INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

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1 INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS Sección de Estudios de Posgrado e Investigación DEPARTAMENTO DE INMUNOLOGÍA Caracterización del efecto biológico de la infección con Salmonella sobre el linfocito B. T E S I S QUE PARA OBTENER EL GRADO DE DOCTOR EN CIENCIAS EN INMUNOLOGÍA PRESENTA ÁNGEL DENISSE CASTRO EGUILUZ DIRECTORES DE TESIS: DR. VIANNEY F. ORTIZ NAVARRETE DR. SERGIO ESTRADA PARRA MÉXICO, D. F. 2009

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3 El presente trabajo se realizó gracias al apoyo de CONACYT, con el número de registro de becario

4 Gracias Dios por el amor eterno con que me has amado y por traerme a este camino donde he podido descubrir cuán grandes son tus pensamientos. Porque al hombre que le agrada, Dios le da sabiduría, ciencia y gozo. Eclesiastés.

5 Gracias mamá y papa y por su amor incondicional, por su cuidado, por darme la oportunidad de cumplir mis anhelos, y por enseñarme la excelencia de la sabiduría que proviene de lo alto. Gracias hermana porque eres la mejor amiga que Dios me ha dado, gracias por tu constante cariño. Gracias Oscar por amarme con un amor perfecto. No existen palabras que expresen el significado que has aportado a mi vida. Te amo.

6 A mi esposo que adoro con todo mi corazón

7 Índice General. Índice de figuras....iii Lista de abreviaturas......iv Resumen Abstract...2 Antecedentes...3 Infección con Salmonella...3 Respuesta inmune frente a Salmonella....3 Inmundad innata..3 Presentación de antígeno.4 Localización intracelular de Salmonella.5 Infección de linfocitos B por Salmonella 7 Justificación...9 Objetivos...10 Objetivo General...10 Objetivos específicos Material y Métodos...11 Líneas celulares...11 Cepas de Salmonella Hibridomas...11 Anticuerpos Caracterización de la VCS en linfocitos B Infección de linfocitos B Extracción de vesículas...13 Tinción de vesículas...13 Análisis de vesículas...14 Unidades formadoras de colonias Caracterización de las poblaciones de precursores de linfocitos B de médula ósea de ratones infectados con Salmonella typhimurium..14 Infección de ratones i

8 Tinción de células provenientes de médula ósea...14 Purificación de precursores de linfocitos B de médula ósea.15 Unidades formadoras de colonias Caracterización de los efectos de la infección con Salmonella sobre la diferenciación de los linfocitos B a células plasmáticas...15 Purificación de linfocitos B...15 Infección de células...16 Activación de células Tinción de células Análisis de las células Identificación de la capacidad de los linfocitos B infectados con Salmonella para presentar antígeno en moléculas de MHC-I...17 Purificación de linfocitos B infectados con Salmonella typhimurium.17 Obtención de linfocitos T citotóxicos Ensayo de presentación a linfocitos T citotóxicos Tinción de células Análisis de las células Resultados En linfocitos B no hay un control de la infección con Salmonella y la VCS no se remodela Los precursores de linfocitos B de médula ósea se encuentran infectados con Salmonella typhimurium Los linfocitos B infectados con Salmonella son capaces de diferenciarse hacia células plasmáticas Los linfocitos B infectados con Salmonella no inducen una respuesta citotóxica por parte de los linfocitos T CD8..28 Discusión...30 Conclusión...35 Bibliografía...36 ii

9 Índice de figuras. Figura 1. Expresión de marcadores en la vacuola que contiene Salmonella. 6 Figura 2. Salmonella infecta linfocitos B...7 Figura 3. Las células B no controlan la infección con Salmonella.. 19 Figura 4. En células B Salmonella se encuentra en un compartimiento lisosomal tardio...20 Figura 5. Identificación de precursores de células B Figura 6. Los precursores de linfocitos B se infectan con Salmonella 23 Figura 7. El porcentaje de células Pro B disminuye en ratones infectados con Salmonella...24 Figura 8. Las células Pro B y B näive se infectan con Salmonella Figura 9. Las células plasmáticas se encuentran infectadas con Salmonella...26 Figura 10. Los linfocitos B infectados con Salmonella se diferencian a células plasmáticas..27 Figura 11. Los linfocitos B infectados con Salmonella no inducen una respuesta por linfocitos T CD iii

