Int. Cl.: 74 Agente: Carpintero López, Francisco

Transcripción

1 19 OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPAÑA 11 Número de publicación: Int. Cl.: A61K 39/002 (06.01) C12N 1/ (06.01) 12 TRADUCCIÓN DE PATENTE EUROPEA T3 86 Número de solicitud europea: Fecha de presentación : Número de publicación de la solicitud: Fecha de publicación de la solicitud: Título: Vacuna contra Neospora. Prioridad: US Titular/es: BAYER CORPORATION 0 Bayer Road Pittsburgh, Pennsylvania , US 4 Fecha de publicación de la mención BOPI: Inventor/es: Choromanski, Leszek y Brown, Karen, K. 4 Fecha de la publicación del folleto de la patente: Agente: Carpintero López, Francisco ES T3 Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas). Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. Pº de la Castellana, Madrid

2 Vacuna contra Neospora. DESCRIPCIÓN Antecedentes de la invención Campo de la invención La presente invención se refiere a una vacuna para la protección de mamíferos de una enfermedad causada por Neospora caninum. Más específicamente, la invención se refiere a vacunas seguras e inmunogénicamente eficaces para la protección de animales bovinos y caninos contra un aborto causado por Neospora caninum. Breve descripción de la técnica anterior Neospora caninum se presentó por primera vez por Dubey y col (JAVMA, Vol. 192, Nº 9, 1 de mayo de 1988) como una enfermedad de tipo Toxoplasmosis que afecta a los perros. Se descubrió que Neospora caninum era estructuralmente distinta de Toxoplasma gondii y no reaccionaba con antisuero anti-t. gondii en un ensayo de inmunoperoxidasa. Dubey y col describieron las lesiones principales asociadas con el organismo como meningoencefalomielitis y miositis. En los pasados años, la neosporosis ha llegado a reconocerse como una enfermedad reproductora principal en el ganado (Anderson y col., 1994, Food Animal Practice, : ) con casos presentados en América del Norte y del Sur, Europa, África, los países de la vertiente del Pacífico así como en los Estados Unidos. La manifestación clínica principal de la neosporosis bovina es el aborto fetal, con encefalitis necrotizante no supurante focal, miocarditis no supurante, y miositis en el feto (Anderson y col., 1991, Journal of the American Veterinary Medical Association, 198: ). De acuerdo con Anderson y col., 1997 (Journal of the Veterinary Medical Association, 2: ), los estudios retrospectivos del ganado en California indican que la neosporosis ha sido endémica desde al menos 198. Estos autores indican que del 18 al 19% de todos los fetos bovinos abortados presentados al California Veterinary Diagnostic Laboratory System tienen infección por Neospora sp. En una encuesta prospectiva de granjas de lechería seleccionadas en California, la cantidad de abortos atribuidos a infección por Neospora sp fue incluso mayor (42,%). Ho y col (J. Parasitol., 1997, 83(3)) han informado recientemente de la reproducción exitosa del aborto bovino y la infección fetal infectando vacas preñadas con taquizoitos de Neospora caninum. Esta publicación sugiere que puede haber una correlación entre el título serológico medido por ensayo de anticuerpos de fluorescencia indirecta (IFA) y la protección del aborto causado por Neospora caninum en vacas. Las vacas con títulos IFA de 3 y 6 no abortaron después de la infección con taquizoitos de este organismo. Como se ha mencionado previamente, la neosporosis también se ha presentado en cachorros y en perros de 1 años de edad. El porcentaje de perros infectados que muestran signos clínicos es desconocido. En perros, Neospora caninum puede infectar cualquier tejido, aunque se encuentra más habitualmente en el sistema nervioso central y las raíces de los nervios espinales. Las infecciones más graves se observan en cachorros que se infectaron en el útero. Estos cachorros muestran una parálisis ascendente. El aborto puede reproducirse en una infección experimental de perras preñadas durante la fase temprana de gestación. Se han usado sulfonamidas, pirimetamina y clindamicina para tratar la neosporosis en perros. Neospora caninum también puede producir una infección fatal en gatos inoculados experimentalmente. Sin embargo, aún no se ha indicado que la enfermedad suceda de forma natural en gatos. Se ha observado que la neosporosis causa aborto en ovejas y cabras pero a un menor grado que el encontrado en ganado. La infección experimental se induce fácilmente en ovejas y cabras por inyección subcutánea de taquizoitos. 