FUENTES AGRICOLAS Y SUERO DE QUESO COMO SUSTRATOS PARA LA PRODUCCION DE BIOMASA PROBIOTICA

FUENTES AGRICOLAS Y SUERO DE QUESO COMO SUSTRATOS PARA LA PRODUCCION DE BIOMASA PROBIOTICA Jimenez Vera, Roman 1 Magana Contreras, Arturo 1 Gonzalez Cortes, Nicolas 1 Chab Garda, Cristina Leonor 1 Zetina Moreno, Zabdy Kristel 1 RESUMEN El mercado de los probi6ticos se ha desarrollado basicamente en los productos lacteos, por lo que Ia busqueda de medics y condiciones de cultivo que permitan Ia obtenci6n de altas densidades de microorganismos ( >1 7 UFC mp) ha sido Ia meta de muchas investigaciones. El objetivo de este trabajo fue cultivar bacterias lacticas probi6ticas mediante cultivo sumergido discontinue utilizando fuentes naturales como sustratos. Se compar6 el crecimiento de los probi6ticos Lactobacillus casei Shirota y Lactobacillus johnsonii en jugo de naranja (Citrus sinensisl.), agua de coco (Cocus n ucifera), jugo de cana de azucar (Saccharum officinarum) y suero de queso. Las cepas probi6ticas se obtuvieron de productos comerciales: Lactobacillus casei Shirota (Yakult ) y Lactobacillus johnsonii (Chamyto ). El cultivo se realiz6 en frascos de fermentaci6n de 25 ml, se incub6 a 37 C, sin agitaci6n. La respuesta a evaluar fue Ia concentraci6n bacteriana (UFC mi 1 ). El crecimiento bacteriano se cuantific6 por el metoda de cultivo en superficie modificado utilizando agar MRS. Se utiliz6 un diseno factorial general2 x 4 (dos bacterias y cuatro sustratos). En jugo de naranja se obtuvo Ia mayor concentraci6n de Lactobacillus johnsonii (9.39 ±.18) y un buen crecimiento de Lactobacillus casei Shirota (8.65 ±.31), ya que Ia mayor concentraci6n de este ultimo se observ6 en suero de queso (9.12 ±.25). Probablemente, este crecimiento estuvo asociado a Ia concentraci6n de protefnas y lactosa presentes en el suero, asf como a Ia concentraci6n de azucares del jugo de naranja. Las concentraciones de biomasa probi6tica obtenidas en este trabajo sobrepasaron el valor de > 1 7 UFC ml 1 esperado en muchas investigaciones. La producci6n de biomasa a partir de sustratos naturales es una alternativa para el aprovechamiento de recursos naturales, ya que se contribuye a Ia diversificaci6n y se proporciona valor agregado a los recursos agroindustriales de Ia regi6n. Palabras clave: Agua de coco, jugo de cana de azucar, jugo de naranja, probi6ticos, suero de queso. SUMMARY The market of probiotics has been developed primarily in dairy products. The goal of much research has been finding ways and culture conditions that can 1 Division Academica Multidisciplinaria de los Rios de Ia Universidad Juarez Aut6noma de Tabasco. Carretera Tenosique-[stapilla, km. 1 Tenosique, Tabasco. Tel. (934) 34 2211. * Autor para correspondencia; e 1na1l: roman.jimenez@damr.ujat.mx. l N F O R M A 49

produce high densities of microorganisms ( > 1 7 CFU ml- 1 ). The aim of this study was to cultivate probiotic lactic acid bacteria by submerged batch cultivation using natural sources as substrates. The growth of probiotics Lactobacillus casei Shirota and Lactobacillus johnsonii in orange juice (Citrus sinensis L.), coconut water (Cocus nucifera), sugarcane juice (Saccharum officinarum) and whey of cheese was compared. The probiotic strains were obtained from commercial products: Lactobacillus casei Shirota (Yakult ) and Lactobacillus johnsonii (Chamyto ). The bacterial culture was held in fermentation bottles of 25 ml, was incubated at 37 C, without agitation. The bacterial