INTRODUCCIÓN A LA BIOTECNOLOGÍA FORESTAL

INTRODUCCIÓN A LA BIOTECNOLOGÍA FORESTAL 19 Octubre 2005

INTRODUCCIÓN Limitantes del mejoramiento genético tradicional Largo tiempo de desarrollo del bosque Conocimiento incompleto de las correlaciones juvenil-maduro Dificultad para obtener la transferencia y expresión de genes deseables en una alta frecuencia

INTRODUCCIÓN Qué es la biotecnología a? Cualquier aplicación tecnológica que utiliza sistemas biológicos, organismos vivos, o derivados de ellos, para hacer o modificar productos o procesos con un propósito específico (FAO, 2000).

INTRODUCCIÓN Por qué es atractiva en el contexto del mejoramiento genético forestal? Podría reducir el tiempo necesario para introducir nuevos caracteres (o mejorarlos) dentro de especies de interés comercial Podría acortar el largo tiempo de espera para la regeneración de genotipos deseados

INTRODUCCIÓN Cuáles son los impactos de la biotecnología a? Productividad de los bosques Producción de celulosa Calidad de la madera Tasa de crecimiento Resistencia a - Insectos, enfermedades - Sequía, heladas - Herbicidas Densidad Contenido de celulosa Contenido de lignina Largo de fibra Textura Ángulo de microfibrillas Suministro eficiciente de madera Incremento de la productividad de las plantas de procesamiento Incremento de la calidad y el valor de los productos

INTRODUCCIÓN Cuáles son las herramientas de la biotecnología? Algunas de ellas: Micropropagación Criopreservación Genomica Ingeniería genética Bioprocesos etc., etc.

INTRODUCCIÓN (FAO, 2005)

(FAO, 2005)

CONTENIDOS 1. MÉTODOS DE REPRODUCCIÓN VEGETATIVA 2. GENÓMICA 3. TRANSFORMACIÓN GENÉTICA 4. CONCLUSIONES

1. MÉTODOS DE REPRODUCCIÓN VEGETATIVA

PROPAGACIÓN IN VITRO (MICROPROPAGACIÓN) Micropropagación Desarrollo de líneas clonales a partir de pequeñas muestras de tejido, tales como yemas, conos en desarrollo, raíces o embriones extraídos desde semillas. Cuándo se utiliza? Cuando la macropropagación presenta limitaciones Cuando el material genético es muy valioso y escaso (cruzamientos controlados, transgénicos, especies en peligro de extinción, etc).

Cómo funciona? Se basa en el principio de la totipotencia vegetal Requiere: Un medio de cultivo para los tejidos: Agar Solución con macro y micronutrientes Fitohormonas (auxinas/citoquininas) Antibióticos Condiciones controladas de temperatura y fotoperíodo. Trabajo en condiciones de esterilidad

Modalidades de micropropagación Organogénesis Iniciación y crecimiento de órganos, usualmente raíces y brotes, a partir de tejidos meristemáticos, como por ejemplo embriones extraídos de semilla. Embriogénesis somática Formación de embriones (embrioides) a partir de células o tejidos somáticos, como por ejemplo, conos en etapas tempranas de desarrollo.

Organogénesis

CRIOPRESERVACIÓN Criopreservación Muestras de tejidos son conservadas a baja temperatura (-196 C), manteniendo su estado fisiológico, pero deteniendo completamente su desarrollo. Cuándo se utiliza? Cuando se requiere mantener el estado fisiológico juvenil de genotipos propagados vegetativamente. Semillas con problemas de almacenaje

Alamos regenerados a partir de callos criopreservados

2. GENÓMICA

Genómica Es la rama de la genética que estudia los organismos en términos de su genoma.

GENÓMICA Genética Mendeliana Genómica Estructural Genética de poblaciones Citogenética GENÓMICA Marcadores genéticos, Secuenciación de DNA, ligamiento genético, localización de genes,mapeo de QTLs, descubrimiento y caracterización de genes y rutas metabólicas Bioinformática Genética Cuantitativa Genómica Funcional Genética Molecular

GENÓMICA ESTRUCTURAL Subdisciplina de la genómica relacionada con áreas como: Marcadores genéticos Secuenciación de DNA Mapas físicos y de ligamiento Localización de genes Mapeo de QTLs

GENÓMICA ESTRUCTURAL Marcador genético Un gen o mutación que sirve como una señal de localización dentro del genoma. Los marcadores genéticos están basados en diferencias entre individuos a nivel de la secuencia de DNA.

