MINISTERIO DE SALUD INSTITUTO NACIONAL DE SALUD CENTRO DE INFORMACIÓN Y DOCUMENTACIÓN CIENTÍFICA

MINISTERIO DE SALUD INSTITUTO NACIONAL DE SALUD CENTRO DE INFORMACIÓN Y DOCUMENTACIÓN CIENTÍFICA LINEA BASE DE RESISTENCIA A INSECTICIDAS EN LA PULGA CTENOCEPHALIDES FELIS DE AYABACA : PIURA Y EL PIOJO DEL CUERPO PEDICULUS HUMANUS DE QUISPICANCHIS : CUSCO SERIE INFORMES TÉCNICOS Nº64 PABLO VILLASECA LUZMILA CHEVARRIA LEONARDO MENDOZA ARTURO ALVARADO 2006

Linea base de resistencia a insecticidas en la pulga Ctenocephalides felis de Ayabaca : Piura y el piojo del cuerpo Pediculus humanus de Quispicanchis : Cusco. Pablo Villaseca 1, Luzmila Chevarria 2, Leonardo Mendoza 1, Arturo Alvarado 3. 1. Laboratorio de Entomología. Instituto Nacional de Salud. 2. Laboratorio Referencial Regional de la DISA Cusco. 3. Laboratorio de Entomología CICE de la Subregión de Salud Luciano Castillo Colonna. ABSTRACT Palabras claves: Resistencia a insecticidas, pulga, Ctenocephalides felis, piojo del cuerpo, Pediculus humanus. RESUMEN Objetivo.- Determinar la línea base de resistencia a insecticidas en la pulga Ctenocephalides felis de Ayabaca: Piura y el piojo del cuerpo Pediculus humanus de Quispicanchis: Cusco. Método.- Impregnamos papeles con insecticida grado técnico fabricados por Chem Service, usando la metodología OMS enseñada por la Dra. D. de Molina. En Piura, Ctenocephalides felis de Sapillica, fueron expuestos frente a la deltametrina, el propoxur y el carbaryl, siguiendo el procedimiento WHO/VBC/81.815, modificado según Chavasse 1997 8 (WHO/CTD/WHOPES/97.2). Se probaron también tiempos de espera después de la recolección de pulgas y tiempo de exposición. En Cusco, Pediculus humanus de Cusipata, fueron expuestos frente a carbaryl, deltametrina y lambdacyalotrina, siguiendo el procedimiento WHO/VBC/81.808, modificado según Picollo.1998 6. Resultados: En Piura, al exponer la pulga Ctenocephalides felis de la localidad de Sapillica (distrito de Sapillica), frente al Carbaryl al 10 % se obtuvo el 87.5 % de mortalidad, frente al Propoxur al 5% se obtuvo el 96.3 % de mortalidad y frente a la Deltametrina al 0.25 % logra el 100 % de mortalidad. Se observa mortalidad elevada entre los grupos testigos de pulgas, mortalidad que tiene relación directa con el tiempo de espera después de la recolección.

En Cusco, al exponer Pediculus humanus, de la localidad de Cusipata, frente a la lambdacyalotrina al 0.25 % se obtuvo el 100 % de mortalidad, frente a la deltametrina al 0.25% se obtuvo el 100 % de mortalidad, con deltametrina al 0.125 % se obtuvo el 95.3% de mortalidad, con carbaryl al 0.8% se obtuvo el 0 y 13.2% de mortalidad. Con 97 piojos del cuerpo como controles. Información que necesita comprobarse. Conclusión: Para Ctenocephalides felis de Sapillica, la DL 100 de carbaryl puede encontrarse a mas del 10 %; la DL 100 de propoxur puede encontrarse a mas del 1 % y la dosis diagnóstica de deltametrina es 0.5%. Para Pediculus humanus de Cusipata, la dosis diagnóstica de deltametrina es 0.5%, la dosis diagnóstica de lambdacyahalotrina es 0.5%, mientras carbaril al 8 % solo logro un 13.2 % de mortalidad, resistencia que debe ser confirmada. Discusión: Se hace hincapié en que los bioensayos deben realizarse con humedad. (45-70%). Proponemos investigar sobre pruebas rápidas y directas, que acorten o eliminen el tiempo de espera, luego de la recolección de los vectores. Proponemos que para Ctenocephalides felis se realicen bioensayos con 6 horas de exposición e inmediatamente se emita un resultado, con la mortalidad alcanzada hasta ese momento. Se sugiere probar las dosis diagnosticas encontradas, en otras localidades cercanas, donde se necesite realizar un control vectorial. INTRODUCCION Las rickettsiosis son zoonosis transmitidas a mamíferos por artrópodos vectores, como pulgas, piojos, garrapatas y se transmite al hombre en forma casual, el tifus exantemático es una de ellas y tiene como vector al piojo del cuerpo Pediculus humanus, en el Perú, han ocurrido brotes de esta enfermedad en Cusco, Arequipa, Ayacucho y Apurímac 1. Los casos confirmados de Cusco (Prov: Quispicanchis y Paucartambo) representan el 50 % de los casos reportados a nivel mundial, ocurrieron 70 casos en 1998, 122 casos en 1999, 14 casos en el 2000. En este mismo documento la autora menciona dos posibles causas de las incidencias en nuestro país, las cuales son : (1) la falta de control vectorial y (2) la resistencia a los insecticidas 1.