concentration (CFU mj-1) was the parameter to assess. Bacterial growth was quantified by the surface culture method using MRS agar. A general factorial design 2 x 4 (two bacteria and four substrates) was used. In orange juice had the highest concentration of Lactobacillus 1 johnsonii (Log 1 9.39 ±.18 CFU ml- ) and good growth of Lactobacillus casei Shirota (Log 1 8.65 ±.31 CFU mj-1). The best concentration of Lactobacillus casei Shirota was obtained from cheese of whey (Log 1 9.12 ±.25 CFU mj-1). Probably, bacterial growth was associated with protein and lactose concentration in the serum and the concentration of sugars in orange juice. Probiotic biomass concentrations obtained in this study were greater than the value of > 17 CFU mj-1 expected in many investigations. Probiotic biomass concentrations obtained in this study were greater than 1 7 CFU mp, expected value in many investigations. Biomass production from natural substrates is an alternative to the use of natural resources. This process contributes to the diversification and provides value added agro-industrial resources of the region. Keys words: Coconut water, orange juice, probi6tics, sucarcane juice, whey. INTRODUCCION Las bacterias lckticas son un grupo de microorganismas ampliamente utilizados como probi6ticos. Entre los mas estudiados se encuentran las cepas de Lactobacillus acidophil/us, Lactobacillus casei y Lactobacillus ramhnosus. (Forero-Gomez y Vera-Cala, 25). Su efecto benefice en Ia salud humana y animal, asf como en Ia inocuidad alimentaria esta confirmado. Sin embargo, aunque su empleo en diversos sectores es amplio, en Ia actualidad solamente existen medios comerciales de cultivo orientados a su aislamiento e identificaci6n, como MRS (Man eta/., 199), Rogosa (Tamime eta/., 1995) y LAMVAB (Hartemink eta/., 1997). Se han propuesto medios de cultivo para bacterias lacticas, como los reportados por Tharmaraj y Shah (23) para Ia diferenciaci6n de grupos bacte rianos probi6ticos y Mufl.oa y Pares (1988) para el crecimiento e identificaci6n de bifidobacterias, asf como para Ia obtenci6n de biomasa. Her eta/. (24), evaluaron el medio MRS y WY para el crecimiento de Bifidobacterium; Vamanu eta/. (21), empleando cultivo por lote y medio de cultivo estandar, comprobaron Ia obtenci6n de biomasa de Lactobacillus acidophilus; Campeanu eta/. (22), estimaron un medio compuesto principalmente por glucosa (3.6%) para el crecimiento de Lactobacillus plantarum. La aplicaci6n de los probi6ticos en el mejoramiento de Ia salud, conservaci6n de alimentos y producci6n animal ha generado Ia necesidad de contar con los sustratos disponibles para su producci6n. Los medios de cultivo tradicionalmente usados en el cultivo de biomasa probi6tica son complejos, de costos elevados y diffciles de adquirir. Sin embargo, hay reportes del uso de medios naturales para el crecimiento de microorganismos, por lo que se busca emplear sustratos disponibles en Ia region que puedan servir como sustratos para el crecimiento de estas bacterias. En Tabasco, Ia falta de procesos para el aprovechamiento del suero en Ia elaboraci6n de quesos hace que constituya un desecho contaminante. De igual manera, Ia extracci6n de aceites genera una cantidad considerable de contaminaci6n al desechar el agua de coco. En cuanto al jugo de cana de azucar y de 5 l N F O R M A

