ELECTROFORESIS Q U Í M I C A B I O L Ó G I C A. D E P A R T A M E N T O D E B Q C A. F C N Y C S. U N P S J B 2 0 1 7
Que es la electroforesis? Qué permite analizar? Que factores influyen?
Separar y analizar moléculas: proteínas ADN/ARN... en función de su diferente movilidad al aplicar un campo eléctrico (dependerá de su carga eléctrica) cátodo ánodo * Moléc. (+) polo () o cátodo * Moléc. () polo (+) o ánodo ELECTROFORESIS LIBRE moléculas en disolución o suspensión: poco resolutiva SOPORTE ánodo ELECTROFORESIS DE ZONA SOPORTE que retiene las moléculas: elevado poder de resolución cátodo
ph bajo: carga neta positiva pi: carga neta nula ph alto: carga neta negativa
EQUIPO ELECTROFORÉTICO fuente de alimentación cable Componentes: cátodo muestra + electrodo cubeta gel (E. horizontal) electrodo gel muestra electrodo tampón cátodo ánodo * Fuente de alimentación * Dos electrodos ánodo (+) cátodo () * Cubeta * Tampón de electroforesis cubeta ánodo + cable fuente de alimentación * Soporte electroforético (gel) (E. vertical) tampón
FACTORES QUE AFECTAN A LA ELECTROFORESIS 1_ Campo eléctrico *Diferencia de potencial (Vvoltios): bajo voltaje (10500 V) alto voltaje (50010000 V) *Intensidad (Aamperios): flujo de carga eléctrica depende de V y de R (Ley de Ohm V=RxI) *Resistencia (R): determinada por el soporte y tampón electroforesis *Temperatura: efecto Joule : El aumento de temperatura generado puede dañar el soporte, el equipo electroforético y desnaturalización de las proteinas refrigerantes 2_ Muestra *Carga o densidad de carga: carga eléctrica/masa de la molécula *Tamaño *Forma: formas globulares avanzan más 3_ Tampón de electroforesis 4_ Soporte *ph: determina el grado de solvatación y la carga de las moléculas generalmente es ligeramente básico moléculas () *Fuerza iónica: generalmente 0.05 o 0.1 M para que no interfiera
SOPORTE ELECTROFORÉTICO Características Gel poroso (entramado tridimensional interno) Tiene que permitir el paso de moléculas Material inerte: NO puede estar cargado y no debe adsorber las moléculas de la muestra Tipos de Soporte Gel poroso No restrictivo (Tipo I): Tamaño poro >>> moléculas, no opone impedimento a su paso separación sólo por CARGA * Electroforesis de proteínas: Papel, almidón, agar, acetato de celulosa Restrictivo (Tipo II): Tamaño poro moléculas, opone resistencia a su paso separación por tamaño (tamizado molecular) * Electroforesis de proteínas: Separación por CARGA y TAMAÑO Acrilamida * Electroforesis de DNA/RNA: Separación sólo por TAMAÑO Agarosa, acrilamida
EN ACETATO DE CELULOSA: PROTEINOGRAMA Soporte: (no restrictivo) Tiras de acetato de celulosa Electroforesis horizontal muestra + Avance de las proteínas Campo eléctrico (DV) 1. Aplicación de la muestra 2. Electroforesis 3. Detección por tinción: Azul de Coomassie Negro amido 4. Densitometría / Espectrofotometría Aplicaciones diagnósticas en serología (separación proteínas séricas).
EN GEL DE POLIACRILAMIDA (PAGE) Soporte: (restrictivo) Gel de Poliacrilamida * Polimerización de dos componentes: Acrilamida + Bisacrilamida * Variación de la concentración variación del tamaño de poro [poliacrilamida] tamaño poro Electroforesis vertical 1. Preparación del gel 2. Montaje de la cubeta 3. Aplicación de la muestra 4. Electroforesis 5. Detección por tinción: Azul de Coomassie Sales de plata
EN GEL DE POLIACRILAMIDA (PAGE) Ventajas: * Gran poder de separación por CARGA y por TAMAÑO * Químicamente inertes * Transparentes (permite densitometría) * Estables (ph, fuerza iónica, temperatura) * Versatilidad en cuanto al tamaño de poro y entramado uniforme Aplicaciones: * Separar proteínas * Determinar peso molecular de una proteína * Separar proteínas oligoméricas * Separar proteínas en función de su pi SDSPAGE Electroenfoque * Separar proteínas de mezclas muy complejas Electroforesis 2D * Ver si hay una proteína en concreto Western Blot
Condiciones de la PAGE: SDSPAGE * No desnaturalizantes: separamos por CARGA y TAMAÑO PAGE * Desnaturalizantes: separamos sólo por TAMAÑO SDSPAGE Agentes desnaturalizantes: SDS (dodecilsulfato sódico), urea, reductores (DTT, bmercaptoetanol)... SDS: detergente aniónico (), dota a todas las proteínas de carga () todas migrarán hacia el ánodo (+), separándose sólo por tamaño SS SS 50 kda SS SS + SDS SS 44 kda + SDS + DTT 25 kda
SDSPAGE: determinación del peso molecular Marcadores de peso molecular: * Mezcla de diferentes proteínas preteñidas de las que conocemos el peso molecular. * Por comparación podemos averiguar el PM de nuestra proteína.
A trabajar se ha dicho ajo Práctico Electroforesis en tiras de acetato de celulosa Separar mediante electroforesis las proteínas contenidas en el suero. Electroforesis en gel de poliacrilamida Calcular gráficamente la masa molecular aparente de proteínas por comparación con proteínas patrones en un grafico de distancia vs Log PM aparente.
Electroforesis en tiras de acetato de celulosa Tipo de electroforesis.. Soporte: acetato de celulosa ( conservadas en metanol). Muestra: suero humano. ph de trabajo: 8, 5 Buffer: Veronal Sódico. Siembra: con aplicador, en cátodo o ánodo? Voltaje: 2mA por tira. Tiempo de corrida: 45 minutos. Revelado: Amidoschwart o Ponceau. Solución decolorante: metanol, agua y acido acético ( 47,5:47,5: 5). Disolución de cada banda: Acido Acético al 80 %. Cuantificación espectrofotométrica a 495 nm.
Electroforesis en gel de poliacrilamida