Curso de Micropropagación y Proyectos de Producción

Transcripción

1 Curso de Micropropagación y Proyectos de Producción 2008 Universidad de la República Facultad de Agronomía Área de Biología Vegetal Laboratorio de Biotecnología Docentes: Ing. Agr. Silvia Ross M.Sc. Ing. Agr. Mónica Krause Ing. Agr. Gabriela Pagliano M.Sc.

2 OObjetivos generales Se espera que el participante logre: 1. Adquirir los conocimientos teóricos que fundamentan el uso del cultivo in vitro en la producción vegetal. 2. Desarrollar la capacidad de observación, análisis y discusión mediante la confrontación teórico-práctica. 3. Conocer las diferentes técnicas de cultivo in vitro y su aplicación a la resolución de problemas productivos.

3 Objetivos Específicos 1. Conocer los fundamentos teóricos de la propagación vegetativa y los principios biológicos básicos que fundamentan el uso del cultivo in vitro en la producción vegetal. 2. Realizar las operaciones básicas de laboratorio que permitan el establecimiento de cultivos in vitro. 3. Analizar metodologías de micropropagación en diferentes cultivos (hortícolas, frutales, forestales, ornamentales).

4 Unidades Temáticas 1.Introducción al cultivo in vitro de tejidos vegetales. Reseña histórica, principales aplicaciones de las técnicas de cultivo in vitro, asepsia-esterilización, composición y preparación de medios. 2. Morfogénesis in vitro. Posibles vías morfogénicas y factores que la controlan. Organogénesis y embriogénesis somática. 3. Micropropagación como alternativa a la propagación vegetativa convencional en la producción frutícola, hortícola, forestal y ornamental. Etapas del proceso de micropropagación. Principales problemáticas asociadas. Sistemas de cultivo en medios líquidos, empleo de bioreactores. 4. Obtención de material de sanidad controlada en especies propagadas en forma vegetativa. Cultivo de meristemas. Programa de Certificación. Microinjerto en Citrus para la creación de un banco de yemas saneadas. Métodos de indexaje y control del material saneado. 5. Análisis de factibilidad de proyectos empresariales y análisis de costos de la micropropagación.

5 Metodología 1. Clases teórico-práctico (8 clases semanales de 3hs. de duración) (24hs). 2. Seminarios (3 clases de 2hs. de duración y 6hs. Presenciales y 6hs de trabajo grupal). Los estudiantes presentarán y discutirán un artículo científico entregado con anticipación por la cátedra sobre uno de los temas tratados. (12hs.) Visitas a Laboratorios de cultivo in vitro: Unidad de Biotecnología INIA, Las Brujas y Empresa Sta. Rosa (2 excursiones de 6 hs cada una). (12 hs.) Posible visita a Biosur. 3. Sistema de evaluación El curso se evaluará con la presentación del seminario (40%) y una prueba escrita (60%) y se requiere un 60% de los puntos para su aprobación. El exámen se exonera con el 80% de los puntos.

6 Laboratorio de Biotecnología Antecedentes del Grupo de Investigación en Especies Forestales Proyectos ejecutados Contribución de asociaciones ectomicorríticas en árboles forestales de importancia económica en Uruguay ( ). Financiado por IFS (International Foundation for Science). Estudios sobre la embriogénesis somática de Eucalyptus grandis (Hill) Maiden ( ). Financiado por CSIC (Comisión Sectorial de Investigación Científica). Micropropagación de árboles adultos de Eucalyptus grandis (Hill) Maiden ( ). Financiado por INIA Facultad de Agronomía. Estudio sobre las técnicas de conservación de germoplasma en Eucalyptus grandis (Hill) Maiden ( ). Financiado por CSIC. Estudio del comportamiento in vitro de especies de Lauráceas nativas de interés maderero. Financiado por CSIC. Obtención y validación de la sonda del viroide del Peach Latent Mosaic del duraznero. Convenio Fac. Agronomía-INIA. Financiado por Fac.Agr.-INIA (2004)

7 Laboratorio de Biotecnología Antecedentes del Grupo de Investigación- CITRUS Proyectos ejecutados Desarrollo de biotecnologías de diagnóstico de virus y viroides patógenos de cítricos. Financiado por BID-CONICYT. Instituciones participantes: División Biología Molecular IIBCE, Laboratorio de Biotecnología Facultad de Agronomía y Servicios de Protección Agrícola MGAP. ( ). Saneamiento de virus y viroides de germoplasma de citrus de MILAGRO S.A. Financiado por MILAGRO S.A. Desarrollo de un kit de diagnóstico rápido para la detección de viroides de citrus en el Uruguay. Financiado por INIA ( ). Métodos moleculares de diagnóstico de viroides para su aplicación en cuarentena y producción vegetal. Financiación: Fondo Clemente Estable. ( ).

8 Producción de plantas de cítricos resistentes a Psorosis y Tristeza mediante silenciamiento génico. Financiación :CSIC ( ). Obtención de las construcciones de Psorosis y Tristeza para la obtención de portainjertos de citrus silenciados. Tesis de Maestría Lic.Juan Pablo Gallino. Obtención y validación de la sonda de los virus de Psorosis y Tristeza para su diagnóstico. Tesis de grado de Rosana Michelazzo. (2006) Obtención de un kit de diagnóstico para todos los viroides presentes en las plantaciones citrícolas de Uruguay. Financiado por PDT. Tesis de Maestría de Carolina Palavé. Obtención de un kit de diagnóstico para todos los viroides cuarentenarios en las plantaciones citrícolas de Uruguay. Financiado por PDT. Tesis de Maestría de Lic.Rodolfo Umaña.

