RECEPTORES PARA MENSAJEROS QUÍMICOS HIDROFÓBICOS RECEPTORES INTRACELULARES PARA MENSAJEROS QUÍMICOS HIDROFÓBICOS Habíamos visto cómo se biosintetizaban estos mensajeros químicos que entraban dentro de la célula, de tal manera que hoy vamos a ver la estructura, la biosíntesis y los tipos de receptores para estos mensajeros, y por último la unión de los ligandos con sus receptores, lo que va a hacer diferente el mecanismo de acción según el tipo de receptor. - Naturaleza química - Biosíntesis - Función - Tipos de receptores - Unión de los ligandos con sus receptores Estamos hablando de los receptores que se encuentran dentro de la célula, bien en el citoplasma o bien en el núcleo. En cualquier caso van a entrar al núcleo para actuar como activadores de la transcripción.
Algunos de los métodos con los que se estudian estos receptores son: - Preparaciones a partir de homogenados de células (pero hay que coger la fracción nuclear). - Análisis Hibridación de ácidos nucleicos: niveles de mrna del receptor Inmunoensayo: niveles de la proteína (receptores activos e inactivos) Métodos inmunohistoquímicos Estos receptores que se encuentran en el citoplasma y en el núcleo, cuando realmente están ejerciendo al función es el núcleo, por lo que lo que queremos ver si estos receptores están activados o no y el núcleo de la célula es lo que nos interesa estudiar y aislar, por lo cual hay que tomar la fracción nuclear de los homogenados de células. Los receptores se pueden analizar de muchas formas: - En la hibridación de ácidos nucleicos nos va a dar a conocer cuáles son las concentraciones de RNA mensajero que tiene una célula para la biosíntesis de estos receptores concretos. Por tanto, con esta técnica, medimos niveles de RNA mensajero. Pero todo este RNA mensajero medido no va a sintetizar estos receptores, es decir no hay una relación completamente directa. - Inmunoensayo: son análisis en los que se utilizan anticuerpos específicos contra la molécula del receptor y vamos a medir niveles de proteínas, es decir, vamos a medir qué cantidad de receptores están en esa célula. Sin embargo, todavía no podemos saber si los receptores se encuentran en forma activa o inactiva, es decir, si tienen unido su ligando (están activados y pueden producir la señal) o si no tiene ligando unido. - Métodos inmunohistoquímicos: se pueden determinar los puntos en los cuales se encuentran los receptores y para ello se necesitan los anticuerpos correspondientes. Como estos anticuerpos están marcados de alguna manera, se puede ver dónde se encuentran los receptores. Todas estas técnicas utilizadas en conjunto, porque una sola no nos proporciona todos los datos que queremos conocer, nos sirven para estudiar estos receptores. - Estructura química: proteínas - Proteínas de unión específica - Solubles: en el citosol y/o en el núcleo - Situadas en las células diana de las hormonas y mensajeros químicos - En el interior de la célula: citoplasma y/o núcleo según los tipos - Su unión al ligando y su activación es el primer paso en la acción del mensajero químico en su célula diana (importante) - Actúan como factores de transcripción activados por ligandos
En cuanto a su estructura química, son proteínas de unión específica, es decir, que son capaces de reconocer a otras moléculas (ligandos) y por tanto tienen una zona de unión a estas moléculas. Son solubles por lo que tienen más movilidad que otras proteínas de membrana. Según los tipos de receptores, se va a localizar en una zona u otra de la célula (citoplasma/núcleo). Mientras estos receptores no estén unidos a ligando están inactivos en la célula. BIOSÍNTESIS DE RECEPTORES INTRACELULARES - Mecanismo general de biosíntesis de proteínas - Variaciones en la biosíntesis que influyen en la función del receptor: - Receptores nucleares (GR y ER) - Forman complejos con proteínas de choque térmico Hsp 90 Hsp 70 Hsp 56/59 En las investigaciones, se han visto algunas variaciones en la biosíntesis de estas proteínas que van a hacer que tengan una función común. Se ha visto que ciertos receptores nucleares, como por ejemplo, los GR (receptores de glucocorticoides) y los ER (receptores de estrógenos), forman complejos con proteínas de choque térmico durante su biosíntesis. Este hecho les va a permitir colocarse en el lugar exacto de la célula donde tienen que estar y que sean funcionalmente activos. Las proteínas de choque térmico son las hsp 90, las hsp 70 y las hsp 56/59. Estos números se refieren al tamaño molecular que tiene cada proteína de choque térmico. PROTEÍNAS DE CHOQUE TÉRMICO a. Inducidas durante un choque térmico u otro tipo de estrés b. Involucradas en procesos de