naranja, no se han utilizado procesos tecnol6gicos que permitan diversificar sus usos. Es importante destacar Ia importancia de los probi6ticos en Ia inocuidad alimentaria y Ia salud animal. En el estado de Tabasco, Ia producci6n quesera es una de las principales actividades econ6micas. El queso es un alimento que por sus caracterfsticas fisicoqufmicas y disponibilidad de nutrimentos es muy facil de contaminar, ya sea durante Ia elaboraci6n o durante el manejo para su distribuci6n y venta. Por otra parte, tambien es una practica comun alimentar a animales con desechos naturales. Con Ia generaci6n de biomasa probi6tica a partir de estos sustratos se presenta una opci6n para mejorar Ia calidad de productos de consumo humano, asf como aumentar Ia productividad en Ia producci6n animal. Los resultados obtenidos proporcionaran alternativas para el aprovechamiento de recursos naturales de Ia region en Ia producci6n de probi6ticos. Se clara valor agregado a los residuos de Ia agroindustria como el suero de queso, agua de coco, jugo de cafia y naranja, con lo cual se contribuira a aumentar Ia diversificaci6n de productos y a disminuir Ia contaminaci6n ambiental. MATERIALES Y METODOS Se utiliz6 jugo de cafia de azucar (Saccharum officinarum) obtenido mediante molienda tradicional en trapiche, de cafia de azucar proveniente de cultivos de Ia region con un fndice de madurez de.9 (Rincon, 25). El jugo de naranja se obtuvo de naranjas dulces maduras (Citrus sinensis L.) mediante exprimidor electrico en el laboratorio, con un fndice de madurez mayor a 12 (Moreno eta/., 26). Se utilizaron cocos verdes y el agua se extrajo en ellaboratorio. El suero de queso fue proporcionado de una fabrica de quesos tipo cotija del municipio de Tenosique, Tabasco. A todos los sustratos se les midio Ia concentracion de Brix utilizando un refractometro Abbe (Bausch y Lomb, Rochester, NY, USA). Se utilizaron cepas de Lactobacillus casei Shirota y Lactobacillus johnsonii contenidas en bebidas ladeas fermentadas comerciales: Lactobacillus casei Shiro ta (Yakult ) y Lactobacillusjohnsonii (Chamyto ). La concentracion bacteriana se cuantifico por el metodo de Ia gota (Corona y Jimenez, 24) utilizando agar MRS incubado a 37 C durante 48 h en anaerobiosis (Rosenblatt y Stewart, 1975). El cultivo se realizo a escala de laboratorio mediante fermentacion por lote en frascos con capacidad de 15 ml. Como caldo de cultivo se utilizaron los sustratos naturales (jugo de cafia de azucar, jugo de naranja, agua de coco y suero de queso) al 1%. El sustrato se esterilizo durante 15 minutos a 121 C. El inoculo bacteriano (1%) se tomo directamente de los productos comerciales. Los frascos de cultivo se incubaron a 37 C durante 24 h, sin agitacion. Se tomaron muestras a las, 3, 6, 9 y 24 h. Se utilizo un disefio factorial general2 x 4, donde el primer factor representa las dos bacterias lacticas (Lactobacillus casei Shirota y Lactobacillus Johnsonii), el segundo factor, los cuatro sustratos naturales (jugo de cafia de azucar, jugo de naranja, agua de coco y suero de queso). Como variable de respuesta se evaluo Ia concentracion bacteriana en unidades formadoras de colonias por mililitro expresadas en logaritmo (Log 1 UFCml 1). RESULTADOS Y DISCUSION Con Ia finalidad de utilizar medios naturales como sustrato para el cultivo de bacterias probioticas, se cuantific6 Ia concentracion de azucares de los sustratos mediante Ia medicion de los grados Brix, lo cual se observa en el Cuadro 1. En el jugo de naranja se obtuvo Ia mayor concentracion de azucares (ll.oobrix), por arriba del jugo de cafia de azucar; el agua de coco fue el sustrato con menor concentracion de azucares. Aunque tradicionalmente, el jugo de cafia de azucar se ha empleado para Ia extraccion de sacarosa, Ia l N F O R M A 51

