Cultivo in vitro de tejidos vegetales

Transcripción

1 Cultivo in vitro de tejidos vegetales Tatiana Vega Investigador Asistente CIC - Area Genética - Fac. Ciencias Agrarias JTP Area Biología Fac. Cs. Bioquimicas y Farmaceuticas UNR

2 Cultivo de tejidos vegetales Conjunto de técnicas de laboratorio en el que se obtienen plantas completas a partir de una porción reducida de tejido separado de la planta

3 Totipotencia Potencialidad inherente de las células vegetales de regenerar una planta completa, bajo los estímulos adecuados - Haberlandt (1900 s) Formación de órganos Organogénesis directa indirecta Formación de embriones Embriogénesis somatica directa indirecta

4 Explanto Planta completa

5 Vía indirecta: con formación de callo Grafi G. et al., doi: /fpls

6 Organogénesis directa: sin formacion de callo formación de meristemoides

7 Embriogénesis somática Fernando J. et al.,

8 Embriogénesis somática en zanahoria. A partir de células del floema se obtienen los embriones somáticos que son un excelente sistema de propagación clonal. Los bioreactores permiten el cultivo a gran escala de los mismos.

9 Producción de semillas artificiales via embriogénesis somática Inducción de la embriogénesis somática (a-d); selección de embriones somáticos (e); inmersión de los embriones en alginato de sodio (f); acomplejamiento con nitrato de calcio (g); lavado (h); semilla sintética (i)

10 a) Partes de una semilla sintética.b,c y d) Obtención de plantas de Arachis pintoi (2n=3x=30) mediante semillas sintéticas (las barras verticales indican 3 mm)

11 Aplicaciones Estudios básicos de procesos fisiológicos en sistemas de células indiferenciadas, o en determinados órganos o grupos de células. En este caso lo que se persigue es la obtención de callos (cúmulos de células indiferenciadas) o de órganos determinados como ovarios o tallos. Nicotiana tabacum Source: Wikimedia commons Helianthus annuus Vega T., 2004

12 Aplicaciones Obtención de plantas con sanidad controlada. En caso de la infección por virus que se dispersan por el sistema vascular, es común el cultivo de meristemas para obtener nuevas plantas completas no infectadas.

13 Para las especies que se multiplican por esquejes, bulbos o tubérculos Técnica: cultivo de meristemas Aplicaciones

14 Algunas caracteristicas del tejido meristemático: - Sistema vascular poco diferenciado - Elevada actividad metabólica - Elevadas concentraciones de auxinas Existen virus que dejan sectores tejidos sin infectar y sólo unos pocos invaden los tejidos meristemáticos

15 Varios factores pueden afectar el desarrollo in vitro de una planta a partir de un meristema: - medio de cultivo empleado - estado fisiológico del explanto - concentración de hormonas endógenas - contaminaciones internas o externas producidas durante el desarrollo del cultivo - tamaño y localización del explanto

16 Desarrollo del cultivo: - Fase I. Etapa de iniciación - Fase II. Etapa de multiplicación. - Fase III. Etapa de acondicionamiento para el transplante a tierra. - Transplante.

17 Camara de cultivo

18 Aclimatacion

19 Análisis de las plantas obtenidas : - ISEM (observación directa por microscopio) - ELISA (hasta 10 ng/ml) - PCR (hasta 10 pg/ml)

20 Producción de plantas de ajo libre de virus INTA EEA. Entre Ríos, Argentina.

21 Producción de plantas de ajo libre de virus INTA EEA. Entre Ríos, Argentina.

22 Producción de plantas de ajo libre de virus INTA EEA. Entre Ríos, Argentina.

23 Aplicaciones Micropropagación. Es posible obtener plantas completas a partir de yemas o ápices terminales, o la obtención de embriones a partir de células somáticas que pueden ser utilizados en la producción de semillas sintéticas.

24 La micropropagación consiste en la propagación de un genotipo a gran escala a través del empleo de técnicas de cultivo de tejidos. Posibilita la producción de plantas de calidad uniforme a escala comercial, a partir de un genotipo selecto y con una tasa de multiplicación ilimitada.