0 6 Aunque la neosporosis, especialmente en el ganado, parece plantear un problema grave creciente y realmente existe una necesidad importante de solucionar este problema protegiendo a los mamíferos usando una vacuna, el documento WO9241 describe vacunas contra Neospora caninum que comprenden un extracto bruto de taquizoitos, bradizoitos y otras fases de Neospora u otros parásitos químicamente fijados. Las vacunas también pueden contener un adyuvante. Sumario de la invención Un objetivo de esta invención es describir una composición de vacuna para la protección de mamíferos de una enfermedad causada por Neospora caninum que comprende taquizoitos de Neospora caninum que ha crecido en cultivo tisular inactivados, como un cultivo completo o una forma de extracto o como antígenos de subunidad protectores obtenidos de los mismos, un adyuvante, y beta-propiolactona (BPL) o etilenimina binaria (BEI) como agente de inactivación. Un procedimiento para producir una vacuna para la protección de mamíferos de una enfermedad causada por Neospora caninum comprende las etapas de: 1) hacer crecer Neospora caninum en un cultivo tisular susceptible hasta que se produzca un CPE; 2) recoger dicha Neospora caninum que ha crecido en cultivo tisular; 3) inactivar dicha Neospora caninum que ha crecido en cultivo tisular con un agente de inactivación que es BPL o BEI; y 4) potenciar con adyuvante la Neospora caninum que ha crecido en cultivo tisular recogida e inactivada para producir una vacuna. Otro procedimiento más para producir una vacuna para la protección de mamíferos de una enfermedad causada por Neospora caninum comprende las etapas de: 1) hacer crecer Neospora caninum en un cultivo tisular susceptible hasta que se produzca un CPE; 2) recoger dicha Neospora caninum que ha crecido en dicho cultivo tisular; 3) extraer 2

3 antígenos protectores de la Neospora caninum que ha crecido en cultivo tisular para producir subunidades; 4) inactivar las subunidades con un agente de inactivación que es BPL o BEI; y ) potenciar con adyuvante las subunidades para producir una vacuna. Está dentro de la alcance de esta invención inactivar la Neospora caninum antes de la extracción de las subunidades de antígeno protector. Descripción detallada de la invención Como se ha expuesto anteriormente, la presente invención se refiere a composiciones de vacuna que comprenden una Neospora caninum potenciada con adyuvante, inactivada, que ha crecido en un cultivo tisular susceptible o subunidades derivadas de Neospora caninum. El procedimiento para producir composiciones de la vacuna anterior comprende hacer crecer Neospora caninum en condiciones artificiales, en cultivo tisular, para el propósito de obtener antígenos del parásito para su uso en vacunas. Puede obtenerse Neospora caninum de cualquier fuente. Se prefiere que una vacuna para animales bovinos contenga una Neospora caninum aislada de un feto bovino abortado. Además, se prefiere que una vacuna pretendida para animales caninos contenga una Neospora caninum aislada de un animal canino. De forma ilustrativa, se recoge el cerebro de un feto infectado, se homogeneiza en un medio de crecimiento tal como Medio Esencial Mínimo (MEM) o en un diluyente tal como solución salina tamponada con fosfato (PBS) suplementado con antibióticos para minimizar el potencial de contaminación. Dicho homogeneizado se centrifuga para retirar la materia particulada grande y se inocula el sobrenadante en diversos cultivos tisulares y se hacen pases en cultivos tisulares, si fuera necesario, hasta que se produzca un efecto citopático en al menos un cultivo tisular. El cultivo tisular es preferiblemente una línea celular en la que el parásito crece a un elevado título de modo que pueda prepararse una Semilla Maestra. Un elevado título significa que los taquizoitos parásitos crecen produciendo un recuento, visualizado en un microcopio, o un título que cuando se coloca de nuevo en cultivo tisular es de al menos 1 x 4 de dosis infecciosa de cultivo tisular 0 /ml (DICT 0 /ml). Preferiblemente, se producen 1 x DICT 0 /ml y más preferiblemente, se producen 1 x 6 DICT 0 /ml. Una Semilla Maestra significa que la Neospora sp que ha crecido en cultivo tisular crece a un elevado título, se preparan alícuotas en volúmenes equivalentes en viales de congelación y se congelan, después de lo cual se ensaya para ver si están libre de contaminantes (bacterias, hongos y virus) y después se usan para preparar Semillas de Trabajo y Semillas de Producción. Las Semillas de Trabajo y las Semillas de Producción significan pases adicionales de la Semilla Maestra en un cultivo tisular susceptible, formación de alícuotas y repetición del ensayo de modo que puedan producirse vacunas a partir de las Semillas de Producción en lugar de usar la Semilla Maestra y se prepara toda la vacuna a partir del mismo material de origen. Un cultivo tisular susceptible significa un cultivo tisular que, cuando se inocula con Neospora sp, es capaz de hacer crecer los taquizoitos parásitos y producir un CPE. Pueden prepararse diferentes tipos de vacunas de acuerdo con esta invención, una vacuna