/ABL (IS). El FISH negativo confirma una RCgC, un FISH positivo puede indicar que el paciente no está en RCgC, pero si es en nivel bajo también puede ser un falso positivo. Puede realizarse en SP o MO RQ-PCR para bcr-abl (cuantificación del tránscrito bcr-abl). Muestra. Siempre en SP y volumen 5-10 ml EDTA. Es importante enviar suficiente volumen de sangre sobre todo si hay leucopenia. Informar de la cifra de leucocitos al laboratorio. Inicialmente cada 3 meses. En pacientes con RMolM confirmada, y sobre todo a partir del 2º años puede pasarse a controles cada 6 meses. Si niveles oscilantes alrededor de la RMolM: cada 1-3 meses Cambios en el nivel transcrito o Paciente con nivel RQ IS > 10%. Los cambios en el RQ no tienen significado o Un aumento de 5 veces o una pérdida de la RMolM es indicación de una segunda determinación al mes, y si se confirma se estudiarán las mutaciones y se realizará un cariotipo medular. Informe: o Se expresará en % estandarizado (IS) y en reducción logarítmica. El laboratorio también informa de la ratio no estandarizada (no confundir). o Se define RMM: RQ estandarizado (IS) es <= 0,1% o cuando hay una reducción de 3 log. El alcanzar una RMM se asocia a una muy baja probabilidad de progresión. Un valor de IS>1% a partir de los 12 meses es criterio de fracaso. La respuesta molecular profunda (RM 4 o más) y estable es requisito previo para una discontinuación exitosa. o El aumento del transcrito debe poner en alerta de una próxima pérdida de la respuesta citogenética y evaluar las causas siendo las principales la mala adherencia y las mutaciones. o La reducción del transcrito individual frente al valor basal (no IS) es otro método de evaluar la respuesta pero se aconseja mejor usar el IS y los criterios ELN o Correlación entre Rmol y RCg: Un valor del 10% y 1% equivalen de forma aproximada a la RCP y RCC respectivamente Protocolo de estudios genéticos en la Leucemia Mieloide Crónica. GEHM. AGHH. Ver 2. Marzo 14. Página 4 de 7
Mutaciones Técnica: secuenciación directa (sensibilidad 10-20%). Muestra EDTA en SP (puede usarse el ADN ya extraído para la RQ-PCR) Indicado el estudio al diagnóstico si FA o CB. Durante el seguimiento está indicado cuando hay criterios de fallo o alarma (véase las tablas) y transformación a FA o CB. También está indicado previo a un cambio de ITC y cuando hay un aumento relevante del transcrito. Los fracasos hematológicos, citogenéticos o moleculares primarios no suelen presentar mutaciones. Estas son más frecuentes en resistencias adquiridas y en la transformación a FA/CB y en los pacientes con historia previa de mutaciones. La tabla superior muestra la sensibilidad in vitro de las mutaciones más frecuentes. Las mutaciones más frecuente son T315I, Y253F/H, E255K/V, M351T, G250E, F359C/V, H396R/P, M244V, E355G, F317L y L248V. Puede haber más de una mutación a la vez o secuencial. La T315I confiere resistencia total a todos los ITC menos ponatinib. Las mutaciones T315A, F317L o V299L son insensibles a Dasatinib, las Y253H, E255K/V y F359C/V son insensibles a Nilotinib y las E255K y V299L a busotinib. 4. LMC y alotrasplante Monitorización similar al paciente no trasplantado. Inicialmente con cariotipo y si RCgC se monitoriza por RQ-BCR/ABL. La ausencia de RCgC es indicación de tratamiento (ILD y/o ITC). Un RQ-BCR-ABL negativo indica un bajo riesgo de recaída. Un valor positivo a partir del mes 6 pos alotrasplante se asocia a riesgo de recidiva y también puede ser indicación de tratamiento sobre todo cuando se observa aumento del transcrito. Es aconsejable una técnica cuantitativa, pero no se ha avaluado el IS en el contexto del TPH. Sigue siendo válida las definiciones del EBMT y de NIH en Bethesda de 2011, que definen como recaída molecular la ratio igual o superior a 0,02% en tres determinaciones consecutivas separadas entre sí por al menos 4 semanas o en dos determinaciones separadas por 4 semanas con la segunda de las determinaciones igual o superior a 0,05%. Protocolo de estudios genéticos en la Leucemia Mieloide Crónica. GEHM. AGHH. Ver 2. Marzo 14. Página 5 de 7
6.- Anexos: tablas de interés Criterios LMC-FC OMS ELN MDACC % blastos en M.O. o sangre periférica. % blastos + <10% <15% <15 % <30 % promielocitos Basofilos en SP ó MO <20%. <20% <20% Plaquetas > 100 x10 9 /L > 100 x10 9 /L > 100 x10 9 /L <1000 x10 9 /L Bazo Normal o aumentado Normal o aumentado Normal o aumentado Citogenética Presencia de Ph Presencia de Ph Presencia de Ph Definición de FA y CB Fase acelerada ELN Blastos SP ó MO 15-29% ó blastos+promielocitos SP ó MO >30% con blastos <30% Basófilos SP>= 20% Trombopenia <100.000/mm3 (no relacionada con citorreducción) Anomalías cromosómicas clonales en células Ph+ (CCA/Ph+) de la ruta mayor que aparecen durante el tratamiento FA criterios WHO Blastos en SP ó MO 10-19% Basófilos en SP >= 20% Trombopenia <100.000/mm3 no relacionado con la terapia CCA/Ph+ durante el tratamiento Trombocitosis >1000.000/mm3 sin respuesta al tratamiento Aumento del tamaño del bazo o del recuento leucocitario que no responde a la terapia CB criterios ELN Blastos en SP ó MO >= 30% Proliferación blástica extramedular aparte del bazo CB criterios WHO Blastos en SP ó MO >=20% Proliferación blástica extramedular aparte del bazo Grandes focos o cluster de blastos en la BO CCA/Ph+ ruta mayor: trisomía 8, trisomía Ph (1der(22)t(9;22)(q34;q11)), isocromosoma 17 (i(17)(q10)), trisomía 19, y ider(22)(q10)t(9;22)(q34;q11). Su presencia al diagnóstico es un warning, su aparición durante el tratamiento es un criterio de FA Protocolo de estudios genéticos en la Leucemia Mieloide Crónica. GEHM. AGHH. Ver 2. Marzo 14. Página 6 de 7
Bibliografía seleccionada European LeukemiaNet recommendations for the management of chronic myeloid leukemia: 2013. Blood. 2013;122(6):872-884 --------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- Manual de diagnóstico genético y seguimiento de las neoplasias hematológicas. Editado por el Grupo para el Estudio de las Hemopatías Malignas de Galicia (GEHMA) de la Asociación Gallega de Hematología y Hemoterapia (AGHH) Capítulo: leucemia mieloide crónica Autor: Manuel M. Pérez Encinas. Complexo Hospitalario Universitario de Santiago (CHUS.) Revisión por Teresa González y Celsa Quinteiro. Fundación Pública de Medicina Xenómica (FPMX) de Galicia. Versión 2º. Actualizado a 2/03/14. Protocolo de estudios genéticos en la Leucemia Mieloide Crónica. GEHM. AGHH. Ver 2. Marzo 14. Página 7 de 7