Opsonofagocitosis. Carlos Andrés Palma Llanos. Carlos Andrés Palma Llanos

Transcripción

1 Opsonofagocitosis Carlos Andrés Palma Llanos Carlos Andrés Palma Llanos Alumno de la Carrera de Tecnología Médica Mención Bioanálisis Clínico, Hematología y Banco de Sangre

2 Opsonofagocitosis (OPA) Qué es una Vacuna Fundamento de la técnica C C C C CR FcR

3 Receptores Fc FcR Afinidad por Igs Distribución Función celular Abbas. Inmunología Celular y Molecular. 2004

4 Ratones sin la cadena γ del FcγR presentan una deficiencia en la defensa mediada por anticuerpos contra los microorganismos IFN- γ + FcγR Abbas. Inmunología Celular y Molecular. 2004

5 OPA Ensayo Clásico por Conteo (Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology) Citometría de Flujo (Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology) Fluorometría (Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology) Métodos microcópicos (sólo mencionado)

6 Bacterias (target) Streptococcus pneumoniae (16) Haemophilus influenzae b (2) Neisseria meningitidis (1) Enterococcus faecalis (2) Staphylococcus aureus (2)

7 OPA clásico (estandarización CDLI ) Streptococcus pneumoniae (target) CDC Caldo Todd-Hewitt 420 nm DO 0,5-0,6-70ºC 1000 UFC/20 ul 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F, 23F

8 Muestras De Suero 37 (6 de prevacunación y 31 de post vacunación) Vacuna conjugada de polisacárido14- Valente <n=10> o 23-Valente <n=21> -70ºC (200ul)

9 Sandoglobulina al 6%(referencia) Medición de IgG total por ELISA CPS (10ug/ml) 490 nm Estandar suero 89-SF

10 Células HL-60 (efectoras) Promielocitos leucemoides Maduración cultivo celular 6x10E5 células /ml ANTIBIÓTICOS nitroblue tetrazolium

11 Opsonofagocitosis Efector/blanco (400:1) Preparación células efectoras Obtención pellet 4x10E5 / 40 ul Resuspender en buffer de OPA

12 20 ul muestra por pocillo (para cada serotipo) 8 diluciones seriadas al doble (1:8 a 1:1024) DUPLICADO 20 ul de suspención bacteriana (1000 UFC) 37ºC 5%CO2, 15 OPSONIZACIÓN

13 10 ul suero conejo bebé (Complemento) Happytreefriends.com 40ul de células HL-60 diferenciadas (4x10E5) Fagocitosis 45 minutos a 37ºC con mezclado horizontal (220 rpm)

14 5 ul en agar Todd-Hewitt Toda la noche (60 UFC de base) T0 Celda de Control complemento (s/ac s) Complemento ±20% T0 Celda de control de la fuente de complemento (56ºC) Títulos de OPA ( 50% de muerte) son el recíproco de la dilución e.j. 1:8 8

15 También se realizó con leucocitos de sangre periférica Análisis de Receptores por Citometría CR1,CR3,FcγRI, FcγRII, FcγRIII,CD15

16 Algunos resultados

17 Sin alteración en la OPA

18 OPA por FACS CDLI Streptococcus pneumoniae Suero de prevacunación contiene altos niveles de anticuerpo polisacárido C (C-PS) Bacterias con subcultivo 3 veces Inactivación por calor, alcohol y formaldehído marcadas con una solución de fluoresceína isotiocianato (0,5 mg/ml)

19 OPA por FACS antisuero de conejo antisuero humano (56ºC) Complemento humano PMN de sangre periférica (efector)

20 OPA por FACS Suero (56ºC) y Complemento [2%] S.pneumoniae 2.5x10E6 (fuente) 30 minutos de opsonización 2.5x10E6 PMN 30 minutos de fagocitosis Fijación con p-formaldehído en tubos FACS Análisis por FACScan

21 FITC-positivo Corrección con FITC-positivo del pocillo s/anticuerpos Cálculos por regresión lineal en 25% de FITC-positivo

22 OPA por Fluorometría CDLI Se acopla a la técnica clásica Una centrifugación Pellet celular y bacterias dejadas en suspensión 20ul en placa hija con 40ul de alamar blue Incubación 5-6h Pocillo de control de complemento lea 20,000 unidades de fluorescencia 530/590 nm para excitación/emisión Bacteria cambia el indicador de azul a lavanda

23 Los títulos de OPA se determinan como el recíproco de la dilución con 50% de la fluorescencia media detectada en el control del complemento en ausencia de anticuerpos del suero pero con otros reagentes.

24 Algunas publicaciones Neisseria meningitidis y diferencia bactericida y opsonofagocítica de las distintas subclases de IgG en ratones para un epítope. Scandinavian Journal of Immunology.59, 34-39, 2004 Enterococcus faecalis usando probióticos como inductores de anticuerpos. Infection 33, Staphylococcus aureus por relación con infección nosocomial y multirresistencia. IAI IgA como opsonina para el neumococo. J. Clin. Invest. 104: Niños VIH positivo vacunados contra el neumococo generan niveles similares de anticuerpos IgG que niños sanos, pero la opsonofagocitosis muestra un decrecimiento estadísticamente significativo. CDLI

25 Discusión y Conclusión Comparar los niveles de respuesta entre diferentes grupos etarios, socioculturales, étnicos, etc. JID Presenta variaciones dependientes de recursos Pero misma fundamento Destacado rol de S.pneumoniae Diferenciación entre nivel de Ac s y funcionalidad Posible uso masivo en el futuro Comparación mundial Vacunas más específicas

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