Prueba de Tetrazolio como Método de Vigor para semillas de Glycine max. Propuesta de Validación del Método para ISTA.

PARA MEJORAR LA PRODUCCION 54 - INTA EEA OLIVEROS 2016 CE Prueba de Tetrazolio como Método de Vigor para semillas de Glycine max. Propuesta de Validación del Método para ISTA. Gallo, C. 1 ; França-Neto, J.B 2 ; Arango, M. 1 ; Gonzalez, S. 3 ; Francomano, V. 4 ; Carracedo, C. 5 ; Costa, O. 6 ; Alves, R. 7 ; Magnano, L. 1 ; Craviotto, R. 1 1 INTA Estación Experimental Agropecuaria Oliveros, Oliveros, Argentina. 2 EMBRAPA Soja, Londrina, Brasil. 3 INIA, Instituto Nacional de Investigación Agropecuaria, Uruguay. 4 Francomano & Picardi SRL, Laboratorio de Semillas, Buenos Aires, Argentina. 5 LEA, Laboratorio de Especialidades Agronómicas, Colón, Argentina. 6 Sementes Adriana, Rondonopolis, Brasil. 7 COCARI Seed, Mandaguari, Brasil Resumen Palabras clave: tetrazolio, vigor, soja, ISTA. El objetivo de este estudio fue demostrar que la Prueba de Tetrazolio es un Método de Vigor para Glycine max, repetible dentro de los laboratorios y reproducible entre ellos. Se analizaron tres lotes de semillas de Glycine max, con una germinación de 80% (lote 1: 92%; lote 2: 89% y lote 3: 80%), empleando la Prueba de Tetrazolio. En la validación participaron 6 laboratorios. Las semillas fueron clasificadas en cuatro categorías: vigor alto, vigor medio, vigor bajo y otras tinciones (semillas viables no vigorosas + semillas no viables). La suma de la proporción de las categorías de semillas de vigor alto, medio y bajo se expresó como Vigor-TZ (%). Los valores de Vigor-TZ (%) se encontraron dentro de los niveles de tolerancia establecidos por ISTA. El dato de Vigor-TZ fue analizado separadamente, usando el cálculo del valor z-scores, valores h y valores k. El cálculo de los valores z-scores reveló que los datos de Vigor-TZ no excedieron el valor 2, por lo tanto los resultados son considerados satisfactorios. Los valores h mostraron que cinco laboratorios no sobreestimaron ni subestimaron los resultados de todos los lotes de semillas. Los valores k mostraron la variabilidad entre las repeticiones de cada uno de los lotes dentro de cada laboratorio. Las repeticiones estuvieron en tolerancia para todos los lotes y todos los laboratorios. La prueba fue repetible dentro de los laboratorios y reproducible en diferentes laboratorios. Concluimos que el dato para Vigor-TZ (%) muestra una variación aceptable y, por lo tanto, la Prueba de Tetrazolio puede ser aplicada como un método de vigor para soja. Introducción El diagnóstico estimado de vitalidad de una semilla, evaluado con la técnica de Tetrazolio, fue denominada por Lakon como vitalidad de la semilla y, por lo tanto, fue asimilada para el término poder germinativo (ISTA, Working Sheets, 2003). Este término se refiere al hecho de que las semillas podrían ser evaluadas con una tinción de tetrazolio para verificar su potencial para producir nuevas plántulas. La Prueba de Tetrazolio también provee una rápida evaluación del vigor de semillas viables (Moore,1985), y fue rápidamente aceptada en Estados Unidos, América del Sur y Europa, donde se aplicó para numerosas especies comerciales. Muchas investigaciones fueron realizadas para explicar el fenómeno de cuán vivas están las semillas vivas. Esto condujo al uso del análisis de la viabilidad no sólo para encontrar una correspondencia con el poder de germinación de un lote de semillas, sino también a la creación de una herramienta capaz de clarificar aspectos esenciales relacionados al vigor de las simientes. Por lo tanto, la Prueba de Tetrazolio como un método de vigor fue descripto para cereales en general por Lakon (1950) y presentado para semillas de trigo por Perry (1987). Además, esta técnica ha sido usada en maíz (Dias and Barros, 1995), algodón (Santos et al., 1992; Vieira & Von Pinho, 1999), maní (Gelmond, 1962; Moore, 1972; Bittencourt, 1995), soja (França-Neto et al., 1988; Craviotto et al., 1995; Costa et al., 1998; Craviotto et al., 2009), arveja, pino y trébol (AOSA, 1983). La confiabilidad y la precisión de la prueba de tetrazolio fueron reveladas por el trabajo de 41 laboratorios, que analizaron varias muestras de semillas de soja mediante 105

