Electroforesis de proteínas
Introducción general La electroforesis es un método de separación basado en la tasa diferencial de migración de especies cargadas al estar en un campo eléctrico de DC La electroforesis es un método de separación basado La tasa de migración Depende de la carga y del tamaño La separación se basa en explotar las diferencias en las proporciones carga-tamaño Una serie de métodos muy eficientes y que dan altas resoluciones Una serie de métodos muy eficientes y que dan altas
Principios y teoría de la electroforesis Requerimientos básicos Un medio conductor (buffer acuoso, electrolito, buffer de corrida) Poder aplicar un campo eléctrrico Especies cargadas positivamente, que se moverán hacia el cátodo Especies cargadas negativamente, que se moverán hacia el ánodo
Principios y teoría de la electroforesis Requerimientos básicos Un medio conductor (buffer acuoso, electrolito, buffer de corrida) Poder aplicar un campo eléctrrico Especies cargadas positivamente, que se moverán hacia el cátodo Especies cargadas negativamente, que se moverán hacia el ánodo
Dos técnicas básicas 1. Las moléculas están en solución libre: capilares de calibre pequeño 2. Están en una matriz no conductora (agarosa, gel de poliacrilamida PAGE ) El calentamiento por corriente es mínimo El efecto de criba (coladera) del gel permite separar especies que tengan la misma proporción de carag contra tamaño, si tienen diferentes tamaños
La eficiencia de esta técnica depende de La mobilidad electroforética μ ep El flujo electroosmótico del bulto de la solución (EOF) El calentamiento debido a la resistencia (o Calentamiento Joule )
La movilidad electroforética F ef =q E (La fuerza electroforética, donde q=carga E=campo eléctrico ) F fr =6 π η r ν ep (la fuerza de la fricción) η=viscosidad r=radio ν ep : velocidad de migración electroforética ν ep = F ef =F fr q E μ 6 π η r ν ep = ν ep ep E = q 6 π η r =const q r μ ep : mobilidad electroforética
La velocidad del movimiento está definida por la ecuación: v= Eq ƒ Dónde E es la fuerza del campo eléctrico, q es la carga neta de la molécula, f es el coeficiente friccional: Por lo tanto f depende de la viscosidad Del buffer, que depende de la porosidad de la matriz, y del tamaño de la molécula ƒ=6πηυ Radio de la molécula (tamaño) Coeficiente de viscosidad
La velocidad del movimiento está definida por la ecuación: v= Eq ƒ Dónde E es la fuerza del campo eléctrico, q es la carga neta de la molécula, f es el coeficiente friccional: Por lo tanto f depende de la viscosidad Del buffer, que depende de la porosidad de la matriz, y del tamaño de la molécula ƒ=6πηυ Radio de la molécula (tamaño) Coeficiente de viscosidad
El calentamiento por resistencia (u óhmico o de Joule ) La ley de Ohm relaciona el voltaje V, con la corriente I y la resistencia R: I = V R Podríamos pensar que incrementar la corriente aumentando el voltaje daría más mobilidad y que hacer experimentos a mayor volatje es mejor Pero la potencia que se genera es W =I 2 R Al aumentar la potencia puede aumentar la producción de calor, lo que conlleva Convección (y eso provoca una mala separación de las proteínas), una disminución en la viscosidad del medio (y por lo tanto, mayor corriente y aún más calor)
El flujo electroosmótico (EOF) Su efecto es más importante en electroforesis de capilar El EOF se refiere a la migración del bulto del líquido hacia el cátodo Orígen: se forma una doble capa
Electroforesis en gel La matriz es un hidrogel que no sea eléctricamente conductivo y que contenga buffer Ventajas: Desventajas Agarosa (aplicaciones con aa. Nucléicos) Poliacrilamida El gel poroso actúa como criba... y limita la difusión de las moléculas de muestra Se suprime el EOF Se suprime el calentamiento resistivo Lento, talachudo y difícilmente automatizable
Técnicas: Electroforesis en gel Electroforesis en gel nativo: los analitos se separan de acuerdo a diferencias en movilidad aparente En la electroforesis en gel de poliacrilamida y diodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE) la separación es por tamaño Isoelectroenfoque (IEF) Electroforesis en geles bidimensionales (2D-GE)
Agarosa Los medios para preparar geles Gel de poliacrilamida Copolimerización de la acrilamida y la N,N'- metilen-bisacrilamida Iniciadores de la reacción: TEMED (tetrametiletilendiamina) y Persulfato de amonio
Los medios para preparar geles Animación gel desnaturalizante: http://lifesciences.envmed.rochester.edu/media.html Gel de poliacrilamida http://www.youtube.com/watch?v=8io0pn5xgqi Copolimerización de la acrilamida y la N,N'- metilen-bisacrilamida Iniciadores de la reacción: TEMED (tetrametiletilendiamina) y Persulfato de amonio Hay un efecto de criba: el tamaño del poro depende de la [gel] (5 a 20%) Se adiciona SDS para desnaturalizar y cubrir a las proteínas de una carga uniformemente negativa...y mercaptoetanol para reducir los puentes disulfuro
Los medios para preparar geles Gel de poliacrilamida Gel de poliacrilamida Hay un efecto de criba: el tamaño del poro depende de la [gel] (5 a 20%) Se adiciona SDS para desnaturalizar y cubrir a las proteínas de una carga uniformemente negativa...y mercaptoetanol para reducir los puentes disulfuro
Los medios para preparar geles El efecto del ion cloro y el ion glicina: permiten que las proteínas se amontonen en la parte inferior del gel de empacamiento y todas empiecen a entrar en el gel separador prácticamente al mismo tiempo
Preparación de la muestra de proteína
Preparación de las soluciones del gel empacador y el gel separador
Vertido de las soluciones de geles en el molde
Cargando las muestras