Gaceta de Ciencias Veterinarias Vol 15 N 2 pp 49-57 20 Recibido el 07 de junio de 2011 - Publicado el 21 de octubre de 2011 Hallazgos Clinicos y Hematologicos en Caninos Inmunoestimulados Sometidos a Condiciones de Campo en una Zona Endemica de Ehrlichiosis Monocitica Canina del Estado Lara, Venezuela Hematological and clinical finding on immunostimulated dogs submitted to field conditions at a Canine Monocytic Ehrlichiosis endemic area on Lara State, Venezuela 1 Mujica R*, 2 Pérez M 1 Hospital Veterinario "Dr. Humberto Ramírez Daza", Decanato de Ciencias Veterinarias de la Universidad Centroccidental "Lisandro Alvarado". Teléfono- Fax: 58-251-2592417. Dirección electrónica: rmujicag@yahoo.com 2 Laboratorio de Biotecnología del Decanato de Ciencias Veterinarias de la Universidad Centroccidental "Lisandro Alvarado" RESUMEN En el presente trabajo se reportan los hallazgos clínicos y hematológicos en caninos tratados con un inmunoestimulante basado en células inactivadas de Propionibacterium granulosum y Lipopolisacáridos de Escherichia coli (Pg-LPS) en un área endémica de Ehrlichiosis monocítica canina (EMC). Se evaluaron diez caninos en el grupo control (GC) y diez caninos en el grupo experimental (GE). Se les realizó la detección de E. canis mediante la técnica de PCR específica, al inicio y al final del estudio, así como un examen clínico completo y una determinación de parámetros hematológicos semanales. Se observó que 5 (50%) caninos del GE y 6 (60%) del GC ingresaron al estudio infectados por E. canis. Luego de nueve semanas de exposición, el número de infectados del GE permaneció constante mientras que elgc aumentó. El GE desarrolló linfoadenomegalia como consecuencia de la infección, la cual fue descendiendo de 80 a 30 %, además el 90% presentó fiebre no recurrente y se observó trombocitopenia leve (100.000-170.000 x mm3) por 4 semanas. Por su parte, el GC aumentó la linfoadenomegalia de 20 a 80% y un 80% desarrollaron fiebre recurrente, además de trombocitopenia severa a las 2 semanas (< 100.000 x mm3) y leve en la cuarta semana. Estos hallazgos muestran que los caninos inmunoestimulados con Pg-LPS presentaron una evolución positiva a la infección al no aumentar el número de infectados y presentar mejoría en el cuadro clínico y hematológico, y evitar en algunos casos la infección con E. canis o eliminar el microorganismo de la sangre en aquellos que resultaron positivos a la prueba de PCR específica al inicio del estudio y de mejorar el pronóstico de la EMC. PALABRAS CLAVES: Ehrlichiosis, inmunoestimulante, hallazgos, evolución ABSTRACT In this paper we report the clinical and hematological findings in dogs treated with an immunostimulatory cell based inactivated Propionibacterium granulosum and Escherichia coli lipopolysaccharide (Pg-LPS) in an endemic area of canine monocytic ehrlichiosis (CME). Ten dogs were evaluated in the control group (CG) and ten dogs in the experimental group (EG). Was performed to detect E. canis by specific PCR technique at the beginning and end of the study and a thorough clinical examination and determination of weekly hematological parameters. It was found that 5 (50%) dogs of GE and 6 (60%) entered the study GC infected E. canis. After nine weeks of exposure, the number of cases of GE remained constant while the GC increased. The lymphoadenomegaly GE developed as a result of infection, which was descending from 80 to 30%, and 90% showed no fever was observed recurrent mild thrombocytopenia (100,000 to 170,000 x mm3) for 4 weeks. In turn, the increased GC lymphoadenomegaly of 20 to 80% and 80% developed recurrent fever, severe thrombocytopenia addition at 2 weeks (<100,000 x mm3) and fourth weeks mild. These findings show that the canines immunostimulated with Pg-LPS showed a positive development to infection by not increasing the number of infected and have an improvement in clinical and hematological, suggesting stimulated the immune system of the canines of GE, to avoid in some cases the infection with E. canis or eliminating the organism from the blood of those who tested positive for specific PCR test at baseline and improve the prognosis of the EMC. KEYWORDS: Ehrlichiosis, immunostimulant, findings, trends. 49