9 Estudio preliminar de caracterización de la diversidad genética y comportamiento in vitro de Acca sellowiana (Berg) Burret. Financiado por CSIC ( ) Validación de la sonda del viroide del tubérculo ahusado de la papa para su detección en análisis masivos. Convenio Facultad de Agronomía-MGAP. Financiado por MGAP ( ) Tesis de grado de Carolina Palavé. Evaluación de sistemas avanzados de cultivo in vitro para propagación clonal de especies leñosas y semileñosas de interés productivo. Tesis de Maestría de la Ing.Agr. Silvia Ross.

10 Unidad I Micropropagación y Proyectos de producción Cultivo in vitro de vegetales

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13 Principales Aplicaciones de la Biotecnología Resolución de problemas productivos Estudio de procesos fisiológicos y bioquímicos. -Ingeniería genética en plantas y animales. -Producción de inoculantes para leguminosas. -Fermentaciones microbianas. -Producción de reactivos de diagnóstico de enfermedades de plantas y animales. -Conservación de germoplasma. -Fertilización in vitro -Transplante de embriones. -Producción de hormonas. -Producción de enzimas para la industria láctea.

14 Institutos de Biotecnología Vegetal y Empresas Privadas que emplean cultivo de tejidos FACULTADES, IIBCE. INIA SEMILLAS SANTA ROSA S.A. (SESAR) VIVERO CIUDAD JARDIN ALDABE HERMANOS VIVERO UDAGAWA BIOSUR Ltda. EMPRESAS FORESTALES NIDETEC

15 Historia del cultivo de tejidos

16 Historia Década del 30. Primer regulador descubierto, la auxina Morel y Martin. Primera Aplicación del Microinjerto Miller et al. Descubrieron las citokininas Kanta. Propagación vegetativa de orquídeas por cultivo de meristemas Muirashige y Skoog. Desarrollo del medio MS Erickson y Jonasesen. Aislamiento de protoplastos Alfermann et al. Utilizaron células completas para biotransformación.

17 Unidad II Organización, funcionamiento y equipos del laboratorio. Equipos Asepsia y Esterilización

18 Organización y Funcionamiento del Laboratorio 1- Área de oficinas 2- Área de observación y examen. 3- Área de preparación de medios de cultivos. 4- Área de lavado y esterilización. 3- Almacén. 4- Área de incubación o de crecimiento in vivo. 7- Área de flujos laminares o de transferencia.

19 1- Área de preparación Material de vidrio e instrumentos

20 Balanza de precisión

21 Productos químicos, máscara y guantes

22 Agitador Magnético y Shaker

23 2-Área de lavado y esterilización

24 3- Área de transferencia

25 Cámara de flujo laminar horizontal

26 Instrumentos, materiales y equipos en el área de transferencia.

27 4- Área de incubación

28 5- Área de observación y examen.

29 Establecimiento y condiciones de crecimiento del el cultivo in vitro Para tener éxito en los cultivos in vitro es necesario: 1- ASEPSIA Y ESTERILIZACIÓN 2- ELECCIÓN DE LOS EXPLANTES 3- ELECCIÓN DEL MEDIO DE CULTIVO 4- BUENAS CONDICIONES DE CRECIMIENTO 1- Asepsia: - Ausencia de microorganismos patógenos - Es una condición esencial en el éxito del cultivo in vitro Para trabajar con cultivos asépticos es necesario: -Trabajar en ambientes adecuados. - Esterilización de instrumentos y medios de cultivo - Esterilización de recipientes de cultivo - Precaución del operario

30 ESTERILIZACIÓN Proceso mediante el cual cualquier material, sitio o superficie se libera de cualquier microorganismo vivo o espora. Procedimientos de esterilización 1- Calor seco (170 C 2 o 3 horas) 2- Vapor bajo presión C, 20 minutos. - Sacarosa Glucosa + Fructosa - Cambio de ph baja 0,3 a 0,5 unidades - Caramelización de los azúcares (160 C) y formación de compuestos tóxicos. - Precipitación de sales. - Depolimerización del agar. 3- Calor húmedo a 100 C. 4- Filtración

31 2- Preparar y desinfectar los explantos Preparación de los explantos agua,fertilización,etiolación, sanidad,pulverizaciones periódicas) Desinfección de los explantes (etanol 70%,hipoclorito de sodio 1-3%,hipoclorito de calcio 6 a 12 %,cloruro de mercurio 0,1 a 1,5 %). 3-Elección del medio de cultivo Composición química: agua, sales minerales, vitaminas, agar, carbohidratos, aminoácidos, reguladores de crecimiento y otros. El éxito de la utilización de un medio es lograr las concentraciones lo más cercanas al óptimo de las células o plantas para su crecimiento y diferenciación. 4- Buenas condiciones de crecimiento Para tener éxito en los cultivos in vitro es necesario: cámara de crecimiento (temperatura, luz y humedad).

32 Temperatura 1- constante 25, rango C. clima tropicales algodón, arroz,citrus 28 C clima templado 22 C especies bulbosas 18 C 2- diferencias de temperatura de la cámara y recipientes 3- Problemas: altas y bajas temp. disminuye el crecimiento 4- tratamientos de frio - bulbillos- dormancia 1-10 C. - plantas leñosas-dormancia GA3 o frío 2-4 C Luz Requerimientos in vitro Fotoperiodo 16hrs luz/8hrs oscuridad tubos fluorescentes lux (luz blanca fría)

33 HUMEDAD RELATIVA Cantidad de vapor de agua contenida en la atmósfera gaseosa Tapado y tipo de los recipientes Importancia: desecación e infecciones Tapones: aluminio, rollo pack, plástico, algodón. Tener en cuenta: intercambio gaseoso, humedad en el recipiente, pasaje de luz

34 4- Área de incubación

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