Tradicionalmente, los neutrófilos han sido considerados como células. fagocíticas importantes en la resolución de infecciones agudas.

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1 RESU MEN Tradicionalmente, los neutrófilos han sido considerados como células fagocíticas importantes en la resolución de infecciones agudas. Sin embargo, recientemente se ha acumulado evidencia suficiente que enfatiza el papel de los neutrófilos en el control de patógenos intracelulares responsables de las enfermedades crónicas. Su participación en la tuberculosis aun es un tema controvertido. En el presente trabajo se demostró que dos de los miembros del complejo M. tuberculosis indujeron cambios morfológicos en los neutrófilos infectados in vitro dando lugar a la formación de trampas extracelulares de neutrófilos (NETs). Debido a que las micobacterias se observaron atrapadas en estas estructuras extracelulares de los neutrófilos, posiblemente las NETs pudieran estar involucradas en mantener localizada la infección evitando la diseminación del bacilo a otros órganos, promoviendo la formación del granuloma. 1

2 INTRODUCCIÓN LA TUBERCULOSIS Hace más de 120 años, en 1882, Robert Koch identificó el agente etiológico de la tuberculosis, denominado Mycobacterium tuberculosis (Tufariello et al. 2003; Young. 1998). Actualmente continúa siendo un problema de salud a nivel mundial de enormes dimensiones. Se calcula que una tercera parte de la población mundial, es decir, 2000 millones de personas, están infectadas por M. tuberculosis y 3 millones mueren anualmente a causa de éste. La magnitud del problema se ha incrementado debido a la alta incidencia del Virus de la Inmunodeficiencia Humana (HIV) y al surgimiento de cepas multidrogorresistentes del agente causal. La Organización Mundial de la Salud (OMS) estima que si no se incrementan los esfuerzos para controlar la tuberculosis, para el año 2020 habrá mil millones de casos nuevos, 200 millones de personas manifestarán la enfermedad y 35 millones morirán cada año de tuberculosis (Murray et al. 2003). LEUCOCITOS POLIMORFONUCLEARES (PMN). Los leucocitos polimorfonucleares, comúnmente llamados neutrófilos, constituyen la primera línea de defensa contra microorganismos invasores y median las fases iniciales de la respuesta inflamatoria. Los neutrófilos representan del 40 al 80% de los leucocitos totales en sangre periférica (Ruiz-Argüelles. 1998). Durante un proceso infeccioso, migran desde el torrente sanguíneo hasta el sitio de inflamación. Una vez en el sitio de 2

3 infección, su principal función efectora es destruir los microorganismos fagocitados por medio de enzimas proteolíticas, reactivos intermediarios del oxígeno y óxido nítrico (Henson, et al. 1987). Además, los neutrófilos cuentan con mecanismos microbicidas extracelulares, liberando al medio los gránulos con actividad proteolítica. En principio, esto representa un riesgo de daño al tejido circundante. Sin embargo, recientemente se ha descrito una nueva estrategia de muerte, mediante la cual, el neutrófilo, al ser activado genera fibras extracelulares de DNA, llamadas NETs (de las siglas en inglés Neutrophil Extracelular Traps) que contienen proteínas granulares con actividad microbicida. Estas redes atrapan a los microorganismos y los eliminan de forma localizada, minimizando el daño a tejido (Brinkman, et al. 2004). La importancia de los neutrófilos en la defensa del hospedero contra microorganismos intracelulares que causan infecciones crónicas, como las micobacterias, fue descartada en un principio por dos razones principales: primero, el neutrófilo tiene una vida media muy corta, impidiendo que sea considerado como hábitat intracelular y segundo, los agresivos mecanismos microbicidas del neutrófilo son eficientes, pero a la vez, provocan daño a tejido y licuefacción del granuloma (Kaufman S. 1993; Pedrosa, et al. 2000). No obstante, hay evidencias que apoyan la participación de los neutrófilos en las infecciones micobacterianas. En una cinética de migración de neutrófilos en respuesta a la infección intraperitoneal de ratones BALB/c con M. tuberculosis, Pedrosa y colaboradores demuestran que la migración de los neutrófilos es bifásica, encontrándose un pico máximo a las seis horas post 3