inactivada o una vacuna de subunidad protectora. El procedimiento para la preparación de una vacuna de Neospora caninum inactivada requiere que el organismo crezca a un título mayor y comprende las etapas de hacer crecer Neospora caninum en un cultivo tisular susceptible hasta que se produzca un CPE, recoger dicha Neospora caninum que ha crecido en cultivo tisular, inactivar dicha Neospora caninum que ha crecido en cultivo tisular recogida con un agente de inactivación que es BPL o BEI; y potenciar con adyuvante la Neospora caninum que ha crecido en cultivo tisular recogida e inactivada para producir una vacuna. El procedimiento para la preparación de una vacuna de Neospora caninum de subunidad comprende las etapas de hacer crecer Neospora caninum en un cultivo tisular susceptible hasta que se produzca un CPE, recoger dicha Neospora caninum que ha crecido en cultivo tisular, extraer antígenos protectores de la Neospora caninum que ha crecido en cultivo tisular recogida para producir subunidades de antígeno protector, inactivar las subunidades con un agente de inactivación que es BPL o BEI; y potenciar con adyuvante las subunidades para producir una vacuna. Está dentro del alcance de esta invención inactivar la Neospora caninum antes de la extracción de las subunidades de antígeno protector para preparar la vacuna de subunidad. Los agentes de inactivación pueden seleccionarse entre el grupo constituido por beta-propiolactona (BPL) o etilenimina binaria (BEI). 6 Los adyuvantes usados para aumentar la inmunogenicidad de las vacunas de Neospora de esta invención pueden seleccionarse entre el grupo constituido por polímeros tales como Carbopol, HAVLOGEN y POLYGEN, emulsiones de aceite en agua tales como EMULSIGEN y EMULSIGEN PLUS, emulsiones de agua en aceite en agua, hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, sulfato de aluminio, inmunomoduladores tales como BAYPAMUN, adyuvantes basados en lípidos tales como Bay R-0 y liposomas y combinaciones de los mismos. Las vacunas de Neospora inactivada de esta invención pueden incluir estabilizadores que se añaden antes o después de potenciar con adyuvante para mantener el contenido de antígeno durante periodos largos de tiempo y en condiciones adversas de altas o bajas temperaturas. Los estabilizadores se seleccionan entre el grupo constituido por inhibidores de proteasa, azúcares tales como sacarosa y glicerol, polímeros de encapsulación, agentes quelantes tales como ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), proteínas y polipéptidos tales como gelatina y poliglicina y combinaciones de los mismos. 3

4 Los siguientes ejemplos representan composiciones de vacunas de Neospora caninum y describen sus procedimientos de producción incluyendo el crecimiento de taquizoitos de este organismo en diversas líneas celulares tales como una línea celular Dérmica Equina (ATCC Nº CCL-7), una línea celular Vero y una línea celular de riñón de Mono Verde Africano (BIOWHITTAKER Nº 7-4) que se clonó en Bayer Corporation para producir una línea celular denominada MA 4 Clone B, y también describen su uso en la vacunación de animales bovinos para producir títulos de anticuerpos protectores de fluorescencia indirecta (IFA). La invención se ilustra adicionalmente pero no se pretende que esté limitada por los siguientes ejemplos en los que todas las partes y porcentajes son en peso salvo que se especifique de otro modo. Ejemplos Ejemplo Para determinar si las vacunas de Neospora caninum pueden producir protección contra el aborto en vacas preñadas en un modelo conocido en la técnica (Ho y col., 1997), se produjeron vacunas de Neospora caninum haciendo crecer Neospora caninum en un línea celular Vero en frascos rotatorios de 80 cm 2. Se retiró un vial de Células de Trabajo de la línea celular Vero del almacenamiento en nitrógeno líquido, se descongeló rápidamente, se diluyó y se colocó en frascos rotatorios de 80 cm 2 que contenían ml de DMEM (elevado nivel de glucosa), a partir de ahora denominado DMEMH, a un índice de 4 x 7 células por frasco rotatorio. El medio estaba suplementado con Sulfato de Neomicina a 1 ml/l y Suero de Caballo al % v/v. Las células se incubaron de 36 a 38ºC durante a 7 días hasta que las células estuvieron a una confluencia entre el 9 y el 0%. Las Células de Trabajo se retiraron de los frascos rotatorios aclarando la lámina de células con Solución Salina Tamponada con Fosfato (PBS) y después añadiendo ml de una solución salina disódica de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) con Tripsina (2, g/l de Tripsina + 1 g/l de EDTA) a cada frasco rotatorio, agitando los frascos suavemente durante al menos minutos hasta que las células se separaron de la superficie y después aclarando la superficie del frasco con DMEMH y combinando los contenidos