concentraci6n obtenida en este sustrato (8.8oBrix) fue baja, debido probablemente a Ia madurez de Ia cafia de azucar. Cuadro 1. Medici6n de concentraci6n de azucares en sustratos naturales. Sustratos Jugo de naranja Jugo de cana de azucar Suero de queso Agua de coco Concentraci6n de azucares En Ia Figura 1se muestra el crecimiento de Lactobacillus casei Shirota en sustratos naturales durante 24 h con muestreo a las, 3, 6, 9 y 24 h. La mayor concentraci6n de este probi6tico se obtuvo en suero de queso a las 24 h de cultivo (Log 9.12 ±.25 UFC mj-1), seguido 1 del jugo de naranja (Log 8.65 ±.31 UFC ml 1 ) 8rix a las 9 h de cultivo. La mayor concentraci6n en el suero de queso probablemente estuvo asociado a Ia 11. concentraci6n de lactosa como fuente de carbone, ya 8.8 que se ha reportado que el suero de queso contiene una 6.2 concentraci6n de 4.94 ±.47% de este carbohidrato 5. (Souza eta/., 28). 1 En el Cuadro 2 se muestra el crecimiento de las bacterias probi6ticas Lactobacillus casei Shirota y Lactobacillus johnsonii a las 24 h de cultivo en los sustratos naturales. En ambas cepas, el crecimiento fue mayor en jugo de naranja, esto se relaciona con Ia mayor concentraci6n de azucares presente en este sustrato (ll.oobrix) asf como con Ia variedad de azucares.se ha reportado que eljugo de naranja fresco contiene sacarosa, glucosa y fructosa que en conjunto constituyen el 75% de los s61idos solubles totales; Ia concentraci6n de fructosa en el jugo de naranja se encuentra entre el 4 y 45% de los s61idos (Esquivei Solfs y Gomez-Salas, 27). Por otra parte, en jugo de cafia de azucar se obtuvo Ia menor concentraci6n de ambos probi6ticos. La sacarosa es el principal azucar del jugo de cafia, lo que sugiere que este azucar no es una fuente de carbono preferente para las bacterias lacticas probi6ticas o su alta concentraci6n inhibi6 el crecimiento de las mismas. Cuadro 2. Crecimiento de Lactobacillus casei Shirota y Lactobacillus johnsonii sustratos naturales a las 24 h. Sustrato L. casei Shirota L. johnsonii Agua de coco Jugo de cana Jugo de naranja 5.79 ± 1.5 5.5 ±.62 8.49 ±.16 7.6 ±.21 6.9 ±.78 9. ±.12 Suero de queso 7.99 ± 1.48 8.47 ± 1.5 ::J E 1 8 u. :::> 1 c!. c: 6 u c c: u 4 2 +------- ---- ------ ------ ------ 3 6 Tiempo (h) -+-Aa de Coco -.Ngo de Cala Jugo de Narar>Ja - :IE 9 24 Suero de Queso Figura 1. Crecimiento de Lactobacillus casei Shirota en sustratos naturales. Ademas, se ha reportado que todas las bacterias lacticas comparten Ia cualidad de fermentar Ia lactosa como sustrato preferencial para producir, en distinta cantidad, acido lactico (Villegas, 24). En este trabajo se muestra Ia preferencia de Lactobacillus casei Shirota por Ia lactosa presente en el suero de queso como fuente de carbono al obtenerse una alta concentraci6n de biomasa, ya que en jugo de cafia, donde se obtuvo una baja concentraci6n de biomasa, el principal azucar t. tilizado como fuente de carbone fue Ia sacarosa. La concentraci6n de sacarosa en jugos de buena calidad se encuentra entre 12.5 y 15.% y menos de 1.% corresponde a azucares reductores como glucosa y fructosa (Salgado eta /., 23). 52 l N F O R M A