renaturalización de otras proteínas c. Su síntesis regulada por factor de transcripción de choque térmico (HSTF) de 110kD d. Se nombran según su tamaño molecular en kd Tenemos que saber que en general, todos los grupos de proteínas son inducidas por un choque térmico o por otro tipo de estrés de la célula, pero fundamentalmente por un choque térmico. Si se produce un aumento brusco de la temperatura, muchas de las proteínas de las células se desnaturalizan al subir la temperatura. Entonces, estas proteínas se biosintetizan en grandes cantidades y ayudan a otras proteínas a desnaturalizarse? Su síntesis está regulada por un factor de transcripción concreto que es el HSTF que tiene 110 kd. Hay un factor de transcripción que se activa y activa la biosíntesis de RNA y después la síntesis de proteínas cuando se produce esta elevación de la temperatura.
Vamos a ver los tres grupos de proteínas de choque térmico y las funciones generales más importantes y las funciones que tienen con respecto a los receptores intracelulares: Hsp 90 - Homodímero (2x90 kd) - Fosfoproteína - Une ATP - Se autofosforila (1-2%) - Abundante en condiciones sin estrés en citoplasma y núcleo - Se asocia con hsp 70 y hsp 56/59 - Funciones: Chaperona Se une microtúbulos Se une quinasas Inhibe tirosin-quinasas Une receptores nucleares: 1 dímero 1GR / 1PgR * PgR (receptor de progesterona) 1 dímero 2 ERs * ER (receptor de estrógenos) Se disocian de los receptores tras la unión de ligando La proteína de choque térmico hsp 90 se presenta en forma de homodímero (90 es el tamaño molecular del monómero). Dos monómeros se tienen que unir para que estas proteínas sean funcionales. Son fosfoproteínas y son capaces de unir ATP. Se atofosforilan en muy pequeñas proporciones y no se sabe muy bien cual es la función de esta autofosforilación. Llama la atención que aunque son proteínas de choque térmico y deben estar en grandes cantidades en situaciones de estrés, se encuentran también en abundantes cantidades en situaciones que no tiene estrés, tanto en el citoplasma como en el núcleo. Se asocia a los otros dos tipos de proteínas. Respecto a sus funciones, es capaz de unir tirosin-quinasas. Respecto a los receptores nucleares, es capaz de unir receptores nucleares GR, ER y PgR. Durante la biosíntesis, un dímero de hsp 90 se une a un receptor de GR o a un receptor de PgR y también a dos receptores de estrógenos (ER). También se sabe que se disocian de los receptores cuando se les une el ligando, pues estas hsp 90 se unen a los receptores en la biosíntesis y mantienen a estos receptores en estado latente. Hsp 70 - Monómero - ATPasa - Se autofosforila - Funciones Forma y disocia complejos de proteínas: Ribosomas
Clatrina Membrana retículoendoplásmico y mitocondrias DNA polimerasa Ayuda a insertar proteínas en membranas Une receptores nucleares (GR) Facilita la traslocación al núcleo Facilita la unión de hsp 90 Facilita la disociación de hsp 90 Las hsp 70 son monómeros, también tienen función ATPasa y también se autofosforilan. Las funciones de la hsp 70 parece que están más dirigidas a formar complejos con otras muchas proteínas y moléculas, por ejemplo, se une a los ribosomas, a la clatrina, a las membranas del retículo endoplásmico y de las mitocondrias y a la DNA polimerasa. También se une y ayuda a la inserción de otras proteínas en las membranas; se une a receptores nucleares del tipo de los glucocorticoides y una vez que se ha unido a ellos, facilita la traslocación de estos receptores al núcleo. Hsp 56 / 59 - Monómero - Peptidil-prolil-isomerasa - Funciones: Cataliza replegamiento de proteínas Une e inhibe fosfatasa regulada por calcio (calcineurina) Es diana de drogas inmunosupresoras (FK506) Une receptores nucleares GR y ER Facilita el cambio de conformación inducido por ligando (activación del receptor) Las hsp 56/59 es un monómero y tiene actividad peptidil-prolil-isomerasa Las funciones están más dirigidas a catalizar el replegamiento de las proteínas que se han desnaturalizado; unir e inhibir la fosfatasa regulada por calcio, por ejemplo la proteínas calcineurina); también es diana de drogas inmunosupresoras como la droga FK506, que es un inmunosupresor que se emplea para evitar el rechazo en los transplantes; se une a receptores nucleares; y facilita el cambio de conformación cuando al receptor se le une un ligando, de manera que facilita la activación del receptor. Los tres grupos de proteínas de choque térmico aparecen durante la biosíntesis de proteínas cuando se están biosintetizando estos receptores y se unen a ellos: - Bien durante la biosíntesis. - O bien están cerca y se unen en el momento de la activación del receptor.