Mujica R, Pérez M INTRODUCCIÓN La Ehrlichiosis y la Anaplasmosis canina son enfermedades de carácter febril, infecciosas y no contagiosas, producidas por bacterias Gram negativas, intracelulares obligadas, pleomórficas, de 0,2 a 2 m de diámetro [1, 2, 3], pertenecientes a los géneros Ehrlichia (Ehrlichia canis y Ehrlichia ewingii) y Anaplasma (Anaplasma platys), de la familia Anaplasmataceae [4, 2]. Estas bacterias infectan a leucocitos mononucleares (E. canis), polimorfonucleares (E. ewingii), así como a plaquetas (A. platys) de caninos silvestres y domésticos de cualquier raza y edad. Otros miembros de la familia Anaplasmataceae que infectan diversas especies animales y al hombre también han sido reportados en los caninos Neorickettsia helminthoeca, Neorickettsia risticii, A. phagocytophila, E. chaffeensis [2,4]. Para los géneros Ehrlichia y Anaplasma, la garrapata es el vector primario de la enfermedad. Se ha demostrado que la garrapata marrón del perro, Rhipicephalus sanguineus, es el agente transmisor para E. canis. Recientemente se han reportado garrapatas del género Amblyomma y Dermacentor interviniendo en la transmisión de la misma [2,4,5]. Para E. ewingii y A. platys existen reportes que señalan a la A. americanum y R. sanguineus como sus posibles vectores [6, 7]. La Ehrlichiosis Monocítica Canina (EMC) es una enfermedad causada por la E. canis, descrita por primera vez en Argelia en 1935 (8), actualmente distribuida alrededor del mundo, principalmente en áreas tropicales y subtropicales [9]. La EMC presenta con un espectro clínico variado que va desde una forma aguda, seguida de una fase subclínica generalmente asintomática hasta una fase crónica a veces mortal. La fase aguda se caracteriza por presentar cuadros de depresión, letargia, fiebre, linfadenomegalia, leve pérdida de peso, secreción ocular o nasal mucopurulenta, vómito, diarrea, anorexia y tendencias hemorrágicas. Adicionalmente, los pacientes pueden presentar uveítis, petequias retinales, polimiositis, poliartritis, y alteraciones del sistema nervioso central. Los principales hallazgos de laboratorio que se observan son anemia no regenerativa, trombocitopenia y leucopenia, reportándose usualmente en la bioquímica sanguínea una hiperglobulinemia (gammapatía monoclonal o policlonal), hipoalbuminemia y una baja en la relación albúmina : globulina [3, 10]. Este espectro clínico puede depender de la raza, estatus inmunológico, grado de estrés del paciente, la cepa implicada, la coinfección con otras bacterias o parásitos y de reinfecciones constantes [11]. La respuesta humoral producida por la infección natural o experimental con E. canis no es protectora y por el contrario, existen evidencias de que ésta puede estar envuelta en la patogenia de la enfermedad, como lo sugiere la demostración de anticuerpos antiplaquetarios en perros infectados experimentalmente con E. canis. Se ha reportado la existencia de un estado de premunición o inmunidad protectora en perros infectados subclínicamente con E. canis y en perros infectados experimentalmente después de un tratamiento de corta duración con oxitetraciclina. Esta protección puede ser producida por la respuesta inmune celular más que por la respuesta humoral [12, 13]. Hallazgos similares se reportaron en nuestra región en un estudio realizado en una unidad militar dedicada al entrenamiento canino, ubicada en zona endémica de la Ehrlichiosis monocítica canina, en Barquisimeto, Estado Lara, en el cual se encontró que algunos ejemplares infectados experimentalmente con E. canis se recuperaban espontáneamente de la enfermedad y que otros ejemplares que se recuperaron mediante tratamiento farmacológico o en forma espontánea, no se reinfectaron, aun