de todos los frascos. Se volvieron a inocular las células de estos frascos (Células de Producción) en nuevos frascos rotatorios de 80 cm 2 a 4, x 7 células por frasco rotatorio. Las Células de Producción se incubaron durante 24 horas de 36 a 38ºC después de lo cual se infectaron con taquizoitos de Neospora caninum de un pase reciente de la Cepa BPA-1 (3 x 8 a 4, x 8 /frasco rotatorio de 80 cm 2 ). En el momento de la infección, las células de producción tenían una confluencia de al menos el 0%. Se incubaron los frascos rotatorios infectados de 36 a 38ºC durante 1 a 168 horas en bandejas de frascos rotatorios ajustadas a entre 0,2 y 0,4 rpm. En ese momento, la lámina de células presentaba un CPE típico que afectaba al menos al 80% de la lámina de células. Al final del periodo de incubación se recogieron los fluidos de Neospora combinando los contenidos de todos los frascos rotatorios en un recipiente estéril y se retiró una muestra para la titulación de Neospora viva. Los fluidos recogidos aceptables deben tener un título de al menos 3 x /ml. El título recogido para el presente lote fue 3 x /ml. Los fluidos recogidos se congelaron y se descongelaron dos veces manteniendo los fluidos recogidos a -70ºC y descongelándolos rápidamente a temperaturas no mayores de 37ºC. Después de este tratamiento se inactivaron los fluidos recogidos durante un periodo de 48 horas a 4ºC con Etilenimina Binaria (BEI) 0,2 M. Después de la inactivación, se neutralizó la BEI con tiosulfato sódico 3,16 M. Los fluidos recogidos inactivados se concentraron por centrifugación a 0 rpm durante 1 minutos y se resuspendió el sedimento en PBS a una concentración de 3,0 x 7 en base a un recuento en microscopio. Se potenciaron con adyuvante alícuotas de estos fluidos recogidos inactivados y concentrados con dos diferentes tipos de adyuvantes para preparar dos formulaciones de vacuna diferentes. Una mitad de los fluidos recogidos inactivados y concentrados se potenció con HAVLOGEN al % (v/v) mientras que el resto del fluido recogido inactivado y concentrado se potenció con EMULSIGEN al 1% (v/v). HAVLOGEN es un adyuvante basado en polímero que contiene Carbopol mientras que EMULSIGEN es un adyuvante basado en emulsiones de aceite en agua. Se usaron las dos formulaciones de vacuna para vacunar vaquillas que varían en edad de dos a dos años y medio Todas las vaquillas se reprodujeron y cuando se confirmó que estaban preñadas a los ± días, se dividieron estos animales en cuatro grupos que se trataron del siguiente modo: Se inyectó a las vaquillas del Grupo 1 (Nº 21,, 39 y ) por vía subcutánea dos veces a intervalos de 4 semanas con una vacuna de Neospora que contenía adyuvante HAVLOGEN al %. Se inyectó a las vaquillas del Grupo 2 (Nº 18, 37, y 431) por vía subcutánea dos veces a intervalos de 4 semanas con una vacuna de Neospora que contenía EMULSIGEN al 1%. Las vaquillas del Grupo 3 (Nº 429, 2, 28 y 2) sirvieron como controles y se les inyectó por vía subcutánea dos veces a intervalos de 4 semanas con una preparación de control que contenía solamente cultivos de células Vero no infectadas que contenían EMULSIGEN al 1%. Las vaquillas del Grupo 4 (Nº 19,, 4 y 14) sirvieron como controles de contacto y ni se vacunaron ni se expusieron. Se tomaron muestras de suero de todas las vaquillas al menos una semana antes de la vacunación (P.V.), en el día de la primera vacunación (día 0) y en las semanas, 6 y 7 después de la vacunación, en el día del refuerzo (refuerzo), el día de la exposición (entre la semana 11 y 12), y semanalmente después de ello hasta la semana 16 después de la 4

5 vacunación. Todas las vaquillas comenzaron el estudio como seronegativas. En la Tabla 1 se enumeran solamente los títulos medidos en el día de la exposición ya que éstos son los títulos mayores para este estudio. 1 2 Las vaquillas de los Grupos 1-3 se expusieron a 8 x 7 taquizoitos de Neospora caninum virulentos de la cepa BPA-1 que han crecido en células Vero. La exposición sucedió a los 8 ± días de gestación. Se retiraron los fetos por cesárea de las vaquillas a los ± 6 días (114 a 1 días) de gestación y se evaluaron por examen global. La presencia de fetos muertos se interpretó como indicativo de que la vacuna no protegía a los fetos y habría provocado el aborto de los fetos. La presencia de fetos vivos se interpretó como demostrativo de protección de los fetos y que no habría sucedido aborto. La Tabla 1 muestra los resultados de la evaluación fetal y enumera los títulos serológicos de las vaquillas en el día de la exposición. Los resultados mostrados en esta tabla indican que las vaquillas del Grupo 1 contenían dos fetos vivos y dos fetos muertos lo que sugiere que la vacuna de Neospora potenciada con adyuvante HAVLOGEN produjo una protección del 0% del aborto. Debe observarse que