ESTRUCTURA DE RECEPTORES INTRACELULARES La estructura de los receptores intracelulares es muy característica y se puede generalizar aunque siempre hay diferencias. Hay algo importante, y es que la estructura y la función van unidas y toda la molécula puede dividirse en distintos dominios con estructura y función correspondiente. En el esquema superior vemos que tenemos 3 grandes zonas de la molécula. Son cadenas polipeptídicas, monómero en este caso, con su extremo N-terminal y C- terminal. Entonces podemos ver que está dividido en: - Región A/B. La región que está más cercana al extremo N-terminal va a interaccionar con otros factores de transcripción, y lo que va a hacer es activar la transcripción. - Región C. La siguiente región va a tener la función de unirse al DNA. También tiene una función de dimerización. - Región D. En el esquema no está pero sería lo que se denomina una región bisagra y sirve para la localización nuclear del receptor, de manera que, dependiendo de cómo sea esta región, el receptor sabe en qué punto del núcleo tiene que colocarse. - Región E. La región que está más cercana al extremo C-terminal, es la que se va a unir a la hormona o al mensajero químico. Es la región de unión al ligando. Además, tiene la función de activación de la transcripción, de dimerización y de unión a las proteínas de choque térmico. - Región F. Existe solo en algunos casos. En muchos casos no se sabe cuál es su función.
Este esquema es un ejemplo de receptor de hormonas esteroideas, en este caso, un receptor de glucocorticoides (GR). En el extremo N-terminal está el dominio que va a activar la transcripción y en esta región nos vamos a encontrar que la secuencia de aminoácidos no está tan conservada de unas moléculas a otras (por eso pone variable (inmunogenic)). A continuación tenemos la región que se une al DNA, donde pone dedos de zinc, porque estas estructuras de las proteínas en forma de dedos de zinc son las que muchas proteínas utilizan para encajar en los surcos del DNA. A continuación está la región de localización nuclear. Después está la región en la cual se va a unir al ligando, en este caso una hormona esteroidea, donde también se unen las proteínas de choque térmico y una región pequeña que tiene como función la activación de la transcripción.
En este otro esquema tenemos tres grupos de receptores, donde vamos a encontrar las mismas regiones estructurales y funcionales: - Receptores de glucocorticoides (GR). Son las moléculas más grandes. Vemos: Región A/B: con una zona de activación de la transcripción (letra tau). Región C. Región D: con un dominio con la secuencia de localización nuclear (NLS). Región E: donde nos encontramos varios dominios de interés: - Zona de activación de la transcripción (letra tau). - Dominio de unión del ligando. - Dominios de unión de proteínas de choque térmico. - Receptores de estrógenos (ER). Tiene un tamaño más pequeño, y nos encontramos: Región A/B: con una zona de activación de la transcripción (TAF1). Región C. Región D: con un dominio con la secuencia de localización nuclear (NLS). Región E: donde nos encontramos varios dominios de interés: - Zona de activación de la transcripción (TAF2). - Dominio de unión del ligando. - Dominios de unión de proteínas de choque térmico. - Además tenemos un punto que va a ayudar a la dimerización. - Receptores de hormonas tiroideas (TR). Las hormonas tiroideas son de tamaño pequeño y no son hidrofóbicas. Los receptores de hormonas tiroideas también son de menor tamaño.
