MATERIALES Y MÉTODOS. Células MARC-145

Transcripción

1 26 MATERIALES Y MÉTODOS Células MARC-145 Se utilizaron células MARC-145 (macrófagos renales de embrión de mono) para propagar el virus PRRS utilizando la cepa PRRSV 16244B Nebraska [no. de acceso al banco de genes AF046869]. Las células MARC-145 se cultivaron en medio DMEM (Dulbecco s Modified Eagle s Medium, SIGMA Chemical Company, St. Louis, MO, USA) utilizando botellas de cultivo de 25 cm 2 (Corning Glass Works, Corning, NY, USA) con 10% de suero fetal bovino (SFB) (SIGMA), 100 UI/mL de penicilina, 100 µg/ml de estreptomicina y 50 µg de gentamicina (SIGMA). Las células fueron incubadas a 37 C en atmósfera húmeda y 5% d e CO 2. Los cambios de medio fueron cada tres días o según la confluencia, utilizando tripsina para resuspender las células. Virus PRRS Se utilizó un aislamiento del virus del PRRS realizado en nuestro laboratorio. El virus se propagará en monocapas confluentes de células MARC-145 preparadas con 24 h de anticipación en botellas de cultivo de 25 cm 2 (Corning Glass Works, Corning, NY, USA). Después de h de infección, los cultivos de células infectadas se sometieron a un choque térmico (-80/25 C) para liberar las partículas vira les intracelulares. Se cosecharon y clarificaron por centrifugación a 3000 r.p.m. durante 30 minutos a 4 C. Se almacenó el sobrenadante rico en partículas virales en volúmenes de 1 ml a 70 C hasta su uso para la tit ulación del virus (Allende et al., 1999). 26

2 27 Titulación del Virus PRRS En una placa de microcultivo de 96 pozos se realizaron diluciones décuples del sobrenadante y se inoculó en células MARC-145. Después de 4-5 días se analizó el número de placas virales a través del efecto citopático y los resultados se expresaron en dosis infectantes en cultivo celular 50% (DICC 50% ). Estandarización de la Técnica de Evaluación de Apoptosis Infección y Tinción de Células MARC-145 En una placa de 6 pozos se cultivaron células MARC-145 infectadas y no-infectadas con PRRSV a una multiplicidad de infección (MOI) de 1 y se incubaron por 24 horas a 37 C en un ambiente del 5 % de CO 2. Después de las 24 horas de incubación, las células se cosecharon y se incubaron con un primer anticuerpo anti-prrsv por 20 minutos a 4 C. Posterior a los lavados, las células se incubaron con un segundo anticuerpo goat anti mouse IgG fluoro-marcado con ficoeritrina (PE), para su análisis por citometría de flujo. A la par se introdujeron células sin teñir. 27

3 28 Generación de Células Dendríticas a Partir de Cultivos de Monocitos de Cerdo Animales de Experimentación Se utilizaron cuatro cerdos de 4 a 6 semanas de edad, procedentes de una granja libre de los principales padecimientos de cerdos. Se alojaron en la unidad metabólica de CIAD con agua y alimento ad libitum. Muestras Obtención de Células Adherentes Se colectaron de 20 a 25 ml de sangre en tubos con heparina a partir de la vena cava anterior del cerdo. La sangre se mezcló en relación 1:2 con medio DMEM (Sigma) sin SFB y con antibióticos. Para separar las células mononucleares (CMN) se utilizó un gradiente de Ficoll-Hypaque Plus (Armarsham Biosciences) en relación 1:5. Se centrifugó a 2,000 r.p.m. por 20 min a 4º C en una centrifuga Beckman GS-15R. De las 4 fases resultantes se tomó la fase de CMN, se lavaron con DMEM sin suero (1,400 r.p.m., 10 min), se incubaron con cloruro de amonio por 5 min para lisar los eritrocitos (en caso de ser necesario) y se lavaron con DMEM sin suero dos veces. Las CMN se resuspendieron en medio DMEM con 10% de SFB (Sigma). La viabilidad celular se evaluó por exclusión con azul de tripano (Sigma) y las células se contaron con un hematímetro utilizando un microscopio invertido Leica DMIL. Las CMN se cultivaron en cajas de cultivo de 25 cm 2 a una densidad celular de 5x10 6 /ml de medio y se incubaron toda la noche a 37 C y 5% de CO 2. Para obtener las células adherentes 28

4 29 (ricas en monocitos), las cajas de cultivo se lavaron tres veces con DMEM sin SFB para eliminar las células no-adherentes. Diferenciación y Maduración Las células adherentes se incubaron en medio DMEM en presencia de 20 ng/ml de IL-4 y 20 ng/ml de GM-CSF, por siete días para promover su diferenciación hacia células dendríticas, cambiando medio nuevo cada dos días. En el día cinco se les agregó IFNα para su maduración; simultáneamente, se evaluaron los cambios en el fenotipo. Evaluación de Marcadores de Superficie Para la evaluación de los marcadores de superficie se utilizaron 5 x 10 5 células/ml del total de las CMN obtenidas. Se hicieron alícuotas de 500 µl y se hizo un lavado con 1 ml de PBA 1% frío (buffer de fosfatos con albúmina de bovino al 1%). Posteriormente, las células se incubaron por 20 min a 4 C con un primer anticuerpo (CD14, CD80/86, MHC II y SWC3). Posterior a los lavados con PBA frío, las células fueron incubadas con el segundo anticuerpo goat anti mouse IgG fluoro-marcado con ficoeritrina PE por 20 min a 4 C en oscuridad y se lavó el exceso de anticuerpo. Por último, las células se fijaron agregando 200 µl de para-formaldehído al 1% (PFA 1%), se filtraron y se guardaron a 4 C en osc uridad hasta su adquisición en el citómetro. Infección de Células Dendríticas con Virus PRRS Una vez maduras, las células dendríticas fueron colectadas utilizando solución reguladora de disociación, para con ello despegar todas las células. Las células fueron centrifugadas 1200 r.p.m. por 10 minutos a temperatura ambiente, se evaluó la viabilidad celular y se contaron como se 29

5 30 indicó antes. Se infectaron con el virus PRRS con un MOI de 5 y se incubaron por 1 hora a 37 C y 5% de CO 2 en una placa de 24 pozos. Después de la incubación, las células fueron lavadas con PBA frío para retirar el virus no-adherido y se incubaron por 24 horas a 37 C y 5% de CO 2. Evaluación de la Apoptosis en Células Dendríticas Las células dendríticas fueron cosechadas y centrifugadas a 1,200 r.p.m. por 5 min, se lavaron con PBS 1x y se resuspendieron en buffer de unión 1x (ZYMED). Se agregaron 10µl de anexina V-FITC (ZYMED), se incubó a temperatura ambiente por diez minutos y se centrifugó. El botón celular se resuspendió en buffer de unión 1x, se agregaron 10µl de ioduro de propidio (ZYMED) y finalmente las células se adquirieron en un citómetro de flujo FACScalibur, el cual utiliza el programa CellQuest. Análisis de Datos El análisis de las células infectadas y no-infectadas se realizó utilizando el programa WinMDI 2.8 (Fig. 6). Se hizo una comparación del promedio de una variable en un grupo, respecto al promedio de la misma variable en el otro grupo. 30