10 Lista de Abreviaturas. Arf6 Factor 6 de ribosilación dependiente de ADP APC Células presentadoras de antígeno profesionales BFA-A Brefeldina A BSA Albúmina sérica bovina DMEM Medio Esencial Mínimo, modificado por Dulbecco DO 600 FACS GFP IFN-! IL IP LB LPS MFI MHC-I MHC-II MOI OVA PAMPs PBS PMA PRRs RE rpm SFB SS TAP TLR 4 Receptor tipo Toll 4 Densidad óptica a 600 nm Separación celular activada por fluorescencia Proteína verde fluorescente Interferón-gamma Interleucina Intraperitoneal Luria Bertani Lipopolisacárido Media de intensidad de fluorescencia Complejo principal de histocompatibilidad clase I Complejo principal de histocompatibilidad clase II Multiplicidad de infección Ovoalbúmina Patrones moleculares asociados a patógenos Solución reguladora de fosfatos Forbol 12-miristato 15-acetato Receptores de reconocimiento a PAMPs Retículo endoplásmico Revoluciones por minuto Suero fetal bovino Salmonella-Shigella Transportador asociado con procesamiento de antígeno iv

11 UbC UFC VNS VCS VO Ubiquitina C Unidades formadoras de colonias Vacuola que no contiene Salmonella Vacuola que contiene Salmonella Vía Oral v

12 Resumen. Durante la infección con Salmonella se ha observado que los linfocitos B no utilizan la vía alterna de procesamiento de antígenos exógenos por moléculas de MHC-I, a pesar de que son capaces de infectarse. Por lo tanto, en linfocitos B caracterizamos la vacuola que contiene a Salmonella (VCS) y encontramos una desregulación de moléculas de MHC-I y de Arf6 a las 3 h post-infección. A tiempos tardíos la VCS presenta características lisosomales, con una mayor expresión de moléculas de MHC-II. Por lo tanto en linfocitos B no hay una remodelación de la VCS, como ocurre en los macrófagos. Reportamos previamente en ratón, que los linfocitos B de bazo y médula ósea son un reservorio para la bacteria durante la infección con Salmonella. Investigamos el efecto de la infección en los precursores de linfocitos B en médula ósea y encontramos que los linfocitos B y sus precursores son blancos de infección, lo cual altera su maduración. Siendo los linfocitos B un blanco de Salmonella, es posible que ésta interfiera con la función biológica de las células B; por un lado en su capacidad de convertirse en células productoras de anticuerpos, o bien por otro lado, en su capacidad de inducir una respuesta por parte de los linfocitos T citotóxicos. Con respecto a la primera, investigamos si la infección afecta la diferenciación de los linfocitos B hacia células plasmáticas, sorprendentemente encontramos que los linfocitos B conservan esta capacidad de convertirse en células plasmáticas productoras de anticuerpo. Sin embargo, no pueden inducir una respuesta citotóxica por parte de los linfocitos T. La evidencia presentada en este trabajo nos lleva a concluir que los linfocitos B de médula ósea son un nicho de sobrevivencia para Salmonella, y la función biológica de éstos no se incapacita por la infección. 1

13 Abstract. During Salmonella infection, we have previously observed that B lymphocytes are unable to use the alternative processing pathway to present exogenous antigens on MHC-I molecules, even though they become infected. To understand this observation, we characterized the Salmonella Containing Vacuole (SCV), and found that in B cells, at 3 h post-infection there is a downregulation of MHC-I molecules and Arf6, and at later time points, the SCV presents lysosomal characteristics with a higher expression of MHC-II molecules. These data suggests that B lymphocytes do not remodel the SCV, as macrophages do. We previously reported that, in mice, spleen and bone marrow derived B cells are a reservoir for bacteria during Salmonella infection. So, we investigated the effect of Salmonella infection on B cell precursors. Here we show that, within the bone marrow, B cells and its precursors are targeted for infection by Salmonella, and this event disturbs the B cell progenitors maturation. Since B cells are targets for the bacteria, it is possible that it interferes with the biological function of these cells. On one hand, it may interfere with B cells ability to become antibody producing plasma cells and on the other hand, with B cells ability to induce a cytotoxic T cell effector response. Concerning the former, we analyzed if infection disrupts B cell s differentiation into plasma cells. Surprisingly, Salmonella infected B cells maintain their ability to become antibody producing plasma cells. However, they are incapable of inducing T cells cytotoxic response. Taken together, the evidence presented here allows us to conclude that B cells within the bone marrow may be a bacterial niche during chronic Salmonella infection, and the biological function of these cells is not blunted by infection. 2