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26 Ejemplo: Etapas de la micropropagación en plantas de paraíso gigante, Melia azedarach var. gigantea L. (Olmos et al., In Vitro Cell Dev Biol Plant 38: ): A) Huerto semillero de paraíso gigante con ejemplares de seis años de edad B) Etapa 0: plantas utilizadas como donantes de meristemas. C) Etapa 1: Establecimiento del cultivo: D) Etapa de Multiplicación: vástagos luego de 30 días sobre medio de multiplicación E) Explantos provenientes de la etapa de multiplicación con problemas de vitrificación y presencia de callof) Vástago enraizado en medio de MS con la concentración salina reducida a la mitad durante 2 días, seguido por el subcultivo en medio basal durante 30 días hasta estar listo para pasar a la etapa de aclimatización.

27 Aplicaciones Producción de híbridos sintéticos. En el caso de cruzamientos interespecíficos, en los que no se produce semilla por aborto temprano de los embriones. Fue una de las primeras aplicaciones de estas técnicas.

28 Aplicaciones

29 Aplicaciones

30 Aplicaciones Obtención de plantas doble haploides. Generalmente a partir del cultivo de anteras.

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32 Aplicaciones Conservación e intercambio de germoplasma. El cultivo y criopreservación de meristemas es la técnica de elección para el intercambio de material y la conservación a mediano y largo plazo. Producción de compuestos químicos de interés comercial

33 Aplicaciones Transgénesis. Dentro de un protocolo de transformación, ya sea por infección con Agrobacterium o por bombardeo con micropartículas, las etapas de regeneración y selección in vitro son de importancia crítica.

34 Mejoramiento genético à se basa en la existencia de variabilidad genética para los caracteres que se desea mejorar y la reproducción sexual para la incorporación de los mismos. Transformación à Método no sexual para la transferencia de genes. Traspasa la barrera entre reinos.

35 1983 à Primeros experimentos de transformacion en Tabaco y Petunia Hoy esta tecnología se aplica a unas 120 especies. Aplicaciones de interés agropecuario - obtención de plantas con resistencia a estreses bióticos (virus, insectos, hongos y bacterias) y a estreses abióticos (salinidad, sequía, etc.) - tolerancia a herbicidas para facilitar el control de malezas - modificación de la calidad nutricional de los cultivos

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37 Requerimientos para la obtención de plantas transgénicas disponer del transgen a introducir metodología eficiente para su transferencia al genoma vegetal Inducir el desarrollo de plantas mediante distintas técnicas de cultivo de tejidos identificar las plantas que porten y expresen el o los transgenes en los niveles deseados estudiar el comportamiento de los individuos transgénicos y su descendencia

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42 Métodos de transformación: biobalistica o Gene Gun

43 A, B, C: expresión transitoria del gen uida en embriones inmaduros 24 h post-bombardeo. D y E: embriones inmaduros bajo selección en higromicina. F: regeneración de los callos transgénicos bajo selección.

44 Transformación mediada por Agrobacterium

45 Transformación mediada por Agrobacterium

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48 Construcción del vector

49 Construcción del vector

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51 Estructura de las proteínas Cry de Bacillus thuringiensis Dominio I: inserción en la membrana y formación de poros. Dominio II y Dominio III: reconocimiento y unión al receptor. Tomado de: de Maagd et al., Trends in Plant Sci., 1999

52 Resistencia mediante EPSPS insensible a glifosato Tomado de Coruzzi and Last, Biochemistry and Molecular Biolgy of Plants, 2000.

53 Golden Rice : producción de de β-caroteno en arroz

54 Golden Rice : producción de de β-caroteno en arroz Control Línea z11b Tomado de: Ye et al., Science, 2000.

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56 Eventos transgénicos aprobados en Argentina

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58 Cultivo in vitro CIM: medio de inducción de callo: MS + 2,4-D SIM: medio de induccion de vastagos (shoots): MS + AIA + KIN + Gln

59 bibliografia general en español: - Capitulo 2 del libro "Cultivo de Tejidos en la Agricultura: Fundamentos y Aplicaciones. William M. Roca, Luis A. Mroginski (eds.) Centro Internacional de Agricultura Tropical (1991). link: - Biotecnologia y Mejoramiento Vegetal II. Levitus G., Echenique V., Rubinstein C., Hopp E., Mroginski L. (Eds.) INTA ediciones (2010). De este libro, los capitulos mas generales son I1, I2, I4, IV1, IV2, IV3 y V9