CE PARA MEJORAR LA PRODUCCION 54 - INTA EEA OLIVEROS 2016 las pruebas de germinación estándar, envejecimiento acelerado y tetrazolio, y emergencia en arena (França-Neto et al., 1986). La prueba de tetrazolio fue determinada como la segunda prueba más precisa con respecto a la repetibilidad, después de la prueba de germinación estándar. Subsecuentemente, França-Neto et al. (2001, 2002) realizó un referee test involucrando 27 laboratorios de semillas. Ellos concluyeron que la prueba de Tetrazolio fue tan precisa como la prueba de germinación estándar para determinar la viabilidad, y fue más precisa que la prueba de envejecimiento acelerado para determinar el vigor. En 2004, França-Neto et al., concluyeron, sobre una base de 1117 lotes de semillas de soja evaluados entre 1997 y 2002 en Brasil, que el valor de vigor determinado por la prueba de tetrazolio puede ser confiablemente usado para estimar la emergencia potencial de plántulas en condiciones de campo (EPP) cuando la prueba es realizada tres o cuatro semanas antes de la siembra. Se desarrolló una ecuación para predecir la emergencia potencial a campo sobre la base del vigor de las semillas analizadas, usando la prueba de Tetrazolio (EPP = 0.6165 * Vigor TZ + 35.716). Cuando esta ecuación fue analizada para 100 lotes de semillas en 2002, el coeficiente de regresión de 0.79 fue altamente significativo (P< 0.001). Esta ecuación está siendo actualmente evaluada por compañías de semillas de soja en Brasil. (Seed Vigour Testing Handbook, AOSA 2009) La Prueba de Tetrazolio está basada en la actividad de ciertas enzimas llamadas deshidrogenasas, las cuáles participan en las reacciones de respiración que se producen en la mitocondria de las células vivas. Estas enzimas están presentes en los tejidos vivos de las semillas, y reducen la solución incolora de cloruro de 2,3,5- trifenil tetrazolio en un color rojo/rosa genéricamente llamado formazan. Cuando las semillas están sumergidas en una solución de tetrazolio, las células vivas de los tejidos sufren una reacción química de óxido reducción donde están presentes las enzimas participantes (Glenner, 1990). La tinción de las semillas de soja muestra la actividad respiratoria de los diferentes tejidos. Como consecuencia de la condición de vitalidad de las estructuras seminales, aparecen diferentes colores e intensidades, reflejando las diferencias en la actividad respiratoria de cada estructura. Por lo tanto, de acuerdo a su condición fisiológica, se produce una imagen topográfica de la semilla sobre sus superficies externas e internas (Moore, 1985; França-Neto et al., 1998; Craviotto et al., 2008). El objetivo de este estudio fue demostrar que la Prueba de Tetrazolio es un método de vigor para Glycine max, repetible dentro de laboratorios y reproducible entre ellos. Materiales y métodos Se emplearon muestras de tres lotes de semillas de Glycine max no OGM, las cuales fueron provistas por la Estación Experimental Agropecuaria Paraná del Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA) de Argentina. Todos los lotes de semillas tuvieron una germinación estándar superior o igual al 80% (lote 1: 92%; lote 2: 89% y lote 3: 80%). Las muestras de los lotes de semillas se codificaron y fueron enviadas desde Oliveros (Santa Fe, Argentina) a los laboratorios participantes: Laboratorio de Semillas Francomano y Picardi, Argentina; Laboratorio de Semillas LEA, Argentina; EMBRAPA Soja, Brasil; Semillas Adriana, Brasil; Semillas COCARI, Brasil; Instituto Nacional de Investigación Agropecuaria, Uruguay e Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria, Argentina. Los