14 Antecedentes. Infección con Salmonella. Salmonella es responsable de causar enfermedades en humanos que van desde gastroenteritis hasta infecciones sistémicas. Salmonella typhi es la causante de la fiebre tifoidea en el humano, mientras que en el ratón Salmonella typhimurium provoca una enfermedad sistémica (1, 2). La infección del ratón por S. typhimurium, así como la del humano por S. typhi, se caracterizan por inflamación en el sitio de entrada de la bacteria, generalmente en las placas de Peyer. Después de que Salmonella penetra la barrera epitelial infecta preferentemente células fagocíticas en la lámina propia. Si se trata de gastroenteritis causada por Salmonella, la infección se auto-limita y no procede más allá de la lámina propia. En la salmonellosis adaptada al huésped, como en la fiebre tifoidea, los fagocitos infectados con Salmonella acceden al torrente sanguíneo y de esta manera la bacteria se disemina al hígado y bazo (1). Respuesta inmune frente a Salmonella. Inmunidad innata. Los macrófagos son células de gran importancia para la eliminación de Salmonella, tanto en la fase temprana de la infección, como en la tardía. En la fase temprana los macrófagos participan dentro de la inmunidad innata como la primera línea de defensa contra la infección (3). En su superficie expresan diversos PRRs (receptores de reconocimiento a patrones moleculares asociados a patógenos) que reconocen moléculas que se encuentran en la superficie de la bacteria, de esta manera los macrófagos endocitan a la bacteria, ya sea vía estos receptores ó por macropinocitosis (3-5). Una vez endocitada la bacteria, los macrófagos la procesan para posteriormente presentarla a linfocitos T, los cuales ejercen su función, ya sea citotóxica o de síntesis de citocinas, para la eliminación de la bacteria. Aquí es donde los macrófagos fungen como un puente entre la inmunidad innata y la adquirida (6). 3

15 Presentación de antígeno. Existen evidencias de microorganismos que son antígenos exógenos pero residen en vesículas dentro de las células que infectan, y por lo tanto son capaces de inducir una respuesta de linfocitos T citotóxicos, de manera que péptidos provenientes de estos antígenos exógenos, son presentados en moléculas de MHC-I (7-13). Por ejemplo, Kovacsovics observó que péptidos que se encuentran en el citoplasma de la célula, provenientes de vesículas fagocíticas, son procesados por el proteasoma y de ahí son transportados al lumen del retículo endoplásmico (RE) por TAP y posteriormente se acoplan a moléculas de MHC clase I (8). Otros estudios han demostrado que se pueden presentar péptidos provenientes de bacterias intracelulares, como Salmonella, por moléculas de MHC clase I, sin que éstas accedan al citosol (7, 9), pues al bloquear el transporte por el aparato de Golgi y la actividad del proteasoma, mediante BFA-A y lactacistina, se sigue llevando a cabo la presentación de péptidos exógenos por moléculas de clase I. Además se ha observado que péptidos antigénicos contenidos en vesículas fagocíticas son regurgitados al medio extracelular y de ahí pueden acoplarse a moléculas de MHC I vacías en la superficie de las mismas células, o de macrófagos vecinos e inducir una respuesta de linfocitos T CD8; esta vía se inhibe con citocalacina D, la cual impide que se lleve a cabo la fagocitosis, concluyendo que este mecanismo es dependiente de fagocitosis (7). Para explicar este fenómeno de presentación cruzada de antígenos, se han descrito diversas vías alternas de procesamiento. Durante la formación de la copa fagocítica, el RE se fusiona con el fagosoma que se está formando, así los fagosomas tempranos pueden contener proteínas de RE, incluyendo todos los componentes necesarios para la presentación de antígeno por moléculas de MHC-I, como TAP, tapasina, UbC, Sec-61 y MHC-I (14-16). El antígeno puede seguir tres vías alternas. En la vía fagosoma-citosol-re (8, 16), el antígeno o fragmentos del antígeno son secretados al citosol, ubiquitinados, procesados por el proteasoma, transportados al RE por TAP y unidos a las moléculas de MHC-I para ser transportados a la superficie de la célula. En la ruta vacuolar (9, 16), el antígeno no abandona el fagosoma, sino que es procesado por enzimas en el lumen del fagosoma y unidos a moléculas de MHC-I, ya sea sintetizadas de novo o recicladas, para 4