las dos vaquillas protegidas tenían títulos en la exposición de 3 y 6 respectivamente. Las vaquillas del Grupo 2 vacunadas con vacuna de Neospora potenciada con adyuvante EMULSIGEN contenían un feto vivo de una vaquilla con un título serológico de 3. Las vaquillas restantes de este grupo de vacuna tuvieron fetos muertos y títulos menores de 3 en la exposición. Las dos primeras vaquillas del Grupo 3 (Grupo de Control que recibió células Vero potenciadas con adyuvante sin Neospora) tuvieron fetos muertos y títulos <80. Las dos vaquillas restantes de este grupo se expusieron en un momento posterior que todas las demás vaquillas y se propone que no recibieron una dosis de exposición suficientemente alta y, por lo tanto, tuvieron fetos vivos. Sus títulos fueron <80 en el día de la exposición y en un examen histológico posterior se demostró que estas vaquillas no estaban infectadas. Las vaquillas del Grupo 4 no desarrollaron títulos de anticuerpos durante el estudio lo que indica que los otros grupos no desprendieron organismos Neospora. Este último grupo no se expuso ya que sólo sirvió como controles de contacto. Este experimento apoya la interpretación de los datos de Ho y col que propusieron que un título IFA de 3 podría ser indicativo de protección de aborto fetal. (Tabla pasa a página siguiente)

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7 Ejemplo Este experimento se realizó para determinar si un organismo de Neospora caninum podría crecer en otra línea celular de cultivo tisular, inactivarse y formularse para preparar una vacuna que podría producir títulos de anticuerpos en ganado que serían similares a los observados en el Ejemplo 1 con vacunas de Neospora producidas en una línea celular Vero. Se diluyó una Línea Celular Dérmica Equina, Pase de la Célula Maestra 11, derivada de la ATCC Nº CCL-7 a un recuento celular de 2 x 7 células por frasco rotatorio en un Medio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) que contenía Suero de Caballo al % y se inoculó en frascos rotatorios de 80 cm 2 a un volumen de ml por frasco rotatorio. Se cultivaron las células hasta confluencia después de lo cual se infectaron con 2,4 x 7 taquizoitos de Neospora caninum en 14,1 ml de DMEM. Cada frasco rotatorio contenía 264 ml de DMEM más Suero de Caballo al %. Los cultivos titulares infectados con neospora se incubaron a 37ºC hasta que al menos el 0% de las células demostraron un CPE (aproximadamente 7 a 9 días). Se recogieron los fluidos y se centrifugaron los taquizoitos durante minutos a 0 rpm para concentrar el antígeno recogido. El antígeno de Neospora caninum concentrado y sedimentado se resuspendió en 0 ml de sobrenadante de DMEM decantado de los taquizoitos centrifugados. Esta preparación concentrada que contenía 8 x 6 taquizoitos por ml se congeló durante 16 horas a -70ºC y después se descongeló a temperatura ambiente. Después se inactivo la preparación usando etilenimina binaria (BEI) 0,0 M incubada a 4ºC durante 48 horas. La preparación inactivada se neutralizó usando tiosulfato sódico 3,16 M. Después se potenciaron dos alícuotas iguales de la preparación de antígeno de Neospora caninum neutralizado, inactivado, con diferentes adyuvantes como en el Ejemplo 1. Una mitad de la preparación se potenció con HAVLOGEN, un adyuvante polimérico basado en Carbopol, añadiendo adyuvante a una concentración del % (v/v). La otra mitad de la preparación se potenció con EMULSIGEN, un adyuvante basado en aceite, añadiendo adyuvante a una concentración del 1% (v/v). Las vacunas de Neospora caninum potenciadas con adyuvante producidas en Células Dérmicas Equinas se inyectaron por vía subcutánea en terneros que variaban en edad de 9 a 12 meses. Un ternero (Nº 94) recibió una dosis de,0 ml de la vacuna potenciada con adyuvante HAVLOGEN mientras que un segundo ternero (Nº 9) recibió una dosis de,0 ml de vacuna potenciada con adyuvante EMULSIGEN. Cada ternero se reforzó con la vacuna homóloga días después. Se extrajo sangre de los terneros en cada vacunación y días después de la vacunación de refuerzo. Se analizó el suero para determinar el título usando un ensayo de anticuerpos de fluorescencia indirecta (IFA). Los títulos serológicos de estos terneros se muestran en la Tabla 2. Estos resultados indican que la vacuna de Neospora potenciada con adyuvante EMULSIGEN producía títulos protectores mientras que la vacuna de Neospora potenciada con adyuvante HAVLOGEN producía un título inferior que era cercano a protector. TABLA 2 Títulos de Anticuerpos de Terneros Vacunados con vacunas de Neospora caninum potenciadas con adyuvante inactivadas que han crecido en Células Dérmicas Equinas Ejemplo 3 Después de observar a partir de los Ejemplos 1 y 2 que una vacuna de Neospora caninum producida en una línea celular continua podría producir