laboratorios participantes de Argentina, Brasil y Uruguay están acreditados por las Reglas MERCOSUR. Además, los laboratorios de Argentina y Uruguay están acreditados por el Instituto Nacional de Semillas de ambos países. Los Institutos Nacionales de Semillas de Argentina y Uruguay están acreditados por la Asociación Internacional de Análisis de Semillas (ISTA por sus siglas en inglés). Los laboratorios privados participantes fueron seleccionados por su prestigio, su gran entrenamiento, responsabilidad y experiencia en la Prueba de Tetrazolio, especialmente en semillas de soja. Los tres lotes de semillas seleccionados, identificados por los números expresados en la Tabla 1, fueron enviados a todos los laboratorios participantes por el Laboratorio de Semillas del Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria de Argentina, en Diciembre de 2013. Los resultados fueron recibidos en Febrero de 2014. Cada laboratorio recibió los tres lotes codificados con un número de lote de semillas con el correspondiente protocolo, sin ninguna mención sobre los valores de germinación ni sobre el nombre de los demás participantes. Las muestras de los tres lotes de semillas se enviaron en sobres cerrados, los cuáles fueron almacenados en contenedores a prueba de humedad (bolsas de polietileno) a baja temperatura (10ºC) antes de comenzar el análisis de las semillas. Método de la Prueba Preparación de la solución de tetrazolio: La sal de cloruro de 2,3,5 trifenil tetrazolio se disolvió en una solución buffer, de acuerdo a lo establecido por la Reglas ISTA (ISTA, 2014). Pretratamiento: La Prueba de Tetrazolio se condujo sobre dos repeticiones de 100 semillas, para cada uno de los lotes de simientes. Las semillas se acondicionaron toda la noche durante 16-18 horas entre rollos de papel 106

PARA MEJORAR LA PRODUCCION 54 - INTA EEA OLIVEROS 2016 CE de filtro húmedos a 20ºC ± 2ºC, y se colocaron dentro de bolsas plásticas selladas para evitar la evaporación. Luego, en el caso que haya sido necesario, las semillas se sumergieron en agua durante 30 a 60 minutos a 20ºC ± 2ºC para completar la imbibición adicional. Al final del período de imbibición pueden presentarse semillas duras, a las cuáles se les debe realizar una incisión en el área cotiledonar opuesta al embrión. Luego, las semillas duras se sumergieron durante la noche (16-18 horas) entre rollos de papel de filtro a 20ºC ± 2ºC. Tinción: Las semillas embebidas intactas se colocaron en una solución de cloruro de 2,3,5 trifenil tetrazolio al 0.1%, durante 3 horas a 35ºC ± 2ºC y en oscuridad. Preparación para la evaluación: Antes de la evaluación, se eliminó la solución de tetrazolio y las semillas se enjuagaron con agua. Las semillas permanecieron sumergidas en agua durante la evaluación para evitar la deshidratación y la decoloración. El tegumento de la semilla se removió manualmente (Figuras 1 y 2) y luego el embrión se expuso para cortarlo cuidadosamente a través de la mitad de los cotiledones y del eje radícula-hipocótilo con una hoja de afeitar (Figuras 3 y 4). Evaluación: Las semillas teñidas se observaron interna y externamente. Las semillas con tegumento fuertemente adherido al eje embrionario y cotiledones se relacionaron directamente con tejidos sanos y vigorosos, los cuáles siempre aparecen turgentes y rosados, tanto externa como internamente (Figura 5). En este tipo de semillas, la solución de tetrazolio penetró superficialmente, e internamente este tipo de semillas mostró una coloración blanco brillante rodeada por un área de color rosa (Figura 6). f3 Figura 3. Corteatravés delamitad de los cotiledones ydel eje embrionario usando una hoja de afeitar f1 Figura 1. Remoción del tegumento de una semilla de soja f4 Figura 4. Detalle del área interna de una semilla. Cortelongitudinal del eje embrionario ydel cotiledón f2 Figura 2. Tegumento de la semilla totalmente removido 107