16 posteriormente ser transportado a la membrana de la célula. En la vía fagosoma-citosolfagosoma (16, 17), el antígeno sale del lumen del fagosoma al citosol, es ubiquitinado por UbC, procesado por proteasomas asociados a la vacuola, transportados por TAP al lumen del fagosoma y unidos a moléculas de MHC-I para ser transportados a la superficie celular. En nuestro grupo se demostró (18) que macrófagos de la línea celular IC21, preactivados con IFN-!, al infectarlos con S. typhimurium secretan péptidos que cargan moléculas de MHC-I vacías en la superficie de células RMA-S, utilizadas como blancos para la captación de los péptidos; y estos complejos MHC-péptido son reconocidos por linfocitos T CD8, provenientes de ratones infectados con la bacteria. El fenómeno no se inhibe por la acción de Brefeldina A, ni por cloruro de amonio o cloroquina. Esto sugiere que Salmonella se encuentra en una vesícula con características no ácidas, y que no requiere de moléculas de MHC-I sintetizadas de novo. Localización intracelular de Salmonella. Previamente, en la tesis de maestría (19) se caracterizó la vacuola que contiene a Salmonella, a partir de macrófagos pre-activados con IFN-! e infectados con Salmonella typhimurium que expresa la proteína verde fluorescente (GFP). La caracterización se llevó a cabo a través de la identificación de moléculas de histocompatibilidad, así como de moléculas características de la vía endocítica. Dentro de estos macrófagos infectados se encontraron 2 tipos de vesículas. Unas que no contienen Salmonella (VNS) y otras que contienen Salmonella (VCS). Estos dos tipos de vesículas presentan características diferentes en cuanto a la expresión de los marcadores utilizados. Dentro de lo que más llamó nuestra atención fue en primer lugar la expresión de MHC-I y MHC-II (Figura 1). A 3 horas post-infección la VCS tiene una mayor expresión de MHC-I (Figura 1a) que la VNS, y en el caso de MHC-II (Figura 1b) pasa lo opuesto, es decir, la VNS tiene una mayor expresión de MHC-II que la VCS. Otro antecedente importante es el de la expresión de Lamp1 (Figura 1c), molécula característica de lisosomas, ésta se expresa en menor nivel en la VCS, a partir de 1 hora post-infección. Un dato sorprendente fue el de la expresión de Arf6 (Figura 1d), pues a 1 hora post-infección la VCS presenta una elevada expresión de esta molécula en comparación con la VNS. 5

17 a b c d Figura 1. Expresión de marcadores en la vacuola que contiene Salmonella. Se obtuvieron vesículas provenientes de macrófagos en estado basal (No IFN-!); activados 48 horas con IFN-! (IFN-!); a 1h postinfección (vacuola que no contiene Salmonella, 1h VNS; y vacuola que contiene Salmonella, 1h VCS); a 3 horas post-infección (3h VNS y 3h VCS); y a 18h post-infección (18h VNS). Las vesículas se tiñeron con anticuerpos dirigidos contra a. MHC-I, b. MHC-II, c. Lamp 1 y d. ARF 6. Se muestra la media de intensidad de fluorescencia (MFI) para cada una de las moléculas analizadas (n=3) (Tomada a partir de la referencia 19). Todos estos antecedentes sugieren que la VCS se encuentra remodelada, tiene una mayor expresión de moléculas de MHC-I, por su baja expresión de Lamp1 tiene características no lisosomales, y podemos decir que recicla a membrana celular por su expresión de Arf6. Es probable que se trate de la vacuola encargada de presentar péptidos de Salmonella en moléculas de MHC-I, por la vía alterna de procesamiento antes descrita por nuestro grupo (18). 6

18 Infección de linfocitos B por Salmonella. Otros experimentos realizados en nuestro laboratorio (20) mostraron que los linfocitos B, de la línea celular A20, se infectan con Salmonella typhimurium, y se observó, mediante microsopía confocal, que la bacteria se encuentra en compartimientos que colocalizan con el marcador lisosomal Lamp1, desde tiempos tempranos post-infección, y permanece allí hasta tiempos tardíos; es decir, permanece dentro de una vesícula con características lisosomales. Además, esta línea celular no controla la infección tan eficientemente como los macrófagos de la línea celular IC21 activados con IFN-!. Aunado a ello, los linfocitos B no utilizan la vía alterna descrita anteriomente, donde el procesamiento conlleva a la secreción de péptidos al medio extracelular (18). Por otro lado, resultados también incluidos en la tesis de maestría (19), señalan que los linfocitos B se infectan con Salmonella durante la infección in vivo (21). En la figura 2 se muestra la cinética de infección en ratones BALB/c, observando que tanto los linfocitos B del bazo como los de médula ósea permanecen infectados por tiempos prolongados. Lo que demuestra que el linfocito B es un reservorio de la bacteria y probablemente también sea un nicho donde ocurra multiplicación bacteriana. a c b d Figura 2. Salmonella infecta linfocitos B. UFCs de Salmonella a partir de macrófagos y linfocitos B provenientes de bazo y médula ósea de ratones infectados a 3, 5, 15, 30 y 60 días post-infección. a. UFCs a partir de células de bazo de ratones infectados por vía intraperitoneal (IP). b. UFCs a partir de células de bazo de ratones infectados por vía oral (VO). c. UFCs a partir de células de médula ósea de ratones infectados por vía IP d. UFCs a partir de células de médula ósea de ratones infectados por vía VO. 7

19 Nuestros datos muestran que los linfocitos B provenientes de bazo y médula ósea se encuentran infectados, con una carga bacteriana similar a la de los macrófagos, y la bacteria permanece en estas células hasta los 60 días post-infección. Sugerimos entonces que los linfocitos B pueden participar como reservorio de Salmonella en la infección in vivo. 8