Otra caracterfstica que pudo influir en el buen crecimiento de Lactobacillus casei Shirota en el suero de queso fue Ia presencia de una mayor concentraci6n de protefnas. En un estudio reportado por Barboza et a/. (1994), se encontr6 que el aumento en el crecimiento de Lactobacillus p/antarum ATCC 814 y Lactobacillus casei ATCC 7469 estuvo asociado al incremento en Ia concentraci6n de plasma como fuente de protefnas. Para suero de queso se ha reportado una concentraci6n de protefnas de.93 ±.3% de los s6lidos totales (Miranda eta/., 27); mientras que el jugo de naranja contiene.4% (Alonso eta/., 22), el jugo de cafia de azucar,.5-.19% (Gonzalez y Gonzalez, 24) y el agua de coco.1-.2% (Ovalles et a/., 22), dichas concentraciones de protefnas se relacionan con Ia concentraci6n de biomasa obtenida. Estos resultados muestran Ia necesidad de adicionar protefnas al sustrato de cultivo para mejorar el crecimiento de Lactobacillus casei Shirota en jugo de cafia de azucar y agua de coco. La Figura 2 muestra el crecimiento de Lactobacillus johnsonii. La mayor concentraci6n se obtuvo con el jugo de naranja (9.39 ±.18) a las seis horas de cultivo. Este resultado es importante debido a que los tiempos de recuperaci6n de biomasa probi6tica son cortos y su cultivo puede resultar ventajoso ya que al disminuir el tiempo de incubaci6n se reducen costos de funcionamiento del fermentador. En agua de coco y suero de queso Ia mayor concentraci6n se obtuvo a las tres horas de cultivo y aunque Ia concentraci6n fue menor que en el jugo de naranja, se logr6 obtener una concentraci6n mayor a 1 8 UFC ml 1. Sin embargo, para incrementar Ia concentraci6n de biomasa al utilizar estos sustratos se sugiere Ia evaluaci6n de sustancias que complementen el metabolismo de los lactobacilos para mejorar su crecimiento. Los microorganismos heter6trofos utilizan como fuente de carbona muchas moleculas organicas diferentes (Ingraham e Ingraham, 1998). El jugo de naranja proporcion6 a Lactobacillus johnsonii las concentraciones suficientes de protefnas y azucares para su crecimiento. En jugo de naranja se ha 1 :; E 8 ị2 ::>. c: 6 u "8 c: 4 24 Tlompo (h) +- Agua de Coco Jugo de Cafln._ Jug de Nnron il )(-- Sucro de Oucso Figura 2. Crecimiento de Lactobacillus johnsonii en sustratos naturales. reportado una concentraci6n de 8.46% de azucares totales, correspondiendo a fructosa 1.93%, glucosa 1.98% y sacarosa 4.6% (Villamiel et a/., 1998). Estos azucares constituyeron una buena fuente de carbona para el crecimiento de Lactobacillus johnsonii, ya que aunque el azucar principal del jugo de naranja fue Ia sacarosa, tambien Ia glucosa y fructosa se encontraron en una concentraci6n importante. A diferencia del jugo de cafia de azucar, donde Ia concentraci6n de azucares diferentes de Ia sacarosa es menor al 1% (Salgado et a/., 23). Probablemente, Ia alta concentraci6n de sacarosa en el jugo de cafia de azucar tambien influy6 en el escaso crecimiento de Lactobacillus johnsonii. Aunque se obtuvo buen crecimiento de ambos probi6ticos en fuentes naturales como el suero de queso y el jugo de naranja, los valores obtenidos se encuentran por debajo de los valores obtenidos con un medio de cultivo comercial, como MRS, lo que sugiere Ia adici6n de alguna fuente proteica para mejorar el crecimiento de este tipo de microorganismos con exigencia de nutrientes especiales para su cultivo. CONCLUSIONES La concentraci6n de azucaresse relacion6 directamente con Ia producci6n de biomasa probi6tica. El jugo de naranja present6 Ia mayor concentraci6n de azucares y Revsi ta Ciencias Agrfcolas I N F O R M A 53