títulos de anticuerpos protectores en el ganado que se correlacionan con la protección frente al aborto, el objeto de este experimento fue evaluar el efecto del crecimiento de la Neospora caninum en una línea celular clonada diferente derivada de Riñones de Mono Verde Africano (MA-4 Clone B) y evaluar los efectos de varios tipos diferentes de adyuvantes sobre la producción de títulos de anticuerpos en el ganado. Se produjo una vacuna de Neospora caninum del siguiente modo. Se retiró un vial de Células de Trabajo (suero de caballo MA-4 Clone B) del almacenamiento en nitrógeno líquido, se descongeló rápidamente, se diluyó y se colocó en frascos rotatorios de 80 cm 2 que contenían ml de DMEM (elevado nivel de glucosa), a partir de ahora denominado DMEMH, a una concentración de 4 x 7 células por frasco rotatorio. El medio estaba suplementado con Sulfato de Neomicina a 1 ml/l y Suero de Caballo al % v/v. Las células se incubaron de 36 a 38ºC durante a 7 días hasta que las células estuvieron a una confluencia entre el 9 y el 0%. Las Células de Trabajo se retiraron de los frascos rotatorios aclarando la lámina de células con Solución Salina Tamponada con Fosfato (PBS) y después añadiendo ml de una solución de EDTA con Tripsina (2, g/l de Tripsina + 1 g/l de EDTA) a cada frasco rotatorio, agitando los frascos suavemente durante al menos minutos hasta que las células se separaron de la superficie y después aclarando la superficie del frasco con DMEMH y combinando los contenidos de todos los frascos. Se 7

8 1 volvieron a inocular las células de estos frascos (Células de Producción) en nuevos frascos rotatorios de 80 cm 2 a 4, x 7 células por frasco rotatorio. Las Células de Producción se incubaron durante 24 horas de 36 a 38ºC después de lo cual se infectaron con taquizoitos de Neospora caninum de un pase reciente (1,2 x 78 /frasco rotatorio de 80 cm 2 ). En el momento de la infección, las células de producción estaban a una confluencia de al menos el 0%. Se incubaron los frascos rotatorios infectados a 36-38ºC durante 1 a 168 horas en bandejas de frascos rotatorios ajustadas a entre 0,2 y 0,4 rpm. En ese momento, la lámina de células presentaba un CPE típico que afectaba al menos al 0% de la lámina de células. Al final del periodo de incubación se recogieron los fluidos de Neospora combinando los contenidos de todos los frascos rotatorios en un recipiente estéril del que se retiró una muestra para la titulación de taquizoitos de Neospora vivos. Los fluidos recogidos aceptables deben tener un título de al menos 3 x /ml. El título recogido para el presente lote fue 3 x /ml. En este caso los fluidos recogidos se concentraron por centrifugación para obtener 2,4 x 7 taquizoitos/ml. Otros procedimientos de concentración incluyen, aunque sin limitación, ultrafiltración y cromatografía en columna. Los fluidos recogidos se inactivaron por adición de etilenimina binaria (BEI) 0,2 M hasta una concentración final de 0,01 M e incubación de 2 a 7ºC durante al menos 96 horas. Después de esta incubación, se neutralizó la BEI por adición de tiosulfato sódico 3,16 M. Después de la inactivación y la neutralización, los fluidos se dividieron en cuatro alícuotas. Cada alícuota se potenció con un adyuvante diferente del siguiente modo: Fórmula A: 1,0 ml de fluidos recogidos inactivados más 3, ml de PBS más 0, ml de un adyuvante polimérico basado en Carbopol denominado HAVLOGEN. Fórmula B: 1,0 ml de fluidos recogidos inactivados más 3,2 ml de PBS más 0,7 ml de un adyuvante basado en polímero denominado POLYGEN. 2 Fórmula C: 1,0 ml de fluidos recogidos inactivados más 0, ml de HAVLOGEN más 3, ml de un adyuvante basado en lípidos denominado Bay R-0. Fórmula D: 1,0 ml de fluidos recogidos inactivados más 0, ml de PBS más 3, ml de MONTANIDE Se separaron aleatoriamente en seis grupos dieciocho vaquillas con una edad de 1, a 2,0 años. Las vaquillas del Grupo 1 (Nº U148, S8 y A84) no recibieron vacuna de Neospora caninum. Sirvieron como controles de contacto y recibieron células MA4 Clone B no infectadas. Las vaquillas del Grupo 2 (Nº A29, 13 y Z) sirvieron como controles positivos y recibieron taquizoitos de Neospora vivos (3 x 7 por vía intravenosa y 8 x 7 por vía intramuscular). Las vaquillas del Grupo 3 (Nº, 181 y A71) se vacunaron con tres dosis de,0 ml de Fórmula A, administradas por vía subcutánea a intervalos de 4 semanas. Las vaquilla del Grupo 4 (Nº 273, Y21, y U93) se vacunaron con tres dosis de,0 ml de Fórmula B, administradas por vía subcutánea a intervalos de 4 semanas. Las vaquillas del Grupo (Nº Y6, X7, y 800) se vacunaron con tres dosis de,0 ml de Fórmula C, administradas por vía subcutánea a intervalos de 4 semanas. Las vaquillas del Grupo 6 (Nº A144, S74 y 212) se vacunaron con tres dosis de,0 ml de Fórmula D administradas por vía subcutánea