cuando fueron reinoculados con sangre proveniente de un ejemplar en fase aguda de la enfermedad [14]. Observaciones personales del autor señalan que algunos caninos alojados por varios años en esta misma unidad militar, han permanecido sin infectarse con E. canis ni algún otro microorganismo de la familia Anaplasmataceae. Estos hallazgos sugieren el desarrollo de algún tipo de resistencia o inmunidad protectora. Existen métodos para estimular el sistema inmune inespecífico de los individuos, los cuales se emplean para tratar infecciones causadas por bacterias intracelulares obligadas o facultativas, virus, hongos, parásitos metazoarios y tumores para las que no existen vacunas o formas específicas de quimioterapia. Los microorganismos y extractos de sus componentes son de empleo común como inmunoestimulantes inespecíficos. Un medicamento de uso comercial con indicaciones como inmunoestimulante está constituído por la bacteria Propionibacterium granulosum y el Lipopolisacárido extraído de Bacterias Gram negativas (LPS). El primero es una bacteria Gram positiva cuyos componentes aplicados en forma de bacterina, estimulan directamente la actividad funcional de linfocitos y macrófagos [15, 16]. El LPS consiste en un oligosacárido unido a un lípido que forma parte de la 50
Hallazgos de Ehrlichiosis en Caninos Inmunoestimulados membrana celular [17]. La interacción entre el LPS y un receptor de las células del sistema fagocítico mononuclear produce activación de los macrófagos, lo que a su vez estimula la proliferación y diferenciación de linfocitos T y B [18,19]. El objetivo del presente estudio fue detectar la infección por E. canis mediante la técnica de PCR, los hallazgos clínicos y hematológicos de EMC en caninos susceptibles tratados con un inmunoestimulante inespecífico basado en células inactivadas de Propionibacterium granulosum y lipopolisacárido (LPS) de Escherichia coli (InfervacR, Laboratorios Calier), mantenidos bajo condiciones de campo una zona endémica de Ehrlichiosis monocítica canina, durante un lapso preestablecido de 9 (InfervacR, Laboratorios Calier) mantenidos bajo condiciones de campo durante un lapso de 9 semanas. MATERIALES Y METODOS Población y muestra El estudio se realizó en el Centro de Entrenamiento Canino de la Guardia Nacional de Venezuela (CEC) el cual es una institución militar de carácter educativo donde se forma al personal que entrena y utiliza a los semovientes caninos para la detección de drogas, sustancias explosivas y el rastreo de personas extraviadas o secuestradas, dentro del marco de la lucha del Estado Venezolano contra el tráfico y consumo de drogas y el uso ilegal de sustancias explosivas. En él se realizan dos cursos por año y en cada uno de ellos se forman cincuenta (50) perros provenientes de diferentes zonas del país, los cuales fueron el objeto de experimentación en el presente estudio. Se sometieron a estudio 20 caninos (40 %) de los 50 que ingresaron a uno de los cursos. Los 20 animales fueron divididos en 2 grupos de 10 ejemplares cada uno para conformar un grupo experimental y un grupo control. La adjudicación de los caninos a cada grupo se realizó al azar, de acuerdo al orden de llegada a la unidad de entrenamiento, alternando la asignación de un ejemplar para el grupo control y uno para el grupo experimental. A los 10 caninos del grupo experimental se les aplicó un inmunoestimulante inespecífico basado en células inactivadas de Propionibacterium granulosum y lipopolisacárido (LPS) de Escherichia coli (20) y se mantuvieron en condiciones de campo. El inmunoestimulante se aplicó al momento del ingreso al estudio, a la dosis recomendada por el fabricante: dos aplicaciones vía intramuscular a cada animal, con un intervalo de 48 horas entre ambas, 1 ml para los ejemplares con peso inferior a los 10 kg y 2 ml para los caninos con peso superior a los 10 kg. Los 10 caninos del grupo control se sometieron a idénticas condiciones de campo que el Grupo Experimental, pero