CE PARA MEJORAR LA PRODUCCION 54 - INTA EEA OLIVEROS 2016 f5 Figura 5. Vista externa. Semilla vigorosa de color rosa (Categoría A) f7 Figura 7. Vista externa. Semilla con tejido deteriorado color rojo (a) y tejido muerto de color blanco mate (b) b a f6 Figura 6. Vista interna. Semilla vigorosa de color blanco brillante rodeado de un área rosa (Categoría A) f8 Figura 8. Vista externa. Semilla con tejido deteriorado color rojo (a) yverde (b) y tejidos muertos de color blanco mate (c) c b a 108

PARA MEJORAR LA PRODUCCION 54 - INTA EEA OLIVEROS 2016 CE Los tejidos deteriorados siempre aparecieron de color rojo y los tejidos muertos de color blanco mate (Figura 7). Los tejidos que presentaron coloraciones amarillentas, y/o grisáceas y/o violáceas y verdes fueron considerados como tejidos muertos (Figura 8). Las semillas se clasificaron en diferentes categorías de acuerdo al color, a la turgencia del tejido y la localización (extensión y profundidad) de las áreas dañadas sobre la semilla (Figura 9). Vigor Alto (Categoría A): Semilla completamente turgente y teñida de color rosa (Figuras 5 y 6). Vigor Medio (Categoría B): Presencia de áreas menores de color rojo, sin tinción, con tejidos necróticos o flácidos con una extensión limitada y de poca profundidad en cualquier lugar de la semilla (incluyendo eje embrionario y área de unión del eje embrionario y los cotiledones) (Figuras 9 y 10). Vigor Bajo (Categoría C): Presencia de mayores o múltiples áreas de color rojo, sin tinción, tejidos flácidos o necróticos con una extensión desde 1/3 hasta 3/3 del área cotiledonar del extremo distal del cotiledón(es), y una profundidad de 1/2 del cotiledón hasta un cotiledón entero (Figuras 9 y 11). Otras Tinciones: Esta categoría incluye a las Semillas Viables-No Vigorosas (Figura 12 A-E): Radícula que presenta hasta 1/3 de tejidos deteriorados, sin tinción o perdidos (A); área de unión del eje embrionario y cotiledones con tejidos deteriorados rojos (B); cotiledones que presentan hasta 1/2 de tejidos deteriorados, sin tinción o perdidos (C); cotiledones que presentan hasta 1/4 de tejidos deteriorados o sin tinción en profundidad (D); cotiledones que presentan hasta 3/4 de tejidos deteriorados, sin tinción o perdidos (E). Semillas No Viables: Radícula con más de 1/3 de tejidos deteriorados, sin tinción o perdidos (F); área de unión del eje embrionario y cotiledones sin tinción (G); plúmula deteriorada o perdida (H); cotiledones con más de 1/2 de tejidos deteriorados, sin tinción o perdidos (I); cotiledones con más de 1/4 de tejidos deteriorados o sin tinción en profundidad (J); cotiledón con más de 3/4 de tejidos deteriorados, sin tinción o perdidos (K); semilla entera sin tinción (L). El Apéndice 1 muestra un ejemplo de la tabla empleada para registrar los resultados. En este registro, el vigor de un lote de semillas es expresado como Vigor-TZ (%), el cuál es la suma de las semillas en las tres categorías de vigor: A (vigor alto) + B (vigor medio) + C (vigor bajo), expresado como porcentaje. La proporción de semillas en cada categoría puede ser usada para evaluaciones complementarias del vigor de semillas. Sin embargo, este registro focalizará solamente sobre la evaluación sobre el total (Vigor-TZ (%). f9 Figura 9. Ubicación de áreas dañadas sobre la semilla 109

CE PARA MEJORAR LA PRODUCCION 54 - INTA EEA OLIVEROS 2016 f10 Figura 10. Semillas devigor Medio (Categoría B): áreas menores de color rojo, sin tinción, tejidos flácidos onecróticos limitadas en extensión y superficiales en profundidad. Simbología de áreas afectadas: f10 Figura 10. Semillas debajo Vigor (Categoría C): áreas mayores omúltiples de color rojo, sin tinción, tejidos flácidos onecróticos con una extensión de 1/3 del área cotiledonar (A) hasta 3/3 del área cotiledonar en el extremo distal del cotiledón(es) (B); y una profundidad de ½del cotiledón hasta un cotiledón entero. Simbología de áreas afectadas: Análisis