Por otro lado se tiene evidencias de que la bacteria Rickettsia felis se encuentra circulando en la localidad de Sapillica (distrito de Sapillica, provincia Ayabaca, departamento de Piura), en la pulga Ctenocephalides felis y en Mus musculus 2. En cuanto a la información que se tiene sobre la resistencia a insecticidas a nivel de Sudamérica, se ha reportado a la OMS hasta 1992 que el piojo Pediculus humanus es resistente al DDT en Perú y Sudamérica, la pulga Pulex irritans es resistente al DDT en Perú, Ecuador y Brasil y Xenopsylla cheopis es resistente al DDT en Brasil y Ecuador. Con respecto a información nacional, solo en la DISA Piura II se han reportado resultados de algunos bioensayos con Ctenocephalides felis de Ayabaca, utilizando la dósis diagnóstica de carbaryl al 5 % 3. Brindamos al país información de los efectos de 2 moléculas de carbamatos (carbaryl y propoxur) y 2 moléculas de piretroides (deltametrina y lambdacyalotrina), sobre 2 insectos de importancia en Salud Pública. Este estudio es un punto de partida para el monitoreo de la resistencia a piojos y pulgas en las zonas estudiadas, actividad que puede ser replicada en la red nacional de laboratorios de Salud Pública y brindará información para delinear estrategias de un control eficaz de las ricketsiosis. MATERIAL Y METODO Antecedentes. Hasta 1981 sólo se tiene la referencia para pulgas en relación a la dosis diagnóstica para propoxur la cual es al 0.1 % 4. De la información proporcionada por la OMS en 1992 5 realizamos la tabla N 1. Tabla N 1. Insecto Insecticida Dosis (%) Tiempo de exposición Xenopsylla cheopis DDT (OC) 1 24 Fenitrotion (OP) 1 2.5 Propoxur ( C ) 0.1 5 Pediculus humanus DDT (OC) 4 24 Fenitrotion (OP) 1 5 Malation (OP) 5 24

Preparación de papeles impregnados. Se realizó en el laboratorio de entomología, del INS, usando la metodología de la Dra. Darjaniva de Molina, los papeles controles solo contenían acetona y aceite pero no insecticidas, los insecticidas carbamatos (grado técnico) se disolvieron en acetona y se mezclaron con aceite de oliva, mientras que los piretroides se disolvieron en acetona y se mezclaron con aceite siliconado Corning 550. Los insecticidas grado técnico fueron manufacturados por Chem Service, la Lambdacyalotrina con certificado 91465-08-6, correspondía al lote 285-7B, de 99% de pureza, como mixtura de isómeros, con fecha de expiración Mayo del 2006. La deltametrina con certificado 52918-63-5, correspondía al lote 270-146B, de 99% de pureza, con fecha de expiración octubre del 2004. El carbaryl con certificado 63-25-2, correspondía al lote 285-77E, de 99% de pureza, con fecha de expiración junio del 2005. Preparación de soluciones madre : Se prepararon volúmenes de 10 ml o menores usando la formula: X = Dosis requerida (%) x 100 Pureza (%) Se preparaba una solución madre (mayor) y luego se preparaban dosis menores usando la siguiente formula: Volumen a añadir a 1 ml de solución madre = % de solución madre 1 % de solución requerida Impregnación : Para impregnar el papel Whatman N 1 se utilizó 0.65 ml de solución de insecticida por cada 180 cm 2 (la tasa de absorción del papel es de 3,600 ug/cm 2. Los papeles eran colgados para que se sequen y se guardaban en papel platina y a 4 Celsius. Para exponer las pulgas se prepararon papeles impregnados con 4 dosis diferentes, ver tabla N 2. Tabla N 2. Insecticida Dosis en microgramos por centímetro cuadrado (%) Carbaryl 18.06 (0.5%) 36.11 (1%) 180.56 (5%) 361.11(10%) Propoxur 3.61 (0.1%) 18.06 (0.5%) 36.11 (1%) 180.56 (5%) Deltametrina 0.90 (0.025%) 4.51 (0.125%) 9.03 (0.25%) 45.14 (1.25%)