20 Justificación. Dados los antecedentes y los resultados generados en la tesis de maestría, el linfocito B es un reservorio de Salmonella durante la infección. Las células infectadas in vitro no utilizan la vía alterna de procesamiento y presentación de antígeno por moléculas MHC-I que se ha descrito para los macrófagos, la bacteria reside dentro de una vesícula lisosomal, donde permanece viable por largos periodos de tiempo. Por lo tanto es importante caracterizar la vacuola que contiene a Salmonella en linfocitos B, para conocer si diferencias en esta vesícula conllevan al bloqueo de los mecanismos de procesamiento y presentación de antígenos exógenos por la vía de MHC-I. Además es importante conocer el efecto que tiene la infección sobre el desarrollo de linfocitos B en médula ósea y sobre su diferenciación hacia células plasmáticas. 9

21 Objetivos. Objetivo general. Caracterizar los efectos de la infección por Salmonella sobre la biología del linfocito B. Objetivos específicos. 1. Caracterizar la VCS en linfocitos B. 2. Definir si las poblaciones de precursores de linfocitos B de médula ósea se encuentran infectadas con Salmonella typhimurium. 3. Caracterizar los efectos de la infección con Salmonella sobre la diferenciación de los linfocitos B a células plasmáticas. 4. Identificar la capacidad de los linfocitos B infectados con Salmonella para presentar antígeno en moléculas de MHC-I. 10

22 Material y Métodos. Líneas celulares. Se utilizó la línea celular de linfocitos B A20. Las células se mantuvieron a 37 C 5% CO 2. Se cultivaron en medio DMEM (Gibco) suplementado con 6% suero fetal bovino (SFB) (Gibco) y 200 µg/ml de ampicilina. Cepas de Salmonella. Se utilizó Salmonella enterica serovar Typhimurium ATCC 14028, transformada con plásmido con proteína verde fluorescente (GFP), resistente a ampicilina. Se creció en cajas de Petri con agar LB (Luria Bertani) con 200 µg/ml de ampicilina, a 37 C. Hibridomas. Para la obtención de la citocina IFN-! se utilizó el sobrenadante del cultivo del hibridoma L1210 (de ratón). Para obtener el anticuerpo "-Lamp1 se utilizó el sobrenadante del cultivo del hibridoma ID4B (de rata). Para la obtención del anticuerpo "-MHC-I (H-2 K d ) se utilizó el sobrenadante de cultivo del hibridoma Y3 (de ratón), y también el hibridoma MKDG (de ratón) para obtener el anticuerpo "-MHC-II (I-A d ). Éstos se cultivaron en medio DMEM (Gibco) suplementado con 10% de SFB (Gibco), en condiciones de 5% CO 2 a 37 C. Anticuerpos. Para caracterizar la VCS se utilizaron anticuerpos purificados, provenientes de la inmunización de conejos con las moléculas Rab5, Rab7, Nramp y Arf6. Éstos se utilizaron en una dilución 1:50. Para su detección se adicionó el anticuerpo secundario "-conejo-pe 11

23 (Zymed) en una dilución 1:200. También se utilizaron los anticuerpos secundario!-ratón- PE y!-rata-pe (Zymed) a una dilución 1:200. Para identificar y purificar las poblaciones de precursores de linfocitos B se utilizaron los anticuerpos comerciales (BD Pharmingen) dirigidos contra las siguientes moléculas: B220-PE (dilución 1:300), CD43-biotina (dilución 1:300), CD19-APC (dilución 1:600), IgM-biotina (dilución 1:200), IgD-FITC (dilución 1:100) y CD138-PE (dilución 1:100). Para detectar los anticuerpos biotinilados, se utilizó el complejo Estreptavidina- PerCP (BD Pharmingen) a una dilución 1:600. Para diferenciar linfocitos B a células plasmáticas se utilizó lipopolisacárido (LPS) de Escherichia coli O111:B4 [10 µg/ml] cuando se indica, o bien se utilizaron IL-4 [200 U/ml] e IL-21 [50 ng/ml], recombinantes (PeproTech) y los anticuerpos purificados!-igm [5 µg/ml] y!-cd40 [1 µg/ml] (BD Pharmingen). Para detectar las células plasmáticas se utilizó el anticuerpo!-cd138-pe (BD Pharmingen) a una dilución de 1:100. Para identificar linfocitos T citotóxicos se utilizaron los anticuerpos!-cd8-fitc (ebioscience) a una dilución 1:200; y para detectar su activación!-cd107a-pe (BD Pharmingen) a una dilución 1:300 y!-cd69-pecy7 (BD Pharmingen) a una dilución 1: Caracterización de la VCS en linfocitos B. Infección de linfocitos B. La Salmonella-GFP se incubó en caldo LB con 200 µg/ml de ampicilina, a 37 C, en agitación a 180 rpm, hasta alcanzar la fase logarítmica (DO 600 nm de 0.6), para realizar la infección. Los linfocitos B de la línea celular A20 se preactivaron por 48 horas con 4% de IFN-" (sobrenadante de hibridoma L1210). Después de estas 48 horas se incubaron 10 minutos con Salmonella typhimurium MOI 1:30, en presencia de ampicilina [200 µg/ml]. Posteriormente se centrifugaron las células a 1200 rpm por 5 minutos a 25 C. Después se incubaron las células a 37 C por 5 minutos, pasado este tiempo se resuspendió el paquete celular en medio DMEM con 200 µg/ml de ampicilina y se dejó incubando otros 20 12