estadístico Los resultados de Vigor-TZ (%) por la Prueba de Tetrazolio se analizaron separadamente, usando el cálculo de los z-scores y la herramienta estadística desarrollada por S. Grégoire de acuerdo a ISO 5725-2 para calcular los valores h y los valores k. La herramienta estadística está disponible en el sitio web de ISTA: http://www.seedtest.org/upload/cms/user/ ISO572511.zip El rango de tolerancia (Apéndice 1) se usó para comparar el Vigor-TZ (%) para dos repeticiones de 100 semillas analizadas para cada lote de simientes. El análisis estadístico de los resultados de la prueba se realizó mediante un Modelo Lineal. Además, se emplearon tolerancias para comparar los resultados entre los laboratorios participantes: tanto dentro de los laboratorios como entre laboratorios. Los participantes no brindaron información sobre sus experiencias con respecto a las muestras de semillas de Glycine max analizadas. Reporte de los resultados El Vigor del lote de semillas se resume como Vigor-TZ (%) y el mismo es la suma de las semillas dentro de las categorías de vigor: A (Vigor Alto) + B (Vigor Medio) + C (Vigor Bajo), expresado en porcentaje. Los resultados de este método se reportaron como un único valor denominado: Vigor-TZ (%). Resultados Todos los laboratorios enviaron los resultados del análisis en tiempo y forma. En esta validación no se incluyeron en el análisis datos de la muestra ni de los laboratorios participantes. 110

PARA MEJORAR LA PRODUCCION 54 - INTA EEA OLIVEROS 2016 CE f12 Figura 12. Otras Tinciones. Semillas Viables -No Vigorosas: Radícula que presenta hasta 1/3 de tejidos deteriorados, sin tinción operdidos (A); área de unión del eje embrionario ycotiledones con tejidos deteriorados rojos (B); cotiledones que presentan hasta 1/2 de tejidos deteriorados, sin tinción operdidos (C); cotiledones que presentan hasta 1/4 de tejidos deteriorados osin tinción en profundidad (D); cotiledones que presentan hasta 3/4 de tejidos deteriorados, sin tinción operdidos (E). Semillas No Viables: Radícula con más de 1/3 detejidos deteriorados, sin tinción operdidos (F); área de unión del eje embrionario ycotiledones sin tinción (G); plúmula deteriorada operdida (H); cotiledones con más de 1/2 detejidos deteriorados, sin tinción operdidos (I); cotiledones con más de 1/4 detejidos deteriorados osin tinción en profundidad (J); cotiledón con más de 3/4 detejidos deteriorados, sin tinción operdidos (K); semilla entera sin tinción (L). Simbología de áreas afectadas: t1 Tabla 1. Comparación de medias, desvíos estándar (DS) y valores z-score de valores de Vigor-TZ para tres lotes de semillas analizados por seis laboratorios empleando la Prueba de Tetrazolio Lote 1 Lote 2 Lote 3 LAB A 61,5 71,5 26,5 LAB B 58,5 65,5 43,5 LAB C 63,5 61,5 27 LAB D 61,5 57,5 36,5 LAB E 74 67 31 LAB F 66 66 37 Media 64,167 64,833 33,583 Desvío est. 5,419 4,813 6,614 z-score Lote 1 Lote 2 Lote 3 LAB A -0,492 1,385-1,071 LAB B -1,046 0,139 1,499 LAB C -0,123-0,693-0,995 LAB D -0,492-1,524 0,441 LAB E 1,815 0,450-0,391 LAB F 0,338 0,242 0,517 t2 Tabla 2. :Valores de Vigor-TZ (%) para resultados de repetibilidad yreproducibilidad en la Prueba de Tetrazolio Lote Repetibilidad Reproducibilidad Lote 1 4,082 6,140 Lote 2 1,000 4,865 Lote 3 0,957 6,648 El cálculo de los valores z-scores (Tabla 1) reveló que todos los datos para el Vigor-TZ (%) no excedieron el valor 2, por lo tanto todos los resultados se consideraron satisfactorios. La repetibilidad y la reproducibilidad se analizaron con la herramienta estadística desarrollada por S. Grégoire, basada en ISO 5725-2; esto permitió el cálculo de los valores h y k. Los valores h muestran la tendencia de un laboratorio para sobreestimar o subestimar resultados, comparada con la media general de todos los resultados disponibles para cada lote. Por otro lado, los valores k brindan una medida de la variabilidad de las repeticiones. Valores altos indican mayores sub o sobreestimaciones (valores h) o mayor variabilidad entre repeticiones (valores k). La Figura 13 indica que el laboratorio E sobreestimó los resultados del lote 1 si consideramos el valor h crítico al 5% de nivel de significancia, mientras que si consideramos el valor h crítico al 1% de nivel de significancia, este 111

