Vigilancia Epidemiológica de fiebre Zika basada en Laboratorio Instituto de Diagnóstico y Referencia Epidemiológicos Dr. Manuel Martínez Báez
Gestión Integrada para la prevención y control del Dengue Componentes técnicos: 1.Epidemiología -> Vigilancia integrada y preparación a brotes 2.Laboratorio (incluye la vigilancia para CHIKV y ZIKAV) 3.Atención al paciente 4.Manejo Integrado de Vectores (MIV) 5.Gestión del ambiente 6.Vacuna (preparación ante la eventual introducción)
Generalidades del virus El virus Zika (ZIKAV) es un arbovirus del género flavivirus; filogenética y antigénicamente muy relacionado con DENV, virus de la Fiebre Amarilla, VON y de la Encefalitis de San Luis Pertenece a la Familia Flaviviridae Es transmitido por mosquitos del genero Aedes Esta filogenéticamente y antigénicamente relacionado con el virus Spondweni Presencia de tropismo neurológico = Sindrome de Gullain Barré Tiene un genoma de RNA de cadena positiva, de cadena sencilla de aproximadamente 10.7 Kb Se han identificado tres linajes: Asiático, Oeste de África y Este de África Plourde AR, Bloch EM. Emerg Inf Dis 2016; 22 (7): 1185-1992
Generalidades del virus El ZIKAV fue aislado por primera vez en 1947, en un mono Rhesus centinela (No. 766), en la selva de Zika, cerca de la cuidad de Entebbe, Uganda, a un costado de Lago Victoria En 1948 fue aislado por primera vez a partir de vector Aedes africanus, como resultado de vigilancia entomovirológica La infección en seres humanos se demostró por estudios serológicos en 1952 (Uganda y Tanzania) y en 1968 se logró aislar el virus a partir de muestras de suero humano en Nigeria Actualmente en el Continente Americano esta circulando el linaje Asiático.
Genoma de Flavivirus. Primer reto WNV DENV ESL ZIKA YF Reacción cruzada presente en reacciones serológicas pero ausente en protocolos de Biología Molecular
Filogenia de Flavivirus Cercanía filogenética con Spondweni: = Factor de asociación a casos con daño neurológico
Segundo reto: Clínica: ZIKA vs DEN-CHIK Síntomas Dengue Chikungunya Zika Fiebre ++++ +++ +++ Mialgias/artralgias +++ ++++ ++ Edema de extremidades 0 0 ++ Erupción maculopapular ++ ++ +++ Dolor retroocular ++ + ++ Conjuntivitis 0 + +++ Linfadenopatías ++ ++ + Hepatomegalia 0 +++ 0 Leucopenia/trombocitopenia +++ +++ 0 Hemorragias + 0 0 Fuente: adaptado de Halstead SB et al. Et de la plaquette du Yap State. Department of Helath Services
El Tiempo real es la metodología de elección y es la que se está usando en México InDRE - CDC acordaron utilizar protocolo de trabajo unificado Tercer reto: Innovación y desarrollo en la Vigilancia por Laboratorio de Arbovirus InDRE promoverá utilizar también RT-qPCR DUPLEX (CHIKV-DENV; ZIKAV- B DENV) Se desarrollan métodos para detección de hasta 10 marcadores diferentes en reacciones de amplificación independientes Plataforma de ultima generación utilizando microfluidos y proceso único y cerrado (extracción y amplificación) Las metodologías en desarrollo incluyen el utilizar plataformas en las cuales se puedan extraer ARN y al mismo tiempo amplificar, metodologías que serán utilizadas para analizar también bacterias (Rickettsias, Leptospira). Arbovirus y virus hemorrágicos División Biología Molecular/ Innovación y Desarrollo A E C D DGE/InDRE Laboratorio de Arbovirus y Virus Hemorrágicos División Biología Molecular/Innovación y Desarrollo
RT-PCR y RT-qPCR SYBR Green - ZIKA Ante la ausencia de sondas especifica: Identificación de especificidad mediante analisis de High Resolution Melting (HRM) Curvas de Disociación (Control Negativo) Curvas de Disociación (Control positivo) Control Negativo Control Positivo Curvas de disociación del control Negativo Curvas de disociación del Control positivo) Curvas del Control positivo (Duplicado) Escala logarítmica Curvas del Control positivo) Curvas del Control negativo) Curvas del Control positivo (Duplicado) Escala lineal DGE/InDRE Laboratorio de Arbovirus y Virus Hemorrágicos División Biología Molecular/Innovación y Desarrollo
Duplex DENV-ZIKAV En una sola reacción detección de cinco virus Ahorro de insumos Ahorro de tiempo A B C D E Gráfico de amplificación reacción dual (Controles positivos en la misma mezcla de reacción): A) DENV-1, B) DENV-2, C) DENV-3, D) DENV-4 Y E) ZIKAV. Escala lineal Arbovirus y virus hemorrágicos División Biología Molecular/ Innovación y Desarrollo
Duplex DENV-ZIKAV B E A D C Gráfico de amplificación reacción dual (Controles positivos en la misma mezcla de reacción): A) DENV-1, B) DENV-2, C) DENV-3, D) DENV-4 Y E) ZIKAV. Escala logarítmica Arbovirus y virus hemorrágicos División Biología Molecular/ Innovación y Desarrollo