24 minutos a 37 C. Se lavaron las células 2 veces con PBS-gentamicina [40 µg/ml] para eliminar la bacteria libre. Después se dejaron incubando las células en medio DMEM con gentamicina y ampicilina hasta alcanzar 1, 3 y 18 horas post-infección. En cada tiempo se tomaron 20 x 10 6 células para la extracción de vesículas totales. Extracción de vesículas. Para realizar la extracción de vesículas, se siguió la metodología descrita por Ramachandra et al. (22), con ciertas modificaciones. Resumiendo, 20 x 10 6 células se centrifugaron a 1400 rpm por 5 minutos. Se descartó el sobrenadante y las células se resuspendieron en 2 ml de buffer (tris [10mM]-EDTA [1mM] y sacarosa [0.25M]) con inhibidores de proteasas (1/4 tableta de Complete). Se rompieron las células con un homogenizador Dounce. El lisado se centrifugó a 1400 rpm por 5 minutos a 4 C. Se colocaron 100 µl/pozo del sobrenadante con vesículas en una placa de 96 pozos. Se centrifugó a 3600 rpm por 10 minutos a 4 C. Se descartó el sobrenadante y se resuspendieron las vesículas en solución FACS (PBS, 10% SFB, 0.1% BSA, 0.1% saponina, 1% de suero de chivo y 1.6 µg/ml de gamma-globulina humana) para proseguir con la tinción. Tinción de vesículas. Las vesículas se incubaron a 4 C por 30 minutos, con anticuerpos dirigidos contra Rab5 (de conejo, purificado), Rab7 (de conejo, purificado), MHC-I (de ratón, sobrenadante de hibridoma), MHC-II (de ratón, sobrenadante de hibridoma), Nramp (de conejo, purificado), Lamp1 (de rata, sobrenadante de hibridoma), y Arf6 (de conejo, purificado). Se utilizaron como controles los anticuerpos irrelevantes AFG (de ratón) y anticuerpos dirigidos contra OVA (de conejo). Posteriormente se lavaron las vesículas dos veces con solución FACS. Se incubaron 30 minutos a 4 C con los anticuerpos secundarios acoplados a PE dirigidos contra conejo, ratón y rata, dependiendo. Después de dos lavados se fijaron con PBS-formaldehído 2%. 13

25 Análisis de vesículas. Las vesículas teñidas se analizaron en el citómetro de flujo FACScalibur, adquiriendo eventos por muestra. El análisis se llevó a cabo mediante el programa Win-MDI, considerando las que contienen Salmonella (VCS) como positivas en el canal de fluorescencia FL-1, y las que no contienen Salmonella (VNS) negativas en este canal. Unidades formadoras de colonias. En los tiempos señalados post-infección, se tomaron 100 µl del sobrenadante con vesículas, se lisaron con PBS-Tritón 10 % y se sembró sobre las placas por duplicado en agar SS (Salmonella-Shigella) con ampicilina (200 µg/ml) en diluciones 10-1 y Se dejaron incubando toda la noche a 37 C y a la mañana siguiente se contaron las UFC. 2. Caracterización de las poblaciones de precursores de linfocitos B de médula ósea en ratones infectados con Salmonella typhimurium. Infección de ratones. La bacteria Salmonella typhimurium se incubó en caldo LB, a 37 C, en agitación a 180 rpm, hasta alcanzar la fase logarítmica (DO 600 nm de 0.6), para realizar la infección. Se infectaron ratones BALB/c con 50 UFC de Salmonella typhimurium, por vía IP. A los 3, 5, 15, 30 y 60 días post-infección, se sacrificaron los animales y se obtuvo un homogenizado de células de médula ósea. Tinción de células provenientes de médula ósea. Las células de médula ósea se suspendieron en PBS con 2% SFB y 5 % de suero de rata. Posteriormente se incubaron 20 minutos a 4 C con anticuerpos!- B220,!-CD43,!- 14