Para exponer los piojos se prepararon papeles impregnados con 4 dosis diferentes, ver tabla N 3. Tabla N 3. Insecticida Dosis en microgramos por centímetro cuadrado (%) Carbaryl 28.89(0.8%) 144.44(4%) 288.88(8%) 577.76 (16%) Lambdacyalotrina 0.90 (0.025%) 4.51 (0.125%) 9.03 (0.25%) 45.14 (1.25%) Deltametrina 0.90 (0.025%) 4.51 (0.125%) 9.03 (0.25%) 45.14 (1.25%) Consideraciones previas al bioensayo de susceptibilidad de piojos.- Para determinar la línea base a los insecticidas se trabajó con la cepa de piojos del cuerpo de Cusipata, recolectados sobre las ropas de sus pobladores, luego se trasladaron al laboratorio. Determinación de la susceptibilidad. de los piojos del cuerpo a los insecticidas 4. (Según WHO/VBC/81.808 y Picollo.1998 6. Se expusieron los piojos adultos de ambos sexos, que no presentaban síntomas de inanición, frente a cuatro concentraciones, donde una, por lo menos, debería provocar una mortalidad de 100%. La mínima concentración que produjo una mortalidad de 100% se tomó como base y se consideró como dosis diagnóstica el doble de ella. Se confinaron 10 especímenes entre adultos y ninfas III, sobre el papel impregnado con insecticida de 7 cm de diámetro, sobre placas petri de 9 cm de diámetro, Se colocó humedad sobre un pequeño papel del filtro adicional y el tiempo de exposición fue de 1 hora. (Ver foto N 1) Al final del período de exposición, los insectos tratados se colocaron en un envase de teknopor sobre un circulo de papel whatman N 1 no tratado. Se colocó humedad sobre un pequeño papel del filtro adicional. (Ver foto N 2) El bioensayo se realizó entre 16 y 18 y con 60 a 70 % de humedad, en oscuridad. Se anotaron los piojos muertos y los piojos vivos a las 24 horas de haberse iniciado la exposición. Se consideraron piojos muertos cuando eran incapaces de caminar sobre el papel. Cuando la mortalidad en el control fue menor al 5% no se hizo corrección pero si oscilaba entre 5 y 20 % se corrigió, usando la fórmula del Abbott.

Consideraciones previas al bioensayo de susceptibilidad de pulgas.- Para determinar la línea base a los insecticidas, se trabajó con la cepa Ctenocephalides felis, de Sapillica, recolectada sobre perros (Ver foto N 3), exponiéndolas a 4 concentraciones en diferentes bioensayos, se probó el uso del aspirador de pulgas, la humedad durante la exposición y tiempo de espera, el tiempo de espera antes de realizar la prueba y la forma del papel impregnado. Determinación de la susceptibilidad de pulgas a insecticidas (Según WHO/VBC/81.815 7 y CTD/WHOPES/IC/96.1 8 ) Una muestra representativa de la población de pulgas adultas de cualquier sexo, alimentadas o no, se expusieron a 4 concentraciones de cada insecticida a un tiempo standard y a 25º C. Se colocaron 10 pulgas por cada tubo y se insertaba luego un papel impregnado con insecticidas (6 x 1.5 cm), luego se cerraba el tubo con dique de goma. (Ver foto N 4 y 5) Y se tapaban con tela negra En el tubo control se colocaban 10 pulgas y se insertaba un papel impregnado solo con aceite de (6 x 1.5 cm). Se consideraban pulgas muertas a las incapaces de permanecer paradas en los papeles. Para bioensayos con organofosforados o carbamatos, las pulgas son transferidas a tubos de espera, con papeles blancos sin insecticidas (6 x 1.5 cm) y la lectura se hace a las 24 horas. Cuando la mortalidad de los tubos controles esté comprendida entre el 5% y el 20%, convendrá corregir los porcentajes de mortalidad mediante la fórmula de Abbot: X = Mortalidad % expuestos mortalidad % testigos x 100 100 mortalidad % testigos Tamaño de la muestra biológica.- El tamaño de la población tanto de pulgas como de piojos no se conoce y se asumirá que es infinita y según el programa Epi - info Versión 6.0, para 271 especimenes el nivel de confianza es de 90 y con 381 especimenes el nivel de confianza es de 95 %. Ubicación geográfica.- son 2 las localidades estudiadas (Ver mapa) : (1) En Cusco, los piojos del cuerpo Pediculus humanus fueron recolectados en la localidad de Cusipata (13 54 47.8 L.S, 71 29 32.8 L.W) a 3207 m.s.n.m. (2) En Piura, las pulgas Ctenocephalides felis fueron recolectadas en la localidad de Sapillica del distrito de Sapillica ( 4 46 21.8 L.S, 79 58 55.5 L.W) a 1450 m.s.n.m.