el agua de coco, Ia menor. Los sustratos naturales que permitieron un buen crecimiento de biomasa probiotica a escala de laboratorio fueron el suero de queso y el jugo de naranja; en ambos sustratos se obtuvo una alta concentracion de Lactobacillus casei Shirota, mientras que para Lactobacillus johnsonii el mejor sustrato fue el jugo de naranja. En jugo de cana de azucar y el agua de coco se sugiere evaluar otras fuentes de carbono y nitrogeno para mejorar Ia produccion de biomasa. REFERENCIAS BIBLIOGAAFICAS Alonso, A., H. Reyes, R. Guarga y A Nieto. 22. Tabla de composicion de alimentos de Uruguay. Ministerio de Trabajo y Seguridad Social. lnstituto Nacional de Alimentos. Facultad de Quimica. Universidad de Ia Republica. Montevideo, Uruguay. 4 p. Barboza, Y., E. Marquez, B. Arias, J. Faria y. Castejon. 1994. Utilizacion de plasma sanguineo de bovino como fuente proteica en Ia formulacion de un medio de cultivo para lactobacilos. Rev. LUZ. 4: 55-59. Campeanu, G., A Vamanu,. Popa, I. F. Dumitru, E. Sasarman, T. Vassu, E. Vamanu, S. Campeanu, C. Campeanu and P Cornea. 22. Biotechnological studies concerning the obtaining of biomass with probiotic role from yeasts and bacteria. Roum. Biotechnol. Lett. 7: 795-82. Corona, A y R. Jimenez. 24. Comparacion de dos metodos de siembra para el recuento de microorganismos en muestras con alta concentracion microbiana. Rev. Facultad de lngenieria Quimica. 4:3-7. Esquivel-Solis, V y G. Gomez-Salas. 27. Implicaciones metabolicas del consumo excesivo de fructosa. Acta Medica Costarricense. 49: 198-22. Forero-Gomez, J. y L. Vera-Cala. 25. Efectividad del uso de un probiotico multiespecie en Ia prevencion de enterocolitis necrotizante en recien nacidos pretermino. Med UNAB. 8: 5-1. Gonzalez, D. y C. Gonzalez. 24. Jugo de cana y follajes arboreos en Ia alimentacion no convencional del cerdo. Rev. Computadorizada Prod. Porcina. 11: 25-38. Hartemink, R., R. Domenech V and M. Rombouts R. 1997. LAMVAB, a new selective medium for the isolation of lactobacilli from faeces. J. Microbiol. Meth. 29: 77-84. Her, S. L., J. Duan K., C. Sheu D. and T. Lin C. 24. A repeated batch process for cultivation of Bifidobacterium longum. J. Ind. Microbiol. & Biotech. 31: 427-432. Ingraham, J. y C. Ingraham. 1998. Introduccion a Ia microbiologia. Volumen I. Reverte. Zaragoza, Espana. 751 p. Man, J. C., M. Rogosa and E. Sharpe M. 199. A medium for the cultivation of lactobacilli. J. Appl. Bacteriol. 32: 13-135. Miranda,., P Fonseca, I. Ponce, C. Cedeno, L. Sam y L. Marti. 27. Elaboracion de una bebida fermentada a partir del suero de queso. Caracteristicas distintivas y control de calidad. Rev. Cubana Alimentos & Nut. 17: 13-18. Moreno, M., D. Belen, D. Garda y L. Mendoza. 26. Evaluacion del contenido de carotenoides totales en cascaras de algunas variedades de naranjas venezolanas. Rev. LUZ. 23: 31-39. Munoa, F. and R. Pares. 1988. Selective medium for isolation and enumeration of Bifidobacterium spp. App. & Environ. Microbiol. 54: 1715-1718. Ovalles, J., Leon L., Vielma R. y Medina A, 22. Determinacion del contenido de aminoacidos libres del agua de coco tierno por HPLC y revision electronica sobre Ia nueva tecnologia para el envasado del agua de coco. Rev. Fac. Farmacia. 44: 7-78. Rincon, A. 25. Evaluacion agronomica y nutricional de variedades de cana de azucar con potencial forrajero en el Piedemonte Llanero. Rev. Corpoica. 62: 6-67. Rosenblatt, J., and P Stewart. 1975. Anaerobig bag culture method. J. of Clinical Microbiol. 1: 527-55. 54 I N F O R M A

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