26 CD19,!-IgM y!-cd138. Se lavaron 2 veces y se resuspendieron en PBS-2% formaldehído. Purificación de precursores de linfocitos B de médula ósea. Las células se purificaron mediante un citómetro de flujo (FACSVantage, BD), tomando en cuenta los siguientes parámetros para definir cada población (23). Pre-Pro B Pro B Pre B B Inmaduras B Näive Células Plasmáticas B220+ CD43+ CD19- B220+ CD43+ CD19+ B220+ CD43- CD19+ IgM lo B220+ CD43- CD19+ IgM hi B220+ CD43- CD19+ IgM hi IgD+ CD138+ Unidades formadoras de colonias. Cada población de células purificadas se lisó con PBS-Tritón 10 % y se sembró en las placas por duplicado en agar SS (Salmonella-Shigella) en diluciones 10-1 y Se dejaron incubando toda la noche a 37 C y a la mañana siguiente se contaron las UFC. 3. Caracterización de los efectos de la infección con Salmonella sobre la diferenciación de los linfocitos B a células plasmáticas. Purificación de linfocitos B. A partir de células de bazo de ratón BALB/c, se eliminaron los eritrocitos con cloruro de amonio (Pharmingen) incubando 10 minutos a 37 C, posteriormente se lavaron las células 2 veces con PBS. Se resuspendieron las células a una concentración de

27 células/ml, en PBS con 2% de SFB y 5% de suero de rata. A partir de esta suspensión de células, la purificación se llevó a cabo mediante el sistema de separación negativa de linfocitos B EasySep (StemCell Technologies). Brevemente, el procedimiento consiste en lo siguiente. 1. Colocar la suspensión celular en un tubo de poliestireno de 12 x 75 mm (Becton Dickinson). Añadir el bloqueador FcR de ratón, mezclar e incubar 15 minutos a 4 C. 2. Agregar el cocktail de anticuerpos para selección negativa de células B. Mezclar e incubar a 4 C por 15 minutos. 3. Añadir el cocktail de selección con biotina e incubar 15 minutos a 4 C. 4. Añadir las nanopartículas magnéticas, las cuales están asociadas a anticuerpo!- biotina. Incubar 15 minutos a 4 C. 5. Llevar la suspensión a un volumen de 2.5 ml con PBS-SFB. 6. Colocar el tubo en el magneto (StemCell Technologies) y dejarlo por 5 minutos. 7. Invertir el tubo en un movimiento, vaciando el contenido que no se adhirió al magneto en un tubo nuevo, donde se encuentra una suspensión enriquecida con células B. Infección de células. Salmonella-GFP se incubó en caldo LB con 200 µg/ml de ampicilina, a 37 C, en agitación a 180 rpm, hasta alcanzar la fase logarítmica (DO 600 nm de 0.6), para realizar la infección. Los linfocitos B purificados se incubaron 1 hora a 37 C con Salmonella typhimurium-gfp MOI 1:60, en presencia de ampicilina. Posteriormente se lavaron las células 2 veces con PBS-gentamicina (40 µg/ml) para eliminar la bacteria libre. Después se purificaron los linfocitos B infectados (GFP+) mediante el citómetro de flujo (FACSVantage, BD). Activación de células. Los linfocitos B infectados se resuspendieron en medio DMEM (Gibco) con 200µg/ml de ampicilina y 40 µg/ml de gentamicina. 5x10 5 linfocitos B infectados con 16

28 Salmonella-GFP se incubaron por pozo en placas de 96 pozos durante 3 días en presencia de LPS [10 µg/ml] ó!-igm [5 µg/ml] +!-CD40 [1 µg/ml] + IL-4 [200 U/ml] + IL-21 [50 ng/ml], para promover su diferenciación hacia células plasmáticas (24). El anticuerpo!- IgM se colocó en los pozos 2 horas antes de la incubación de las células para sensibilizar el pozo con el anticuerpo, posteriormente se colocaron las células y los demás estímulos descritos previamente. Tinción de células. Después de 3 días las células se cosecharon y se incubaron con!-cd138 por 20 minutos, posteriormente se lavaron con PBS 2 veces y se fijaron con PBS 2% formaldehido. Análisis de las células. Las células teñidas se analizaron en el citómetro de flujo (FACScalibur, BD), adquiriendo eventos por muestra. El análisis se llevó a cabo mediante el programa Summit (Beckman Coulter). 4. Identificación de la capacidad de los linfocitos B infectados con Salmonella para presentar antígeno en moléculas de MHC-I. Purificación de linfocitos B infectados con Salmonella typhimurium. Se purificaron linfocitos B de bazo de ratón y se infectaron con Salmonella typhimurium-gfp, como se describió en el inciso anterior. Después se purificaron los linfocitos B infectados (GFP+) mediante el citómetro de flujo (FACSVantage, BD). Se resuspendieron las células en medio de cultivo DMEM en presencia de gentamicina, y se dejaron incubando 24 horas. 17

