Introducción Objetivo Fundamento Trabajo Práctico Nº 2 MÉTODO DE LA MEMBRANA FILTRANTE PARA EL ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DEL AGUA Materiales Procedimiento Resultados Conclusiones Actividades Adicionales Bibliografía INTRODUCCIÓN El agua es un factor importante en la producción de los medicamentos, por lo tanto su calidad, es de suma importancia ya que es la materia prima más usada y además está presente en otros procesos relacionados con dicha producción, como por ejemplo en los de limpieza y sanitarización. Es por ello que el agua puede considerarse una fuente potencial de contaminación bacteriana de los medicamentos. En la industria farmacéutica se conocen cinco tipos de agua: agua potable, agua suavizada, agua desionizada, agua destilada y agua producida por ósmosis reversa. La calidad microbiológica de cualquier tipo, dependerá del contenido microbiano del agua utilizada como materia prima, de los métodos de tratamientos a los que es sometida, y de los sistemas empleados para su almacenamiento y distribución. Para garantizar la calidad microbiológica del agua, es necesario realizar el control de la misma, utilizando diferentes métodos, que nos permitan realizar la numeración o el recuento de bacterias aerobias mesófilas, mohos y levaduras, coliformes o la investigación de microorganismos patógenos.
OBJETIVO Al finalizar, el trabajo práctico, el estudiante estará en capacidad, mediante la consulta bibliográfica y la aplicación de las técnicas microbiológicas, de realizar el control microbiológico del agua de proceso, utilizando la técnica de la Membrana Filtrante. FUNDAMENTO Este método se fundamenta en determinar el número y tipo de microorganismos presentes en una muestra de agua de proceso, por medio de la filtración de la misma a través de una membrana filtrante con poros de tamaño adecuado (0,45 μm de diámetro), la consiguiente retención de los microorganismos sobre dicha membrana y el cultivo de los mismos en diferentes agares de acuerdo al tipo de microorganismo. MATERIALES Muestra de agua de proceso Agua peptonada al 0,1 % Placas estériles con medio ENDO Placas estériles con agar Sabouraud Placas estériles con agar Cetrimide Placas estériles con agar MacConkey Placas estériles con agar para Recuento en Placa (Agar Standard Methods) Equipo de filtración (Millipore) Membranas filtrantes estériles Bomba de vacío Pinzas estériles Estufa PROCEDIMIENTO 1. Colocar una membrana filtrante estéril, bajo condiciones asépticas, sobre el centro del portafitro, usando pinzas estériles, con la superficie cuadriculada hacia arriba. 2. 2
2. Ensamblar el equipo, colocando el dispositivo de filtración y asegurando con una pinza. 3. Verter 100 ml de la muestra de agua, en el portafiltro y proceder a filtrar. 4. Lavar el embudo con aproximadamente 100 ml de agua peptonada al 0,1%. 5. Remover la parte superior del portafiltro, y con una pinza estéril transferir la membrana a la placa de Petri que contiene el medio de cultivo correspondiente al microorganismo que se va a identificar: Coliformes en agar endo, bacterias aerobias mesófilas en agar para recuento en placas, mohos y levaduras en agar Sabouraud y Pseudomonas aeruginosa en agar cetrimide. 6. Al colocar la membrana, evitar la formación de burbujas entre ésta y el medio de cultivo. 7. Esperar aproximadamente 20 minutos, para permitir la adhesión de la membrana al medio. 8. Con excepción de las placas de agar Sabouraud, incubar las placas en forma invertida, a las diferentes temperaturas y tiempos, de acuerdo al microorganismo investigado: 2. 3
1. Coliformes: Agar ENDO Incubación 35ºC ± 2ºC x 24-48 h 2. Mohos y Levaduras: Agar Sabouraud Incubación 25ºC ± 2ºC x 5-7 días 3. Bacterias aerobias Agar Recuento Incubación 35ºC ± 2ºC x 24-48 h mesófilas en Placas 4. Pseudomonas aeruginosa Agar cetrimide Incubación 35ºC ± 2ºC x 24-48 h RESULTADOS Contar las colonias en las membranas. Expresar los resultados como unidades formadoras de colonias (u.f.c.) por ml o por 100 ml de agua, considerando el volumen filtrado y el factor de dilución. CARACTERÍSTICAS DE LOS MICROORGANISMOS RETENIDOS EN LAS MEMBRANAS FILTRANTES, DE ACUERDO A LOS MEDIOS USADOS. Bacterias aerobias mesófilas en agar para recuento en placas. Mohos y Levaduras en agar Sabouraud. Coliformes en agar endo. 2. 4
Pseudomonas aeruginosa en agar cetrimide Anotar los resultados: CONCLUSIONES ACTIVIDADES ADICIONALES 1. Investigue el significado de agua de proceso. 2. Señale las diferencias que existen entre los métodos para el recuento de microorganismos citados en la guía. 3. Investigue para cada medio de cultivo usado en el presente ejercicio práctico, su composición y las características que presentan los microorganismos en el medio de cultivo para su numeración. 2. 5
BIBLIOGRAFÍA Brock T.D. Madigan M.T. Martenko J.J. y Parker J. (Eds) Biología de los microorganismos. 8ª Edición. Prentice Hall International. (1999). Prescott, L.M. y col. Microbiology. W.C. Brown Publishers. 4ª Edición. (1998). The Official Compendia os Standards USP 24 NF. The United States Pharmacopeia. The National Formulary. Pharmacopeial Convention Inc. Rockville MD (1999). http://www.bme.es/microkit/pic4sp.html Prof. Norma De Castro Prof. María Luisa De Curtis Enero 2002 2. 6