Análisis de marcadores moleculares Replicación del DNA

Análisis de marcadores moleculares

Análisis de marcadores moleculares Reacción n en cadena de la polimerasa (PCR) Se mezclan: DNA DNA polimerasa Nucleotidos (A, T, G, C) Partidores Termociclador Otros (Buffer, Cloruro de Mg, agua) Ej. Partidor (primer): 5 - GAG AGA GAG AGA GAG AC -3

Análisis de marcadores PCR ETAPA 1: Denaturación del ADN. (95 C) ETAPA 2: Adición de partidores (primers). (55 C) ETAPA 3: Extensión realizada por la DNA polimerasa. (72 C) REPETICIÓN CÍCLICA DE LAS 3 ETAPAS

Análisis de marcadores moleculares Electroforesis

Tipos de marcadores genéticos (basados en PCR) RAPD (ADN polimórfico ampliado al azar) Microsatélites = SSR (repeticiones de sequencia simple) AFLP (polimorfismo de longitud en fragmentos amplificados)

Cada sistema de marcadores tiene sus características Principio de ensayo RAPD Microsatélites AFLP Amplificación con primers al azar Amplificación de microsatélites Nivel de Medio Alto Medio polimorfismo Cantidad de ADN Baja Baja Media requerido Costo Bajo Alto Medio Amplificación selectiva de fragmentos de ADN

Aplicaciones de los marcadores genéticos Identificación de genotipos (cruzamientos, huertos semilleros, establecimiento de ensayos, protección de cultivares, etc.) Estudios de diversidad genética en poblaciones de árboles Estudios de taxonomía Mapas genéticos y selección asistida por marcadores (M.A.S)

Identificación de genotipos

Análisis diversidad

GENÓMICA ESTRUCTURAL Marcadores genéticos Secuenciación de DNA Mapas físicos y de ligamiento Localización de genes Mapeo de QTLs

Mapas genéticos y M.A.S. Usos: Localización de loci de caracteres cuantitativos (QTL) de importancia económica Comparación de la organización de cromosomas entre distintas especies M.A.S (Selección asistida por marcadores) para caracteres dificiles o costosos de medir (ej: calidad de la madera, rendimiento de pulpa, etc.)

Loci de caracteres cuantitativos (QTLs)

Loci de caracteres cuantitativos (QTL)

Selección asistida por marcadores (MAS)

GENÓMICA Genética Mendeliana Genómica Estructural Genética de poblaciones Citogenética GENÓMICA Marcadores genéticos, Secuenciación de DNA, ligamiento genético, localización de genes,mapeo de QTLs, descubrimiento y caracterización de genes y rutas metabólicas Bioinformática Genética Cuantitativa Genómica Funcional Genética Molecular

GENÓMICA FUNCIONAL Subdisciplina de la genómica relacionada con áreas como: Análisis de la expresión génica Análisis funcional de los genes Relaciones entre genes y caracteres

Análisis de perfiles de expresión de genes mediante microarreglos Microarreglo: pieza de vidrio o plástico sobre la cual se han pegado fragmentos de DNA (de hebra simple) en un arreglo microscópico. Estos chips son usados para analizar el comportamiento de miles de genes simultáneamente. Qué genes son expresados diferencialmente entre las muestras analizadas? Cúal es la relación entre los genes que están siendo evaluados?

Análisis con microarreglos

Ejemplo uso de microarreglos: Identificación de genes asociados a tolerancia a cobre en álamo Condiciones experimentales 1 Genotipo: Populus deltoides 3 Dosis de cobre: 0.3, 30 y 60 µm 3 Tiempos de exposición: 0, 12 y 24 h

Criterio de selección de los genes significativamente regulados p value < 0.05 Fold < - 3 Reprimidos Fold > 3 Inducidos

Un cluster agrupa genes asociados a respuesta de defensa -20 20 Escala razón de cambio

3. TRANSFORMACIÓN GENÉTICA

Qué es un árbol transgénico? Un árbol que contiene un gen foráneo (un transgen), el cual le fue introducido mediante alguna técnica de transferencia.

Cuales son los caracteres mejorados mediante la transgenia? Resistencia a herbicidas Tolerancia al ataque de insectos Resistencia a enfermedades bacterianas, fungosas y virales Fitorremediación Esterilidad floral Tolerancia al frío Tolerancia a la sequía Calidad de la madera

Algunos ejemplos... Tolerancia al ataque de inséctos Tolerancia a herbicidas

Cómo se genera un árbol transgénico nico?