sin la aplicación del inmunoestimulante. Diseño experimental Cada ejemplar fue evaluado para detectar infección con E. canis en la semana 1 y en la semana 9, mediante la técnica de Reacción en Cadena de Polimerasa (PCR) "anidada" o "Nested PCR", técnica estandarizada de biología molecular de alta sensibilidad que detecta y amplifica el gen 16S rrna de la E. canis, utilizando iniciadores (Primers) específicos para esta especie (21) y mediante el frotis de capa blanca teñido con un Kit de coloración rápida (HemacolorR, Merck, USA)., técnica que permite la detección de mórulas sugestivas de microorganismos de la familia Anaplasmataceae, la cual tiene una sensibilidad muy baja, por lo que el porcentaje de error es alto [2,10, 22]. Las pruebas Hematológicas (Hemoglobina, Hematocrito, Recuento Leucocitario y Recuento Plaquetario) se realizaron con un equipo automatizado de hematología BECKMAN COULTER R, modelo COULTER AcT diff. Al finalizar el estudio, los ejemplares que permanecieron enfermos recibieron el tratamiento específico contra la Ehrlichiosis canina recomendado en la bibliografía [2,20,11]. El parámetro utilizado en este estudio como criterio principal para determinar si un canino está o no infectado fue la prueba de PCR por ser de muy alta sensibilidad, ya que detecta una célula sanguínea infectada en 3 x 10 6 células o cantidades tan bajas de ADN como 0,2 pg. Asimismo se le dio valor a los hallazgos de trombocitopenia, leucopenia, fiebre y linfoadenomegalia como altamente significativos de la enfermedad [21]. Análisis Estadísticos Los datos provenientes del promedio semanal por grupo de temperatura corporal, hematocrito, recuento de leucocitos y recuento de plaquetas para cada grupo, fueron analizados mediante el programa de análisis estadístico SPSS versión 15.0. Se les aplicó una prueba "T de student" a través de la cual se compararon estos promedios y se estableció si existían diferencias estadísticamente significativas entre ambos grupos, con una probabilidad de error inferior a 5%. RESULTADOS Mediante la técnica de PCR para la detección de E. canis se observó que el número de caninos del grupo 51
Mujica R, Pérez M ninguna resultó positiva a IFI (21). En Brasil, estudios realizados en una zona endémica de la enfermedad revelaron un 34 % de positivos a PCR específico para E. canis [22]. Además del ingreso de caninos previamente infectados con E. canis, tenemos el hecho de que el estudio se realizó en una zona endémica de ehrlichiosis y anaplasmosis canina donde las condiciones ambientales facilitan la propagación de la infección [1]. Por lo tanto, esta variable facilita que en condiciones normales y sin la aplicación de ningún tratamiento preventivo, se incremente el número de nuevos casos de la infección durante la estadía de los caninos en la zona, como sucedió con el Grupo Control, en el que se obtuvo como resultado que de 6 (60%) caninos positivos a la prueba en la semana 1 aumentaron a 8 (80%) en la semana 9 (Ver Tabla 1 y Figuras 1, 2, 3 y 4). Adicionalmente en un estudio previo se reportó que garrapatas Rhipicephalus sanguineus de esta zona están infectadas con E. canis y negativas a A. platys, lo que apoya el incremento en el número de caninos infectados con E. canis, debido a que existen el vector y las condiciones epidemiológicas apropiadas para la dispersión de la infección [1]. Paralelamente, otro estudio señala que sitios donde confluyen una alta cantidad de caninos sumado a condiciones epidemiológicas apropiadas para la propagación de la enfermedad, son variables que facilitan el hallazgo de altos porcentajes de infección por E. canis. En este estudio se evaluaron 27 muestras provenientes de un criadero de perros particular en Carolina del Norte, EE.UU., y se encontró 15 (56%) animales infectados con E. canis mediante la prueba de PCR específico (27). Todos estos hallazgos respaldan los resultados obtenidos con el Grupo Control. En el Grupo Experimental se observó un