4 infección que corresponde a una respuesta temprana de tipo agudo. Para al tercer día disminuye casi hasta los valores basales, volviendo a aumentar en el día 11, representando el segundo pico. El infiltrado de macrófagos aumenta de manera gradual a partir de las 6 horas post-infección, siendo el tipo celular más abundante en los tiempos tardíos de la infección (Pedrosa, et al. 2000). Estudios en diferentes modelos han tratado de dilucidar la participación de los neutrófilos durante las infecciones por micobacterias (Fulton, et al. 2002, Rojas-Espinosa. 1978), pero todavía no está claro si desempeñan una función directa en la protección al hospedero o en el daño a tejido. Aunado a esto, no se ha estudiado si los neutrófilos responden de manera diferencial a la patogenicidad de la micobacteria o al grado de virulencia de los genotipos de M. tuberculosis. Debido a la naturaleza intracelular de las infecciones micobaterianas, se ha puesto poca atención al posible papel que pueden tener los mecanismos microbicidas extracelulares de los neutrófilos en la tuberculosis. Por lo tanto es importante evaluar los cambios morfológicos inducidos por cepas del MTC con diferente grado de virulencia en los neutrófilos infectados y determinar si las NETs están involucradas en las infecciones por patógenos intracelulares. 4

5 HIPÓTESIS Las cepas del complejo M. tuberculosis inducen cambios morfológicos en los neutròfilos infectados que dan lugar a la formación de NETs. OBJETIVO GENERAL Analizar la capacidad de las micobacterias para inducir la formación de NETs. 5

6 MATERIAL Y MÉTODOS CULTIVO Y COSECHA DE MICOBACTERIAS Las cepas de M. tuberculosis H37Rv y M. canetti se cultivaron en medio Middlebrook-7H9 (BD-DIFCO, USA) enriquecido con 10% de OADC (ácido oleico, albúmina, dextrosa y catalasa) (BD-DIFCO, USA). Los cultivos se incubaron a 37 C, en agitación a 150 rpm, hasta alcanzar una O.D de 0.4. Posterior al tiempo de incubación, los cultivos se centrifugaron a 8000 rpm durante 15 minutos, en una centrifuga refrigerada Beckman J2-MC con un rotor J-10. La masa bacteriana se resuspendió en medio D-MEM (Dulbecco s Modified Eagle Medium, GIBCO ) suplementado con suero fetal bovino al 10% (SFB) y se filtró a través de una pipeta Pasteur con fibra de nylon. Por último, la suspensión homogénea, se almacenó en alícuotas de 500 µl, a -70 C, hasta su uso. Para corroborar el número final de micobacterias en cada suspensión, se descongeló un vial de cada cepa y se realizó una cuenta viable en Agar Middlebrook 7H10 (BD-DIFCO, USA). PURIFICACIÓN DE NEUTRÓFILOS HUMANOS. Los neutrófilos humanos se purificaron a partir de sangre periférica humana heparinizada, obtenida por punción venosa. Se siguió el protocolo descrito previamente por Aga, et al La viabilidad y el número de células/ml, se determinaron por exclusión de azul tripano, la cual fue en promedio del 99%. La pureza fue del 97%, siendo el principal contaminante, otro tipo de células polimorfonucleares como eosinófilos y basófilos. 6

7 PROCESAMIENTO DE MUESTRAS PARA MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA DE BARRIDO Una suspensión de neutrófilos ajustada a 5x10 5 células /ml en medio DMEM adicionado con suero fetal bovino al 2% se depositó sobre cubreobjetos tratados con poly- L-lisina al 0.001%. Las células se infectaron con las diferentes micobacterias a una MOI 1:10 (neutrófilo:bmicobacteria), se activaron con PMA 20nM como control positivo o se dejaron sin estímulo. Se incubaron a 37 C en atmósfera de CO 2 al 5% durante 1h, 2h 3h y 4h. Posterior a cada tiempo de incubación, las muestras se fijaron con glutaraldehido al 2.5% en PBS durante 1h a temperatura ambiente, seguida de una fijación con tetraóxido de osmio 1X y después se deshidrataron gradualmente con alcohol etílico absoluto anhidro al 50, 60, 70, 80, 90 y 100%. Las muestras en alcohol al 100% se transportaron a la Unidad de Microscopía para realizar el secado al punto crítico. Una vez deshidratadas se cubrieron con un baño de oro y se analizaron en el microscopio de electrónico de barrido. TINCIÓN NEGATIVA PARA MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA DE TRANSMISIÓN. La interacción de los neutrófilos con las micobacterias se llevó a cabo en rejillas con membrana de Forward. Se incluyeron neutrófilos sin estímulo y activados con PMA 20nM. Se incubaron a 37 C en atmósfera de CO 2 al 5%, en cámara húmeda, durante 1h, 2h, 3h, y 4h. En cada tiempo, cada una de las rejillas se lavó con regulador Hepes 25mM, y se fijó inmediatamente 7