DENV-1/ZIKA Escala lineal Escala logarítmica B A B A Gráfico de amplificación reacción dual (Controles positivos en la misma mezcla de reacción): A) DENV-1 y B) ZIKAV Arbovirus y virus hemorrágicos División Biología Molecular/ Innovación y Desarrollo
DENV-2/ZIKA Escala lineal Escala logarítmica A A B B Gráfico de amplificación reacción dual (Controles positivos en la misma mezcla de reacción): A) DENV-2 y B) ZIKAV Arbovirus y virus hemorrágicos División Biología Molecular/ Innovación y Desarrollo
DENV-3/ZIKA Escala lineal Escala logarítmica B B A A Gráfico de amplificación reacción dual (Controles positivos en la misma mezcla de reacción): A) DENV-3 y B) ZIKAV Arbovirus y virus hemorrágicos División Biología Molecular/ Innovación y Desarrollo
DENV-4/ZIKA Escala lineal Escala logarítmica B A B A Gráfico de amplificación reacción dual (Controles positivos en la misma mezcla de reacción): A) DENV-4 y B) ZIKAV Arbovirus y virus hemorrágicos División Biología Molecular/ Innovación y Desarrollo
Vigilancia por Laboratorio Linaje circulando en América. CDC confirma a InDRE hace 15 días que se pueden utilizar iniciadores promovidos por CDC de Fort Collins R. Lanciotti
Sonda para SINGLEPLEX y para DUPLEX Sonda marcada con Texas Red ó análogo y con Quasar 705 Solicitar de manera inmediata a su proveedor de Applied ajustar Termociclador para utilizar el quinto canal (Quasar 705)
ZIKA - Algoritmo en fase aguda Para búsqueda intencionada Con circulación autóctona Muestra de suero de 0-5 días de iniciados los síntomas, según definición de caso emitido por DGE Se descarta caso - RT-qPCR + Se confirma caso ZIKAV DIFERENCIAL - Denv, Chikv Leptospira Rick, Paludismo VERSION 1.0
ZIKA - Algoritmo en fase aguda para búsqueda intencionada Con circulación autóctona La muestra necesaria para la confirmación de infección por virus Zika, debe tomarse por venopunción (5 ml sin usar anticoagulante) entre los días 0 y 5 de iniciados los síntomas, Enviar al LESP 2.5 ml de suero en red de frío (2-8 C), acompañadas con el formato de estudio epidemiológico correctamente llenado El llenado incorrecto del formato es motivo de rechazo definitivo
Objetivos de la toma, manejo y envío de muestras al LNR o al LESP Realizar Vigilancia Epidemiológica basada en laboratorio de calidad para Entrega de resultados confiables, en tiempo y forma Definir los lineamientos para la toma, manejo y envío de muestras para diagnóstico de Zika Toma, manejo y envío de Calidad = Diagnóstico por laboratorio de Calidad
Tipo de muestras Suero, sangre completa*, LCR Moscos Tejidos Otros (RNA, cdna) Tipo de muestras analizadas en laboratorio para Arbovirus (Zika) * RT-qPCR
Proceso Tipo de muestra ( Suero, sangre completa*, LCR, moscos) Red fría Documentos completos Formato de envío con datos clínicos epidemiológicos completos Casos especiales para envío a CCOMS (CDC). Triple embalaje (CLASE A) CALIDAD TOTAL DE INICIO A FIN * RT-qPCR
Enero_2011 Febrero_2011 Marzo_2011 Abril_2011 Mayo_2011 Junio_2011 Julio_2011 Agosto_2011 Septiembre_ Octubre_2011 Noviembre_2 Diciembre_2 Enero_2012 Febrero_2012 Marzo_2012 Abril_2012 Mayo_2012 Junio_2012 Julio_2012 Agosto_2012 Septiembre_ Octubre_2012 Noviembre_2 Diciembre_2 Enero_2013 Febrero_2013 Marzo_2013 Abril_2013 Mayo_2013 Junio_2013 Julio_2013 Agosto_2013 Septiembre_ Octubre_2013 Noviembre_2 Diciembre_2 Enero_2014 Febrero_2014 Marzo_2014 Abril_2014 Mayo_2014 Junio_2014 Julio_2014 Agosto_2014 Septiembre_ Octubre_2014 Noviembre_2 Diciembre_2 Enero_2015 Febrero_2015 Marzo_2015 Abril_2015 Mayo_2015 Junio_2015 Julio_2015 Agosto_2015 Experiencias 2500 Rechazos y justificación del rechazo en la RNLSP de México Total Lipémica Hemolizada insuficiente Días de tránsito Sin Registro 2000 1500 1000 500 0-500 2011 2012 2013 2014 Mejora continua en la RNLSP reflejo de la disminución de rechazos 2015 Coordinación de Vigilancia Epidemiológica por Laboratorio/DDYR/InDRE/DGE
Experiencias. No cumplir con criterios de aceptación.. RECHAZOS DEFINITIVOS
VEV vs ARBOVIRUS Necesario intensificar la vigilancia entomovirológica Aprovechar la ventaja de esta vigilancia. ENTOMOLÓGICA VIROLÓGICA Búsqueda anticipada y preventiva ZIKA
Perspectivas Reto para la Salud Pública y para el diagnóstico por laboratorio DENV (CUATRO SEROTIPOS, GENOTIPOS) CHIKV ZIKA WNV Insumos InDRE cuenta con insumos para 1200 reacciones MAYARO.
Perspectivas a mediano plazo RT-qPCR genérico Dengue RT-qPCR Chikungunya RT-qPCR Zika Cuatro canales en termociclador RT-qPCR FNO Propuesta realizada a CDC y OPS en agosto del presente año
Documentos de referencia GRACIAS Laboratorio de Arbovirus y Virus Hemorrágicos CISCO: 59410, 59591 arbored.indre@gmail.com