comportamiento diferente, ya que el número de caninos infectados no aumentó durante su estadía de 9 semanas en la zona, manteniéndose en 5 (50%) caninos infectados con E. canis. Este resultado puede indicar que el tratamiento inmunoestimulante basado en células inactivadas de Propionibacterium granulosum y al lipopolisacárido (LPS) de Escherichia coli (Pg-LPS), el cual se ha reportado como potenciador de la respuesta inmune contra bacterias intracelulares obligadas como la E. canis, influyó en que no aumentara el número de caninos infectados a pesar de existir diversas variables que favorecen la aparición de nuevos casos de la enfermedad, la reinfección y el mantenimiento de la misma. Del Grupo Experimental, 2 (20%) caninos PCR positivos en la semana 1 evolucionaron a negativos en la semana 9, y 3 (30%) permanecieron negativos ambas semanas (Ver Figuras 1 y 2). Estos resultados pudiesen indicar nuevamente que el tratamiento inmunoestimulante aplicado permitió que algunos de los ejemplares que ingresaron a la zona endémica de la enfermedad, generaran una respuesta inmune adecuada que les permitió no infectarse con E. canis o infectarse y eliminar la bacteria sin ningún otro tratamiento. Existen estudios sobre detección de E. canis mediante la técnica de PCR en sangre y tejidos que señalan que el tratamiento con Doxiciclina elimina el microorganismo de la sangre, pero que permanece alojado y viable en órganos del Sistema Retículo Endotelial [28]. Posiblemente en los caninos que evolucionaron de positivos a negativos a la prueba de PCR en el transcurso de las 9 semanas del estudio, los microorganismos pueden estar presentando un patrón de migración a los tejidos similar al citado en el reporte. En trabajos anteriores se ha reportado un estado de premunición en el que perros inmunocompetentes infectados subclínicamente con E. canis o los afectados clínicamente (fase aguda) que recibieron tratamiento de corta duración con Oxitetraciclina, desarrollaron una inmunidad protectora contra la enfermedad. Reportan además que esta inmunidad es mantenida principalmente por la vía de la respuesta inmune celular. Por el contrario, la respuesta inmune humoral fue relacionada con la patogenia de la enfermedad [12, 29, 30, 31]. Estos trabajos refuerzan la hipótesis de que el estímulo sobre la respuesta inmune celular puede generar cambios positivos para los caninos expuestos a la infección con E. canis. La capacidad para defenderse de la infección con E. canis, parece ser ocasionada por la acción que ejerce el tratamiento inmunoestimulante sobre la respuesta inmune celular, específicamente la activación de los linfocitos Th1, con la consiguiente producción de citoquinas que actúan como activadoras de otras células, según lo descrito por el manual del fabricante del producto y la descripción de la acción de sus componentes individuales, descrita en la bibliografía consultada (17,20). Entre las citoquinas producidas por la activación de los linfocitos Th1, se encuentran el Interferón? (IFN?), el factor de necrosis tumoral (TNF) y el factor de migración de los polimorfonucleares (PNMF), que a su vez actúan sobre los macrófagos, células natural Killer (NK) y neutrófilos para que actúen sobre las células infectadas con E. canis, y directamente sobre la bacteria. Esta acción bactericida contra los organismos ehrlichiales se ejerce principalmente, a través de mecanismos 54