a intervalos de 4 semanas. Se extrajo sangre de todos los animales en el día 0 y después de ello cada dos semanas. Las muestras de suero se analizaron para la conversión en títulos específicos de Neospora por el uso de un ensayo de anticuerpos de fluorescencia indirecta (IFA). La Tabla 3 muestra los resultados serológicos. Todas las preparaciones de vacuna produjeron niveles de títulos protectores (>3) en las vaquillas. Sin embargo, los adyuvantes basados en polímero parecieron producir una mejor respuesta de título que las formulaciones de adyuvante basado en aceite. Como el ganado de control de contacto permaneció serológicamente negativo (dentro de la variación del ensayo) mientras duró el experimento, queda claro que los títulos producidos en los animales vacunados no se produjeron por desprendimiento desde las vaquillas inyectadas con taquizoitos vivos de Neospora sino que fueron un resultado de la vacunación. (Tabla pasa a página siguiente) 6 8

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11 Ejemplo Este experimento se realizó para determinar el impacto de la cantidad de antígeno de Neospora caninum en las vacunas, y para evaluar una vacuna de Neospora caninum que comprende antígenos de subunidad. También se incorpora en este procedimiento de producción de vacunas el uso de una técnica de muerte suave que se define como un procedimiento de inactivación que utiliza cantidades reducidas de agentes de inactivación y temperaturas más bajas de incubación y tiempos de inactivación más cortos. Para este experimento, la Neospora caninum se hizo crecer y se procesó de un modo similar al descrito en el Ejemplo 3. El procedimiento de inactivación se modificó del siguiente modo. Se añadió etilenimina binaria a la Neospora caninum recogida a una concentración final de 0,01 M pero se incubó a temperatura ambiente durante solamente 24 horas después de lo cual se neutralizó por adición de tiosulfato sódico a una concentración final de 0,01 M. Las subunidades se obtuvieron retirando alícuotas de los fluidos de taquizoitos inactivados, centrifugándolos a 0 rpm durante 1 minutos y retirando por decantado los fluidos sobrenadantes. Los sedimentos de taquizoitos de Neospora se resuspendieron en Solución Salina Tamponada con Fosfato de Dulbecco (DPBS) para producir un vacuna de subunidad que contenía solamente los antígenos de taquizoitos y no los exoantígenos que se excretan por los taquizoitos en el medio. Se preparó una segunda vacuna de Neospora resuspendiendo el sedimento de taquizoitos de Neospora en los fluidos sobrenadantes que se habían retirado y guardado. Se formularon tres lotes de subunidades de Neospora caninum resuspendidas en DPBS para que contuvieran 1,2 x 7, 2,4 x 7 y 3,6 x 7 taquizoitos por dosis, respectivamente. Se formularon tres lotes de Neospora caninum resuspendida en sobrenadante para que contuvieran cantidades equivalentes de taquizoitos (1,2 x 7, 2,4 x 7 y 3,6 x 7 ) por dosis. Todas las formulaciones se potenciaron con adyuvante HAVLOGEN y se llevaron a una concentración final de,0 ml/dosis por adición de DPBS (a la vacuna de subunidad) o el fluido sobrenadante respectivamente. Se administraron estas formulaciones a vaquillas seronegativas a Neospora entre las edades de 7 y 9 meses de edad. Seis grupos de vacunas estaban formados por cinco vaquillas cada uno (n=) y dos grupos de control estaban formados por tres vaquillas cada uno (n=3). Las vaquillas de los grupos de vacuna experimental se inyectaron cada una por vía subcutánea (SC) con,0 ml de una de las preparaciones de vacuna de taquizoitos de Neospora y se revacunaron cuatro semanas después. Los grupos de vacuna recibieron las siguientes vacunas: Grupo 1 Vacuna de Neospora de subunidad que contenía 1,2 x 7 taquizoitos de Neospora con HAVLOGEN al %. Grupo 2 Vacuna de Neospora de subunidad que contenía 2,4 x 7 taquizoitos de Neospora con HAVLOGEN al %. 3 4 Grupo 3 Vacuna de Neospora de subunidad que contenía 3,6 x 7 taquizoitos de Neospora con HAVLOGEN al %. Grupo 4 Vacuna de Neospora que contenía 1,2 x 7 taquizoitos de Neospora con HAVLOGEN al % y diluyente sobrenadante. Grupo Vacuna de Neospora que contenía 2,4 x 7 taquizoitos de Neospora con HAVLOGEN al % y diluyente sobrenadante. Grupo 6 Vacuna de Neospora que contenía 3,6 x 7 taquizoitos de Neospora con HAVLOGEN al % y diluyente sobrenadante. Grupo 7 Controles de Contacto - Estas vaquillas no recibieron vacuna. 