Como hemos visto en este esquema, tenemos estudios estructurales bastante detallados para poder conocer en estas proteínas qué función tiene prácticamente cada uno de sus aminoácidos. Además, estos receptores tienen puntos de fosforilación ( importantes para la activación de ) que van a ser En cuanto a las dos regiones de unión en las cuales funcionan como proteínas de unión específicas, tenemos: - El dominio de unión al DNA, con la estructura de dedos de zinc que es capaz de encajarse en los surcos mayores del DNA y de esta forma unirse a él. - El dominio de unión al ligando, donde la estructura de la molécula va a reconocer el ligando y la molécula va a modificar su estructura cuando esté el ligando unido, dejando como un hueco donde se aloja el ligando. ESTRUCTURA DEL DOMINIO C DE UNIÓN AL DNA (DNA BINDING DOMAIN) Este dominio C también se llama dominio DBD (DNA binding domain) y vamos a ver cómo es su estructura. En el esquema siguiente, está representada una molécula con su secuencia de aminoácidos (extremo N-terminal a extremo C-terminal). Sólo está representado un dedo de zinc (tenemos los aminoácidos que forman el dedo de zinc y el átomo de Zn 2+ que está coordinado). Detrás tenemos otra molécula que está puesta para indicar que se produce dimerización; se trata de otra molécula de otro receptor que se va a dimerizar con el que tenemos aquí delante.
Hay unas zonas del receptor en que predomina la caja D (Dbox): en el esquema vemos representada la segunda subunidad y los aminoácidos con los que hacen uniones débiles para su dimerización. También existe la caja P, que tiene una serie de aminoácidos que son capaces de reconocer determinadas secuencias de DNA y unirse a ellos específicamente. Es la forma que tienen de saber de alguna forma dónde tienen que unirse al DNA. Lo que reconoce en el DNA es el HRE (elemento de respuesta hormonal), que es una secuencia de pares de bases del DNA que son diferentes según el tipo de gen que va a ser activado. Entonces, la secuencia de respuesta hormonal tiene que ser reconocida por la caja P del receptor y unirse por uniones débiles del tipo de puentes de hidrógeno. * GRE: elemento de respuesta a glucocorticoides
Este esquema es más o menos lo mismo: Tenemos un dedo de zinc que está cerca del extremo N-terminal, una secuencia intermedia y el dedo de zinc del extremo C-terminal. Tenemos representadas la caja D, cuyos aminoácidos son capaces de hacer la dimerización, y la caja P, cuyos aminoácidos son capaces de reconocer el elemento de respuesta hormonal. En la parte de debajo de la diapositiva es un detalle más de la estructura, en la cual podemos ver la correspondencia entre la secuencia de aminoácidos de la caja P y la secuencia del DNA, pero concretamente lo que denominan una secuencia consenso en el DNA se llama half site. Este quiere decir que dependiendo del tipo de receptor (receptor de estrógenos, receptor de glucocorticoides, receptor de mineralocorticoides, etc.) existe en la caja P una serie de aminoácidos que están fijos y otros que están variables (lo que es el concepto de una secuencia consenso), y se tienen que corresponder con esas secuencias del DNA concretas (half site). Son secuencias consenso que se van a repetir en el DNA. Dependiendo de la estructura de la secuencia consenso, se van a poder reconocer los receptores con el DNA. Half site es la mitad de lo que es el completo del elemento de respuesta hormonal.
Esta diapositiva es un ejemplo en el cual tenemos el elemento de respuesta hormonal a glucocorticoides y el receptor GR con sus dos monómeros (porque cuando el receptor se une al DNA lo hace dimerizado). Tenemos la secuencia consenso donde hay entre medias un número de nucleótidos (3) que puede variar pudiendo ser cualquier nucleótido. Lo que tenemos es una secuencia en la que hay simetría (es un palíndromo) y en general estaría formando el HRE. Este es otro ejemplo del elemento de respuesta a estrógenos y del elemento de respuesta a glucocorticoides. Vemos como estas secuencias tienen un eje de simetría y entre medias hay unos nucleótidos cualesquiera.
