Crioprotectores Dimetilsulfóxido (DMSO) Crioprotectores coligativos previenen la deshidratación y disminuyendo la cantidad de agua absorbida por los cristales de hielo. El DMSO es ligeramente tóxico. Atraviesa rápidamente las membranas celulares
Proteínas Crioprotectores. Aumentan la supervivencia de las células cuando se agregan a la solución crioprotectora. Modifican la viscosidad y la temperatura de la transición de la solución crioprotectora. La fuente puede ser autóloga.
Soluciones crioprotectoras Hidroxietilalmidón (HES) Sustancia polimérica con cadenas de diferentes pesos moleculares que no penetra la célula de forma libre. Protege a la célula formando una capa viscosa y hialina que retarda el movimiento de agua.
Almacenamiento Congeladores mecánicos. -120 C a -86 C. Congelador de nitrógeno líquido. -196 C a -142 C.
Velocidad de congelación DMSO al 10 %. controlada. Concentración celular 50x10 6 /ml. Velocidad inicial de -1 C/min. En -40 C incrementar a -10 C/min. En -80 C colocar en la fase gaseosa de nitrógeno líquido hasta -146 C.
Velocidad de congelación no controlada DMSO al 5 % con HES al 6 %. Concentración celular menor a 300000 mm3. Colocar en bolsas de almacenamiento en un congelador mecánico a -80 C. En los -80 C incrementar a 10-16 C/min la velocidad hasta -146 C. Almacenar en la fase gaseosa de nitrógeno líquido.
Ventajas de la congelación no Menor costo. controlada Menor tiempo técnico. El HES previene la lisis de granulocitos durante el descongelamiento. Usando DMSO al 5% disminuyen las reacciones tóxicas durante la infusión. Sencillo. Menos espacio en el congelador.
Protocolo B = 1 C/min Protocolo D = 1.8 C/min
Congelación
Congelación
Congelación
Descongelación
Descongelación
Control de calidad de la Valoración in vitro. criopreservación. Conteo (citometría) (tasas de recuperación de células mononucleares, CD34 +, eritrocitos y PMN). Prueba de viabilidad por exclusión de tinción (con azul de trípano o yoduro de propidio). Cultivo de CFU-GM.
Citometría de Flujo
Citometría de flujo (CF) Es una técnica multiparamétrica que permite estudiar propiedades físicas y biológicas de las células vivas en una suspensión fluida. El citómetro es un aparato capaz de medir varios parámetros celulares a partir de una suspensión celular por medio de la interacción de las células con un haz de luz láser guiadas mediante un flujo contínuo.
Parámetros celulares que pueden estudiarse Contenido de ADN Parámetros nucleares Tamaño Complejidad citoplasmática Parámetros estructurales Proteinas intracelulares Actividad enzimática Proteinas de superficie Parámetros superficiales Parámetros extracelulares Parámetros citoplasmáticos Proteinas secretadas Interacción con otras cél.
Esquema del citómetro Fluídos Detectores FL3 PerCP, Cy5 Sistema electrónico FL2 PE FL1 FITC SSC Láser 488nm Sistema óptico FSC
Tipos de señales Señales de dispersión Señales de fluorescencia
Tipos de señales Señales de dispersión Detector de SSC L A S E R Detector de FSC Detector de FSC Detector de SSC
Inmunomarcación Anticuerpos monoclonales conjugados con fluorocromo
Tipos de señales Señales de fluorescencia Detector de SSC Detector de FL2 Detector de FL3 L A S E R Detector de FSC Detector de FSC Detector de SSC Detector de FL1 Bioq. Andrea Novoa - Laboratorio de Citometría de Flujo - Servicio de Hematología
Características de la CF Técnica sencilla y rápida Alta especificidad Multiparamétrica FSC y SSC FL1, FL2 y FL3 (un láser) ó FL1, FL2, FL3 y FL4 (dos láseres)
Fluorocromos Son moléculas químicas que absorben luz a una determinada longitud de onda y emiten a otra diferente. FITC en FL1 (Isotiocianato de fluoresceina) PE en FL2 ( Ficoeritrina) PerCP en FL3 (piridin clorofil proteina) APC en FL4 (aloficocianina)
Espectros de emisión
Procesamiento de la muestra Marcación de superficie Células en suspensión + Acs. Monoclonales* Lisis con Cloruro de amonio Resuspender Incubar 20 en oscuridad Centrifugar 5 a 1800rpm Adquisición de la muestra
Distribución de las células de una muestra de sangre normal Complejidad citoplasmática Tamaño celular
Distribución de las células de una muestra de médula ósea normal Eosinófilos SSC Granulocitos Monocitos Linfocitos Céls. Rojas nucleadas 10 0 10 1 10 2 10 3 10 4 CD45 PERCPCY5,5 -> 10277.008 CD45 PerCP Precursores CD34+
GB 430.000mm 3 CD 45 99.86 % CD 34 0.02 % GB 247.000mm 3 CD 45 99.42 % CD 34 1.05 % Stem cell
GB 170.000mm 3 CD 45 97.42 % CD 34 0.25 % GB 220.000mm 3 CD 45 98.43 % CD 34 1.05 % Stem cell
El recuento de células CD34+ es necesario para determinar las dosis requeridas en los transplantes de células progenitoras La Citometría de Flujo provee una metodología cuantitativa rápida y reproducible para la identificación y enumeración de células CD34+
Trypan Blue El método de exclusión Trypan Blue es ampliamente utilizado en laboratorios para la determinación de viabilidad; solamente penetra en células cuyas membranas plasmáticas estén dañadas. Las membranas de células viables no se tiñen con el colorante pues son impermeables al mismo, y las células teñidas y las no teñidas se visualizan con un microscopio.
Trypan Blue
CULTIVO CELULAR -Método Funcional
IMDM Recolección + IMDM FICOLL + STEM STEM FICOLL 400 G 30` GRD+Neutrof
AGAR STEM + IMDM 2 LAVADOS IMDM X 2 Resuspensión Recuento 1x 10 6 Suero Bovino Fetal Células Medio Cultivo STEM + Mononucleares
Mezcla + FEC-G Mezcla + FEC-G Mezcla sin FEC-G Estufa 37º C Humidificada, CO2 al 5% durante 10 dias Leer microscopio invertido Microcolonias + 4 C / Colonias entre 40-50 C
Efectos asociados a la infusión
Efectos asociados a la infusión de CPH. Los efectos colaterales de la infusión de CPH se minimizan reduciendo el volumen total y las células rojas infundidas. Los métodos al seleccionar mejor las celulas disminuyen los efectos colaterales y mejoran la velocidad de respuesta del injerto.
ehheh. Qué hay de nuevo, viejo? Gracias