0 6 Grupo 8 Controles Positivos - Estas vaquillas recibieron una exposición que contenía x 6 taquizoitos de Neospora vivos administrados por vía intravenosa en un dosis de,0 ml y 3 x 6 taquizoitos de Neospora vivos administrados por vía intramuscular en una dosis de,0 ml. Todas las vaquillas se alojaron en la misma parcela, se les extrajo sangre semanalmente durante 7 semanas y se ensayaron todas las muestras de suero para el título de anticuerpos específico para Neospora caninum usando IFA. Además, las vacunas se evaluaron para la reactividad local observando los sitios de vacunación. Se midió cualquier reacción local y se registró en centímetros. Las respuestas de título serológico de las vaquillas se muestran en la Tabla 4. Los resultados enumerados en la Tabla 4 indican que las vacunas que contenían los fluidos sobrenadantes añadidos de nuevo al sedimento de Neospora producen una respuesta de anticuerpos ligeramente mayor que las vacunas de subunidad de Neospora. Las respuestas de anticuerpos producidas por vacunas de Neospora caninum que contenían el sobrenadante añadido de nuevo también produjeron respuestas de anticuerpos que parecen estar algo relacionadas con la dosis. Sin embargo, todas las vacunas fueron eficaces en la producción de niveles protectores de anticuerpos en el ganado. Ninguna de las vacunas produjo reacciones locales significativas después de la vacunación. Por lo tanto, todas las formulaciones podrían considerarse candidatas de vacunas comerciales aceptables. 11

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14 REIVINDICACIONES Una vacuna contra Neospora caninum que comprende una Neospora caninum que ha crecido en cultivo tisular inactivada o sus subunidades protectoras, un adyuvante, y como agente de inactivación beta-propiolactona (BPL) o etilenimina binaria (BEI). 2. La vacuna contra Neospora caninum de acuerdo con la reivindicación 1 en la que la inactivación se realiza por congelación/descongelación, seguido por la adición del agente de inactivación etilenimina binaria (BEI). 3. La vacuna contra Neospora caninum de acuerdo con las reivindicaciones 1 y 2 en la que la Neospora que ha crecido en cultivo tisular comprende un antígeno seleccionado entre el grupo constituido por un cultivo tisular inactivado de taquizoitos de Neospora, un extracto inactivado de taquizoitos de Neospora, y una o más subunidades protectoras obtenidas de taquizoitos de Neospora inactivados. 4. La vacuna contra Neospora caninum de acuerdo con las reivindicaciones 1 y 2 en la que el adyuvante se selecciona entre el grupo constituido por polímeros, emulsiones de aceite en agua, emulsiones de agua en aceite, lípidos, hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, sulfato de aluminio, inmunomoduladores y combinaciones de los mismos.. La vacuna contra Neospora caninum de acuerdo con la reivindicación 4 en la que el adyuvante polimérico se selecciona entre el grupo constituido por Carbopol, HAVLOGEN y POLYGEN. 6. La vacuna contra Neospora caninum de acuerdo con la reivindicación 4 en la que el adyuvante de aceite en agua se selecciona entre el grupo constituido por EMULSIGEN y EMULSIEN PLUS. 7. Un procedimiento para producir una vacuna de Neospora de acuerdo con la reivindicación 1 que comprende las etapas de: a. hacer crecer Neospora caninum en un cultivo tisular susceptible hasta que se produzca un efecto citopático; b. recoger dicha Neospora caninum que ha crecido en cultivo tisular; c. inactivar dicha Neospora caninum que ha crecido en cultivo tisular recogida con un agente de inactivación que es beta-propiolactona (BPL) o etilenimina binaria (BEI) y d. potenciar con adyuvante la Neospora caninum que ha crecido en cultivo tisular recogida e inactivada para producir una vacuna. 8. Un procedimiento para producir una vacuna de subunidad de Neospora de acuerdo con la reivindicación 1 que comprende las etapas de: a. hacer crecer Neospora caninum en un cultivo tisular susceptible hasta que se produzca un efecto citopático; 4 0 b. recoger dicha Neospora caninum que ha crecido en cultivo tisular; c. extraer uno o más antígenos protectores de la Neospora caninum que ha crecido en cultivo tisular recogida para producir una subunidad protectora; d. inactivar la subunidad o subunidades protectoras con un agente de inactivación que es beta-propiolactona (BPL) o etilenimina binaria (BEI) y e. potenciar con adyuvante la subunidad o subunidades protectoras para producir una vacuna. 9. Un procedimiento para producir una vacuna de subunidad de Neospora de acuerdo con la reivindicación 1 que comprende las etapas de: a. hacer crecer Neospora caninum en un cultivo tisular susceptible hasta que se produzca un efecto citopático; 6 b. recoger dicha Neospora caninum que ha crecido en cultivo tisular; c. inactivar la Neospora caninum recogida con un agente de inactivación que es beta-propiolactona (BPL) o etilenimina binaria (BEI); d. extraer uno o más antígenos protectores de la Neospora caninum que ha crecido en cultivo tisular inactivada y recogida para producir una subunidad o subunidades protectoras; y e. potenciar con adyuvante la subunidad o subunidades protectoras para producir una vacuna. 14