ESTRUCTURA DEL DOMINIO D DE LOCALIZACIÓN NUCLEAR * (+) Significa aminoácido con carga positiva. ** X significa aminoácido cualquiera. Del dominio D de localización nuclear también se ha estudiado su estructura y también tiene una secuencia consenso: son dos aminoácidos con carga positiva, a continuación 10 aminoácidos cualesquiera, y por último una serie que obien son 3 o 4 aminoácidos con carga positiva o bien 1 o 2 aminoácidos cualesquiera. Esta secuencia consenso es muy variable pero sabemos que en la estructura tiene que haber algunos aminoácidos con cargas positivas en determinadas posiciones, pero la variación es muy grande dependiendo de los tipos de receptores. ESTRUCTURA DEL DOMINIO E DE UNIÓN A LIGANDO La estructura del domino E de unión a ligando también se ha estudiado y se ha visto que además, tiene funciones de activación de la transcripción, dimerización y unión a proteínas de choque térmico. Lo que está en esta diapositiva es un experimento en el cual se han estudiado dónde se encuentran los aminoácidos clave para la función de esta parte del receptor, de manera que se ha visto que el receptor de hormonas tiroideas (de triyodotironina) y el receptor de andrógenos se pueden comparar. Los autores dicen que hay una serie de aminoácidos unidos en grupo que si se cambian por una mutación el receptor va a perder su función y por tanto se considera clave para que esta parte de los receptores pueda llevar a cabo su función. Curiosamente están unidos en grupo.
Esto es según la estructura bidimensional de la proteína, de qué forma se están colocando en el espacio para poder reconocer a su ligando correspondiente. Tiene la característica de estar unido en dos grupos fundamentalmente. Vemos como cuando se va a unir un ligando a su receptor hay un cambio de conformación del receptor, de manera que cuando está el hueco vacío, la estructura de la molécula es más extendida, y en el momento en el que se le une un ligando, hay una parte de la molécula que en este caso es una hélice alfa cercana al extremo C-terminal, cambia de posición y engloba al ligando. De tal manera, que en esta región LBD de unión a ligando, se produce ese cambio conformacional como vemos en la siguiente diapositiva. En este caso, están identificadas las hélices alfa de un receptor nuclear que están numeradas, concretamente es el receptor RXR que tiene que ver con los receptores de hormonas tiroideas. La posición de la hélice alfa 12 (H12) se ve como se dobla contra la estructura del resto de la molécula englobando al ligando una vez que se le une.
CLASIFICACIÓN DE LOS RECEPTORES INTRACELULARES SUPERFAMILIA SUBFAMILIA SUBTIPOS (de receptores) Son todos los receptores nucleares conocidos (ella dijo todos los receptores intercelulares conocidos) Familia de los receptores esteroideos Familia de los receptores no esteroideos Productos de genes distintos dentro de una misma subfamilia: RARα, RARβ, RARγ. ISORRECEPTORES Son productos de un mismo gen producidos por corte y empalme O ISOFORMAS alternativo. RARα1 y RARα2. (de receptores) La subfamilia es lo mismo que tipo de receptor, p. ej.: receptor del ácido retinoico (RAR). Un subtipo sería por ejemplo el receptor de ácido retinoico α. Una vez que se ha producido este subtipo, podemos tener isorreceptores: RARα1 y RARα2. Nos da una serie de moléculas ligeramente distintas.
Subtipos de receptores Dentro de los subtipos de receptores tenemos: - Receptor de estrógenos alfa (herα). - Receptor de estrógenos beta (herβ). Podemos ver que las moléculas de ambos receptores son un poco diferentes. En la parte inferior de la diapositiva están representados los puntos comunes en los cuales tienen una determinada función como coactivador de la unión, correpresor de la unión, unión del DNA, la dimerización, la localización nuclear o la activación de la transcripción. Isorreceptores de los receptores tiroideos Los receptores tiroideos alfa serían un subtipo y los beta otro subtipo. Aquí se comparan cómo son de diferentes estas moléculas. Vemos que alfa1 y alfa2 se han producido por corte y empalme.