RESULTADOS En Piura: Se recolectaron manualmente, 1638 especímenes de Ctenocephalides felis (95.4 %), 72 especímenes de Pulex irritans (4.2 %) y 7 especímenes de Ctenocephalides canis. (0.4 %), en lo que respecta a la proporción de sexo para Ctenocephalides felis fue de 2.55 hembras para 1 macho. En las tablas 4 y 5, se muestran los 3 últimos bioensayos con 513 especimenes de Ctenocephalides felis Tabla N 4. N Ensayo Primer Segundo Tercer Después de recolección (hrs) 22 9 2 % mortalidad antes de expuestos 64.7 24.6 1.9 Tiempo de exposición (hrs) 4.5 5 6 Tabla N 5. N Ensayo Primer Segundo Tercer Insecticida Dosis % N exp. % mort N exp. % mort N exp. % mort Total Carbaryl 0.5 10 13.1 - - 22 54.5 1 6 38.5 25 4 26 80.8 5 11 53.7 19 6 31 77.4 10 9 22.6 18 2 24 87.5 201 Propoxur 0.1 7 42.8 - - - - 0.5 8 27.2 - - - - 1 10 80 24 87.5 21 90.5 5 6 83.3 23 87 27 96.6 126 Deltametrina 0.025 7 57.1 - - 23 91.3 0.125 11 45.5 17 52.9 27 92.6 0.25 10 80 17 82.4 24 100 1.25 8 75 19 89.5 23 100 Total 103 162 248 513 Testigo 6h 31-37 10.5 56 0 124 Testigo 24h - 58.1-43.2-51.8

Con Carbaryl (n=201 especimenes) se logra el 87.5 % de mortalidad, al 10 %. Con Propoxur (n=126 especimenes) se logra el 96.3 % de mortalidad al 5 %, reproducir la prueba. Con Deltametrina se logra el 100 % de mortalidad ya al 0.25 %. Por lo que se sugiere que la dosis diagnóstica sea 0.5 %. En Cusco: Se recolectaron con pinzas 492 especimenes de la cepa Cusipata de Pediculus humanus del cuerpo, de los cuales se expusieron 190 especímenes, y 48 especímenes como controles, dio el siguiente resultado: Insecticidas Dosis % N exp. % mort. corregida N exp. % mort. corregida Total Carbaryl 0.8 9 0 10 0 0 (n=77) 4 10 11.1 10 0 0 8 8 30.6 10 0 13.2 16 9 1.2 11 0 0 Lambdacyalotrina 0.025 9 25.9 12 21.5 25.6 (n=53) 0.125 9 100 7 16 65.2 0.25 10 100 - - 100 1.25 6 100 - - 100 Deltametrina 0.025 8 86.1 10 17.6 50.4 (n=60) 0.125 13 100 11 89.3 95.3 0.25 10 100 - - 100 1.25 8 100 - - 100 Testigo 48 10.4 Total 109 81 190 Observamos que con la lambdacyalotrina al 0.25 % se logra un 100 % de mortalidad, (n=52), con la deltametrina al 0.25 % se logra un 100 % de mortalidad, (n=60), con el carbaryl al 8% se logra la mayor mortalidad (n=77). Información que necesita comprobarse.