8 con una gota de glutaraldehido al 2.5% disuelto en el mismo regulador. Posteriormente las muestras se tiñeron con uranilo al 0.2% y se analizaron en un microscopio electrónico de transmisión. TINCIÓN FLUORESCENTE DE DNA Una suspensión de neutrófilos ajustada a 5x10 5 células /ml en medio DMEM adicionado con suero fetal bovino al 2% se depositó sobre cubreobjetos tratados con poly-l-lisina al 0.001%. Las células se infectaron con las diferentes micobacterias (previamente teñidas con Texas-red o no) a una MOI de 10 bacterias por neutrófilo, se activaron con PMA 20nM como control positivo o se dejaron sin estímulo. Se incubaron a 37 C en atmósfera de CO 2 al 5% durante 1h, 2h 3h y 4h. Posterior a cada tiempo de incubación, las muestras se fijaron con para-formaldehido al 4% y después se adicionó Sytox Green (Molecular Probes) o DAPI para marcar DNA. Por último los cubreobjetos se montaron sobre portaobjetos y se observaron en un microscopio de fluorescencia (Brinkman, et al. 2004). INMUNOFLUORESCENCIA Se siguió el mismo procedimiento que en el punto anterior hasta tener las células fijadas en para-formaldehido al 4%. Las muestras se bloquearon toda la noche (10% SFB, 5% gelatina de pescado, 1% albúmina sérica bovina, 0.05% tween 20 en PBS 1X) y se incubaron con el anticuerpo primario (anti-histona y anti-elastasa) los cuales se detectaron con anticuerpos secundarios acoplados a Cy2 o Cy3. 8

9 RESULTADOS M. tuberculosis y M. canettii indujeron cambios morfológicos en los neutrófilos infectados. Con el objetivo de evaluar si dos genotipos de M. tuberculosis con diferente grado de virulencia eran capaces de inducir la formación de NETs en los neutrófilos infectados, el primer paso consistió en observar por microscopía electrónica de barrido y de transmisión si había cambios morfológicos en los neutrófilos infectados. En respuesta a la infección, se observaron grandes aglomerados de células envueltas en un material extracelular atrapando micobacterias (Fig. 1 A, flechas), así como células individuales con cambios en la morfología que habían liberado su contenido intracelular, el cual se observó con micobacterias atrapadas (Fig. 1 B, flechas) o conectando células (Fig. 1 C-D). En la figura 1-E se muestra un acercamiento del material electrodenso liberado por los neutrófilos infectados, en donde se puede apreciar que está formado por fibras muy finas decoradas con gránulos (Fig. 1 F-G). 9

10 A B C D E F G Figura 1. Los genotipos de M. tuberculosis indujeron cambios morfológicos en los neutrófilos infectados. Análisis por SEM (A-D) y TEM (E-F) de neutrófilos humanos infectados M. tuberculosis H37Rv (C-G) o M. canetti no opsonizadas (A y B) a una MOI de 10:1 (micobacteria: neutrófilo) por 2h (A, C-G) y 4h (B). Fotos representativas, ambas micobacterias indujeron el mismo efecto. Ambos genotipos de M. tuberculosis inducen la formación de NETs El contenido citosólico también puede ser liberado como resultado de una muerte por necrosis. Para descartar esta posibilidad, se analizó la composición del material extracelular liberado por los neutrófilos infectados con micobacterias. Dicho material está compuesto por DNA (azul), histonas (rojo) y elastasa (verde) y se encuentra libre de componentes del citoesqueleto como filamentos de actina (verde), confirmando la presencia 10

11 de NETs. Resultados similares se encontraron en los neutrófilos infectados con M. canettii. El tratamiento con DNasa desintegra la estructura de las NETs liberadas por lo neutrófilos infectados con M. tuberculosis. Debido a que el componente principal de la las NETs es DNA, se realizó un experimento adicional tratando estas estructuras con DNasa para verificar que las estructuras formadas por los neutrófilos infectados con M. tuberculosis eran verdaderas NETS. Se observó que tanto los grumos de neutrófilos así como las fibras que se forman después de la infección, son completamente desmanteladas después de 30 min de incubación con DNAsa-1. Las NETs atrapan a los genotipos de M. tuberculosis Para visualizar mejor la interacción de las micobacterias con las NETs, se infectaron neutrófilos con M. tuberculosis marcada previamente con rojo-texas y posteriormente el DNA de los neutrófilos se marcó con SYTOX-Green, un marcador fluorescente de DNA. Los neutrófilos fijados inmediatamente después de la infección con M. tuberculosis presentaron el DNA (verde) confinado al núcleo. La micobacteria libre se pudo observar en rojo. Después de 180 min, ya hay formación de NETS y por lo tanto se observó DNA extracelular y algunos bacilos atrapados en este. Tiempos de incubación más largos dan lugar a mayor formación de NETs y como resultado, más bacilos son capturados en estas redes. 11

12 CONCLUSIONES - Los neutrófilos no respondieron de manera diferencial al grado de virulencia de la micobacteria. - M. tuberculosis y M. canettii indujeron la formación de NETs en donde las micobacterias se observaron atrapadas. 12

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