Hallazgos de Ehrlichiosis en Caninos Inmunoestimulados independientes del oxígeno, como la producción de Óxido Nítrico (NO), que a su vez inhibe la acción de la transferrina, encargada del transporte del ión hierro al interior de la célula hospedadora. Los organismos ehrlichiales son reconocidos por ser muy dependientes del hierro para su metabolismo, por lo que compiten por él con la célula hospedadora. También estas citoquinas actúan mejorando la capacidad de las células presentadoras de antígenos (CPA), y desencadenando mecanismos adicionales como la opsonización y la vía del complemento, que contribuyen a la eficacia de esta respuesta celular [32,33]. En base a todos estos resultados, se sugiere que el tratamiento inmunoestimulante basado en células inactivadas de Propionibacterium granulosum y al lipopolisacárido (LPS) de Escherichia coli (Pg-LPS) es efectivo en evitar, atenuar o eliminar la infección con E. canis y se recomienda su utilización como refuerzo para el tratamiento antibiótico específico. CONCLUSION Los resultados del presente trabajo demostraron la atenuación de la severidad del cuadro clínico característico de la Ehrlichiosis monocítica canina, en los caninos que recibieron una tratamiento inmunoestimulante basado en células inactivadas de Propionibacterium granulosum y al lipopolisacárido (LPS) de Escherichia coli. RECOMENDACIONES En zonas endémicas de Ehrlichiosis monocítica canina, se recomienda la aplicación de un inmunoestimulante inespecífico a los caninos al momento de su ingreso a la misma, ya que el presente estudio demostró que en los caninos inmunoestimulados experimentalmente se produjo una atenuación de la severidad del cuadro clínico de la enfermedad. Esto conllevaría a evitar el uso de antibióticos como tratamiento preventivo y a mejorar el pronóstico de la enfermedad cuando se presente. Realizar trabajos adicionales, ampliando el número de muestras, y midiendo otras variables como raza, caracterización de la respuesta inmune (incluyendo poblaciones leucocitarias y citoquinas involucradas) y detección de Ehrlichia canis en tejido para determinar si los caninos infectados al inicio del experimento y que resultaron negativos a PCR en sangre al finalizar el mismo, realmente eliminaron al microorganismo. AGRADECIMIENTOS A la Dra. Mary Carmen Jiménez y al Dr. Franklin Bracamonte, Médicos Veterinarios del Centro de Entrenamiento Canino de la Guardia Nacional Bolivariana de Venezuela, y a la Lic. Hildamar Chavier y a la Sra. Rosa Pérez del Laboratorio de Patología Clínica del Decanato de Ciencias Veterinarias de la Universidad Centroccidental "Lisandro Alvarado", por su valiosa colaboración en la obtención y procesamiento de las muestras estudiadas. BIBLIOGRAFIA [1]Arraga-Alvarado C.M. 1992. Ehrlichiosis canina en Maracaibo. Estado Zulia. Venezuela. Reporte de 55 casos. Rev. Cient. FCV-LUZ. 2: 30-40. [2]Arraga-Alvarado C.M. 2000. Ehrlichiosis y Rickettsias plaquetarias en Humanos. Séptimo Congreso Venezolano de Microbiología. Maracaibo, Venezuela. [3]Blecha, F. y Charley B. 1990. Rationale using immunopotentiators in domestics food animals. Adv Vet Sci Comp Med, 35: 3-19. [4]Bulla C., Kiomi R., Pessoa J., Trinca L., Souza R., Wiedmeyer Ch. 2004. The Relationship between the degree of thrombocytopenia and infection with Ehrlichia canis in an endemic area. Vet. Res. 35: 141-146. [5]Couto G. 2002. Enfermedades por Rickettsias. Ehrlichiosis Canina. En Manual Cl[inico de Peque;as Especies. Birchard S. y Sherding R. Mc Graw Hills Interamericana. 2` Ed. Madrid, Espana. [6]de Castro M. B.; Machado R. Z.; de Aquino L. P.; Alessi A. C.; Costa M. T. 2004. Experimental acute canine monocytic ehrlichiosis: clinicopathological and immunopathological findings. Vet. Parasitol. 119 (1): 73-86 [7]Donatien A. y Lestoquard F. 1935. Existence en Algerie d'une Rickettsia du chien. Bul. de la Soc. de Path. Exot. 28: 418-419. [8]Dumler J.S., Barbet A.F., Bekker C.P.J., Dash G.A., Palmer G.H., Ray S.C., Rikihisa Y., Rurangirwa F.R. 2001. Reorganization of genera in the families Rickettsiaceae and Anaplasmataceae in the order Rickettsiales: Unification of some especies of Ehrlichia with Anaplasma, Cowdria with Ehrlichia and Ehrlichia with Neorickettsia, descriptions of six new especies combinations and designations of Ehrlichia equi and HGE agent as subjetive sinonims of Ehrlichia phagocytophila. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 51: 2145-2165. [9]Harrus S. Waner T., Keysary A., Aroch I., Voet 55
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