CONCLUSION. En Piura: Con respecto a la cepa Sapillica de Ctenocephalides felis, la DL 100 de carbaryl puede encontrarse a mas del 10 %; la DL 100 de propoxur puede encontrarse a mas del 1 % y la dosis diagnóstica de deltametrina es 0.5%. En Cusco: Con respecto a la cepa Cusipata de Pediculus humanus, la dosis diagnóstica de deltametrina es 0.5%, la dosis diagnóstica de lambdacyahalotrina es 0.5%, mientras carbaryl al 8 % solo logro un 13.2 % de mortalidad, por lo que es necesario se confirme la resistencia a este insecticida. DISCUSION Se hace hincapié en que los bioensayos deben realizarse con humedad. (45-70%). Proponemos investigar sobre pruebas rápidas y directas, que acorten o eliminen el tiempo de espera, luego de la recolección de los vectores. Proponemos que para Ctenocephalides felis se realicen bioensayos con 6 horas de exposición e inmediatamente se emita un resultado, con la mortalidad alcanzada hasta ese momento. Se sugiere probar las dosis diagnosticas encontradas, en otras localidades cercanas, donde se necesite realizar un control vectorial. Sugerimos que no se deban utilizar los aspiradores de pulgas cuando se va a utilizar el material en las pruebas de susceptibilidad. Se adiciona en el manejo de pulgas el uso de jebe dental para tapar los tubos que contienen las pulgas, ya que no le ofrece una superficie a las pulgas para adherirse. AGRADECIMIENTOS Del INS a la Blga. Rosario Balta y las técnicas Sras. Rosa Mosqueda C. y Norma García A. De la DESA Cuzco al Blgo. Henry Yañez y en la Sub Región Sullana al Sr. Chofer Jiménez, a los técnicos del CICE Miguel Angel Ortiz Guerrero y Indira Ana Solinka Vargas-Machuca Ruiz y a los trabajadores del Centro de Sapillica José Carhuapoma Rivera y Frank Castillo Cueva.

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS 1. Moron C. Tifus exantemático: Enfermedad reemergente en el Perú. Rev Med Exp 1999, XV (1-2):51-54. 2. Blair PJ, Moron C, Schoeler GB, Cespedes M, Anaya E, Mendoza L, Villaseca P, Luckett R, Cruz C, Felices V, Sumner J, Richards AL and Olson. JG. Elucidation of the etiologic agents responsible for an outbreak of undifferenentiated febrile illnesses in Sapillica, Peru. Congreso de Medic Trop (ASTMH) Diciembre 2002,USA 3. CICE. Evaluación de susceptibilidad y/o resistencia en pulgas en las localidades de Querecotillo, Suyo y Paimas. Estudio de la susceptibilidad/ resistencia de siphonapteros de área endémica de peste de zona de frontera 2001. 4. OMS Instructions for determining the susceptibility or resistance of body lice and head lice to insecticides.1981. WHO/VBC/81.808. 5 páginas. 5 OMS Resistencia de los vectores de enfermedades a los plaguicidas. 15 Informe del Comité de Expertos de la OMS en Biología de los Vectores y lucha Antivectorial. Informe técnico 818, 1992, 63 paginas. 6. Picollo MI, Vassena CV, Casadio AA, Massimo J y Zerba EN. Laboratory studies of susceptibility and resístanse to insecticide in Pediculus capitis (1998). J. Med. Entomol 1998, 35 (5): 814-817. 7. OMS Instructions for determining the susceptibility or resistance of fleas to insecticides. WHO/VBC/81.815. 7 páginas. 8. OMS Evaluation and testing of insecticides.1996. pag. 45. CTD/WHOPES/IC/96.1

UBICACION DE LAS LOCALIDADES DONDE SE DESARROLLO EL ESTUDIO Ctenocephalides felis Provincia: Ayabaca. Localidad: Sapillica (1450 m) ( 4 46 21.8 L.S, 79 58 55.5 L.W) PIURA PERU Pediculus humanus Provincia: Quispicanchis Localidad de Cusipata (3207m) (13 54 47.8 L.S, 71 29 32.8 L.W) CUSCO

Foto N 1 Muestra la forma de exponer los piojos. Colocar cerco y humedad. Foto N 2 Luego de la exposición se pasan los piojos a los depósitos de espera, se lee la mortalidad a las 24 horas, después de la exposición.

Foto N 3 Colecta de pulgas en un perro pequeño. Foto N 4 Bioensayo de Ctenocephalides felis frente a 4 dosis de carbaryl, al lado izquierdo las dosis menores. 4 Foto N 5 Bioensayo de Ctenocephalides felis frente a 4 dosis de deltametrina, al lado izquierdo las dosis mayores.