Cómo se puede transferir un gen? Transformación con Agrobacterium sp Electroporación Microinyección Biolística

Transferencia de genes a través s de Agrobacterium sp

Transformación n mediante Agrobacterium sp

TRANSFERENCIA DE GENES Otros métodos m de transferencia Electroporación Microinyección Biolística

Cómo es un transgen? Gen Promotor Secuencia codificadora de proteína Terminador Constructo génico Promotor regulable Gen interés Gen reportero termina dor

Cómo se regula la expresión de un transgen? Utilizando un promotor adecuado... Promotor constitutivo: Provoca la expresión en todos los tejidos y en todo momento. Promotor tejido-específico: Provoca la expresión en tejidos específicos (hojas, raíces, cambium, etc). Promotor inducible: Provoca la expresión en respuesta a ciertos estimulos (luz, estrés, etc.).

Cómo se regula la expresión de un transgen? Adicionalmente... Los transgenes pueden ser sobreexpresados de modo de producir grandes cantidades de la proteína de interés.

Cómo se regula la expresión de un transgen? Los transgenes pueden ser utilizados para bloquear (reprimir) la expresión de genes específicos. Ejemplo: RNA antisentido

Ejemplo 1: Generación de álamos con bajo contenido de lignina Repression of lignin biosynthesis promotes cellulose accumulation and growth in transgenic trees. Hu et al. 1999. Nature Biotechnology 17: 808-812 Objetivo: Reprimir la expresión de la enzima 4- cumarato CoA ligasa (4CL)

Estrategia utilizada: inhibición del gen Pt4CL mediante represión por antisentido. La secuencia del gen Pt4CL fue fusionada a un promotor constitutivo (CaMV 35S) en una orientación antisentido. Resultados obtenidos: 45 % reducción del contenido de lignina y 15 % de aumento en el contenido de celulosa, respecto de plantas no transformadas.

Ejemplo 2: Generación de plantas transgénicas para la fitorremediación de metales pesados Analysis of transgenic indian mustard plants for phytoremediation of metal-contaminated mine tailings Benett et al. 2003. Journal of Environmental Quality 32: 432-440 Objetivo: Incrementar enzimas glutamilcisteina sintetasa y glutation sintetasa

Glutamato Cisteina Glutamilcisteina Glicina Glutatión Fitoquelatinas Glutamilcisteina sintetasa (GCS) Glutatión sintetasa (GS) Fitoquelatina sintetasa (PCS)

Estrategia utilizada: Sobreexpresión de los genes que codifican las enzimas glutation sintetasa y glutamilcisteina sintetasa. Las secuencias de los genes EcgshI y EcgshII fueron fusionadas al promotor constitutivo (CaMV 35S) Resultados obtenidos: Acumulación de metales pesados en el orden de 1.5 a 6 veces más de la cantidad acumulada por las plantas no transformadas.

UTILIZACIÓN DE ÁRBOLES TRANSGÉNICOS A ESCALA OPERACIONAL Existe la necesidad de establecer ensayos de campo P = G + E + GxE

Importancia de los ensayos de campo La expresión de los nuevos genes puede activarse o desactivarse bajo condiciones de campo, en momentos indeterminados Los genes foráneos podrían ser eliminados en el proceso sexual o podrían causar cambios inesperados en el genotipo del árbol Algunas interacciones fisiológicas del árbol podrían ser afectadas de manera impredecible por los genes foráneos Muchos organismos modificados genéticamente podrían ser menos adaptados en un ambiente competitivo, respecto de los no modificados

Riesgos a evaluar a) transferencia de genes a poblaciones silvestres (polución genética) b) desarrollo de pestes resistentes a los mecanísmos de resistencia modificados de los transgénicos c) efectos deletéreos en los ecosistemas derivados de alteraciones en las cadeanas ecológicas

Estrategias para minimizar o eliminar el riesgo de plantaciones con árboles transgénicos a) Plantación en mosaico de árboles transgénicos y árboles no modificados b) Introducción de múltiples genes de resistencia (en el caso de modificación para tolerancia a plagas) c) Expresión temporal y tejido-específicos de caracteres modificados d) Esterilidad floral masculina, femenina o de ambos

4. CONCLUSIONES

A pesar del mejoramiento genético logrado con algunas especies, su progreso está restringido por largos períodos de generación, pobres correlaciones juvenil-maduro de caracteres, y dificultad para identificar y acumular genes valiosos. La biotecnología incrementará las capacidades de los mejoradores para resolver problemas prácticos. Ésta ofrece un potencial de mejoramiento cuantitativo y cualitativo que va más allá del mejoramiento genético clásico. Sin embargo, la biotecnología requerirá del mejoramiento tradicional para verificar el nuevo conocimiento o desarrollo de nuevos productos

Debido al largo período de rotación, la utilización de árboles transgénicos requerirá exhaustivos ensayos de campo para asegurar la realización de los resultados esperados y que los efectos indeseados son mínimos o nulos.