Universidad Nacional del Nordeste Facultad de Medicina Carrera de Especialización en Bacteriología a Clínica
Aplicación n de las Técnicas T de Biología Molecular en el Laboratorio de Bacteriología
ADN Genoma bacteriano Cromosómico Extracromosómico ARN Plásmidos Transposones Integrones ARNm ARNt ARNr
ADN
Plásmidos Autorreplicantes Tamaño y número variable Heredables y Transferibles Codifican funciones no esenciales Factor F (Pili sexuales) Factores R (Resistencia a antibióticos) Plásmidos Col (Bacteriocinas) Plásmidos de virulencia (Toxinas) Plásmidos metabólicos (Enzimas)
Transferencia de plásmidos Conjugación
Transposones Secuencia de ADN que puede saltar de un sitio a otro del ADN Pueden moverse dentro del ADN cromosómico, entre plásmidos o pasar de un plásmido al ADN cromosómico Transposón simple o secuencia de inserción (IS) Transposón compuesto (Tn)
Integrones Los integrones son plataformas de ensamblaje que incorporan cassettes genéticos y los convierten en genes funcionales asegurando su correcta expresión. Los integrones no son autotranferibles, pero al asociarse a transposones pueden moverse. Estructura Promotor de la integrasa Gen Intl1 que codifica la integrasa o recombinasa (Cataliza una recombinacion sitioespecifica) Zona atti (donde se insertan las IS) Promotor (uno o dos) para los genes de resistencia insertados Gen qaceδ (Resistencia a compuestos de amonio cuaternario) Gen sul1 (Resistencia a sulfonamidas) Zona de lectura abierta Orf 5 (Función desconocida)
ARN Un esqueleto de azúcares y fosfatos ARN tiene uracilo en vez de timina. El uracilo se une a la adenina ARN es una cadena simple Tres tipos: ARNm, ARNt y ARNr (70s)
Dogma Central de la Biología Molecular
Variaciones fenotípicas Cambios en las características de una bacteria sin que se altere su genoma Pueden ser Morfológicas: tamaño, forma, flagelos Cromógenas: producción o no de pigmentos Enzimáticas: producción de enzimas inducibles Patogénicas: capacidad de producir enfermedad Cepa lisa Cepa rugosa
Variaciones genotípicas Ocurren al azar Baja frecuencia Heredables No siempre se expresan Mutaciones Sustitución de bases Adición de bases Pérdida de bases Alteración de muchos pares de bases Translocación
Estudio del ADN
Obtención n del ADN Medios sólidos (agar) Medios Líquidos (caldos) Muestras (Clínicas, alimentos)
Lisis celular Lisis alcalina Ebullición Shock térmico Proteinasa K Medios tensioactivos Sonicación Lisozima
Extracción n del ADN Fenol/cloroformo Guanidina Sílice Separación magnética Filtración
Secuenciación A partir de un fragmento de ADN se determina la secuencia completa de bases
Enzimas de restricción Reconocen una determinada secuencia de ADN (4-10 nt más o menos) y la cortan. Se extraen de bacterias y poseen múltiples usos en Biología Molecular
Sondas de ADN
Sondas de ADN Sustancia radioactiva 32 P o 35 S Compuesto fluorescente Esteres de acridina Enzima Peroxidasa o fosfatasa alcalina Sustancias de captura Biotina (Avidina) o digoxigenina (Ac anti digoxigenina) Anticuerpos
Sondas de ADN Hibridación in situ (FISH) Muestra clínica + sonda marcada
Sondas de ADN Detección directa en muestras clínicas Neisseria gonorrhoeae Chlamydias Streptococcus Grupo A Gardnerella
Sondas de ADN Confirmación de cultivos Mycobacterium spp Streptococcus Grupos A y B S. aureus L. monocytogenes N. gonorrhoeae Campylobacter spp H. influenzae
Sondas de ADN Detección de genes de resistencia Gen mec en Staphylococcus Betalactamasas en enterobacterias
Chips o arrays de ADN
Chips o arrays de ADN
Clonalidad Variación genotípica Variación genotípica Variación genotípica
Clonalidad Tipificación molecular de Acinetobacter baumannii multirresistentes aislados de pacientes internados en la unidad de terapia intensiva de un hospital de adultos Tracogna MF; Presti SE; Gariboglio Vázquez ML; Merino LA
Clonalidad
Clonalidad
Clonalidad
Aplicaciones de la PCR en el Instituto de Medicina Regional
1. Detección de microorganismos no cultivables o de difícil crecimiento. Mycoplasmas Chlamydias Helicobacter pylori Mycobacterium tuberculosis
Helicobacter pylori 1 2 3 4 5 6 7 8 9 urea 411 pb
Micoplasmas urogenitales 1 2 3 4 5 6 7 8 1500 pb Mollicutes 500 pb 400 pb 300 pb 200 pb 311 pb 281 pb Ureaplasma Mycoplasma 100 pb ALTERNATIVA DIAGNOSTICA PARA MICROORGANISMOS DE DIFICIL AISLAMIENTO IMPLICADOS EN INFERTILIDAD MASCULINA Gómez, María V.; Deluca, Gerardo D.; Merino, Luis A.
2. Detección de genes de virulencia Helicobacter pylori Genes caga, vaca, baba2 Escherichia coli ETEC: genes est, elt EPEC: genes eae, bfp EIEC: gen HipA EHEC: gen eae, stx EAEC: gen AggR Vibrio cholerae Toxina CT: gen ctxa Proteína estructural de la fimbria: gen TCP Staphylococcus aureus Leucocidina de Panton Valentine: gen PVK
Helicobacter pylori Genotipificación de Helicobacter pylori en biopsias gástricas Medina MG, Medina ML; Lösch SL, Merino LA
Escherichia coli 1 2 3 4 5 6 7 ECEI ECET ECEP ECEH ECET ECEA
E. coli verotoxigénica
Staphylococcus aureus 1 2 3 4 5 6 7 8 Luk-PV Caracterización feno-genotípica de cepas de Staphylococcus aureus resistentes a meticilina aisladas de fosas nasales de estudiantes de Medicina. Ford ML; Esquivel P; Lifschitz V; Gomez MV; Merino LA
4. Detección de genes de resistencia Staphylococcus gen meca Enterobacterias genes de betalactamasas Enterococcus genes vana, vanb, van C
Staphylococcus aureus 1 2 3 4 5 6 7 8 meca Caracterización feno-genotípica de cepas de Staphylococcus aureus resistentes a meticilina aisladas de fosas nasales de estudiantes de Medicina. Ford ML; Esquivel P; Lifschitz V; Gómez MV; Merino LA
Enterobacterias 1 2 3 4 5 6 7 pb CTX-M
5. Detección de patógenos en alimentos o en el ambiente Salmonella Shigella Listeria Campylobacter E. coli 0157
Campylobacter M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 773 pb C. jejuni 364 pb C. coli Detección e identificación molecular de especies termotolerantes de Campylobacter Gariboglio Vázquez ML, Tracogna MF, Lösch LS, Merino LA
GRACIAS POR SU ATENCIÓN! N!