CE PARA MEJORAR LA PRODUCCION 54 - INTA EEA OLIVEROS 2016 f13 Figura 13. Valores devigor-tz (%): valores h para tres lotes de semillas deglycine max analizadas, empleando la Prueba de Tetrazolio en seis laboratorios f14 Figura 14. Valores devigor-tz (%): valores k para tres lotes de semillas deglycine max analizadas, empleando la Prueba de Tetrazolio en seis laboratorios laboratorio no sobreestimó los resultados del mismo lote. Los laboratorios restantes no sobreestimaron ni subestimaron los resultados en ninguno de los lotes de semillas. La Figura 14 muestra la variabilidad entre las repeticiones para cada lote. Los resultados obtenidos para el lote 1 y lote 2 en el laboratorio A fueron significativamente mayores que la variabilidad para los mismos lotes en los otros laboratorios. Aún así, las repeticiones estuvieron en tolerancia para todos los lotes y todos los laboratorios (Proceedings of the ISTA Tetrazolium Workshop, Edinburgh, 1997). La Tabla 2 muestra la repetibilidad y la reproducibilidad de los valores obtenidos de los tres lotes de semillas para todos los laboratorios. Estos valores están dentro de un rango similar a métodos de vigor previamente validados (deterioro controlado, emergencia de radícula, conductividad para Phaseolus vulgaris y Glycine max). 112

PARA MEJORAR LA PRODUCCION 54 - INTA EEA OLIVEROS 2016 CE t3 Tabla 3.Rangos detolerancia Average Number of Viable Seeds in the Sample Number of Seeds Analyzed 2x100 A B Tolerance 99 2 3 98 3 4 97 4 5 96 5 5 95 6 6 94 7 7 93 8 7 92 9 7 91 10 8 90 11 8 89 12 9 88 13 9 87 14 9 86 15 9 85 16 10 84 17 10 83 18 10 82 19 10 81 20 11 80 21 11 79 22 11 78 23 11 77 24 11 76 25 12 75 26 12 74 27 12 73 28 12 72 29 12 71 30 12 70 31 12 69 32 13 68 33 13 67 34 13 66 35 13 65 36 13 64 37 13 63 38 13 62 39 13 61 40 13 60 41 13 59 42 13 58 43 13 57 44 13 56 45 13 55 46 13 54 47 14 53 48 14 52 49 14 51 50 14 Discusión La prueba reveló claramente que el lote 3 tenía un nivel de vigor más bajo, expresado como Vigor-TZ (%), que los lotes 1 y 2 los cuáles tenían valores similares de vigor. Un trabajo previo mostró que tales diferencias se relacionan estrechamente a la capacidad de las semillas para emerger en el campo (França-Neto et al 2004). Así, el Vigor-TZ (%) predice una de las expresiones de vigor en un lote de semillas: la capacidad de emergencia a campo. El Vigor-TZ (%) expresa el nivel de vigor entre las semillas vigorosas, semillas no vigorosas y semillas no viables son excluidas. Sin embargo, la separación de los lotes de simientes con similar Vigor-TZ (%) puede ser realizada al uso interno para la determinación de la proporción de semillas dentro de cada categoría (A, B, C). Sin embargo, como la separación de las semillas dentro de estas categorías puede estar sujeta a la experiencia del analista, estas categorías no son reportadas. La prueba fue repetible dentro de los laboratorios y reproducible en los diferentes laboratorios. Además, las repeticiones dentro de los laboratorios y los valores medios obtenidos para cada lote en diferentes laboratorios estuvieron dentro de tolerancia, empleando las tablas de tolerancias del Proceedings of the ISTA Tetrazolium Workshop, Edinburgh, 1997. Esto aporta evidencia en apoyo a la incorporación de la Prueba de Tetrazolio en las Reglas ISTA como un método de Vigor para Glycine max. Agradecimientos Agradecemos al Ing. Agr. M.Sc. Diego Santos, de la Estación Experimental Agropecuaria Paraná del INTA, quien nos proveyó los lotes de semillas para el estudio. 113

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