29 Obtención de linfocitos T citotóxicos. Se infectaron ratones BALB/c con Salmonella typhimurium (20 UFCs, vía IP). A los 7 días se obtuvo el bazo de estos ratones. A partir de estas células de bazo se purificaron linfocitos T CD8 mediante el sistema de selección negativa de linfocitos T CD8 (EasySep, StemCell Technologies), de la manera que se describió anteriormente para linfocitos B. Ensayo de presentación a linfocitos T citotóxicos. Los linfocitos T CD8 obtenidos se incubaron con los linfocitos B infectados con Salmonella por 6 horas, en una relación 2:1 (6x10 6 linfocitos T CD8 y 3x10 6 linfocitos B), en presencia del anticuerpo!-cd107a (25) (dilución 1:300). También se cultivaron con linfocitos B sin infectar, y linfocitos B que estuvieron en cultivo con la bacteria, pero no se infectaron. Como control positivo se activaron linfocitos T CD8 con PMA [2 ng/ml] y ionomicina [200 ng/ml], en presencia del anticuerpo!-cd107a por 6 horas. Tinción de células. Después de 6 horas de cultivo, se cosecharon las células y se tiñeron con los anticuerpos!-cd19-apc,!-cd8-fitc y!-cd69-pecy7 por 30 minutos, se lavaron 2 veces con PBS y se fijaron con PBS-formaldehído 2%. Análisis de las células. Las células teñidas se analizaron en el citómetro de flujo (FACScalibur, BD). Se adquirieron eventos por muestra. El análisis se llevó a cabo mediante el programa Summit (Beckman Coulter). 18

30 Resultados. 1. En linfocitos B no hay un control de la infección con Salmonella y la VCS no se remodela. Los linfocitos B son, al igual que los macrófagos, blancos de la infección por Salmonella typhimurium. En nuestro grupo demostramos anteriormente que in vitro las células B no son capaces de utilizar la vía alterna de presentación de antígenos de Salmonella en moléculas de MHC-I (20), además de que la bacteria permanece en un compartimiento con características lisosomales. Sin embargo no conocemos la vía endocítica que sigue Salmonella dentro de los linfocitos B. Investigamos las características moleculares de la vacuola que contiene a Salmonella (VCS) en estas células. Se infectaron con Salmonella-GFP los linfocitos B de la línea celular A20 y se obtuvieron las vesículas como se describe en Material y Métodos. El nivel de infección de los linfocitos B se mantuvo desde el inicio hasta 18 horas post-infección (Figura 3a), sin que observáramos control por parte de la célula B sobre la infección. Se analizó el porcentaje de vesículas que contienen Salmonella (GFP+), encontramos que la bacteria se encuentra en menos del 2% de las vesículas (Figura 3b), y en estas vesículas que contienen Salmonella, la cantidad de bacteria se incrementa con el tiempo (Figura 3c). a b c Figura 3. Las células B no controlan la infección con Salmonella. a) UFC de Salmonella en células A20 infectadas, a 30 minutos, 1, 3 y 18 horas post-infección. b) Porcentaje de VCS de células A20 a 1, 3 y 18 horas post-infección. c) UFC de Salmonella en 100 µl de vesículas provenientes de células A20 infectadas a 1, 3 y 18 horas post-infección. Cada barra representa la media + Desviación Estándar. 19

31 Procedimos con la caracterización de la VCS mediante el análisis de la expresión de marcadores de la vía endocítica. Para esto medimos moléculas de MHC clase I y clase II, Rab 5 como marcador de endosomas tempranos, Rab 7 como marcador de endosomas tardíos, Nramp como marcador de fagosomas y Arf6 como marcador de vesículas de reciclaje (Figura 4). a b c d e f Figura 4. En las células B Salmonella se encuentra en un compartimiento lisosomal tardío. Cuantificación de a) MHC-I, b) MHC-II, c) Rab5, d) Rab7, e) Lamp 1 y f) Arf 6; en vesículas provenientes de células A20 sin activar y sin infectar (No IFN-!); de células activadas con IFN-! e infectadas con Salmonella-GFP a 1 hora post-infección (1h); 3 horas post-infección (3h) y 18 horas post-infección (18h). Se grafica la media de intensidad de fluorescencia (MFI) para la VNS (vacuola que no contiene Salmonella) y la VCS (vacuola que contiene Salmonella). 20

32 Podemos observar que la VCS tiene una elevada expresión de MHC-I a 1 hora postinfección, que disminuye a 3 horas post-infección y más a 18 horas post-infección; mientras que en la VNS la expresión es baja y no observamos cambios con el tiempo (Figura 4a). La expresión de MHC-II se incrementa importantemente en la VCS hasta las 18 horas post-infección; y la VNS mantiene una expresión basal de la molécula (Figura 4b). A 1 hora post-infección la VCS se encuentra en un endosoma temprano, con una elevada expresión de Rab5 (Figura 4c), en tiempos más tardíos pierde la expresión de Rab5 y vemos una mayor expresión de Rab7, lo que sugiere que la bacteria madura hacia un endosoma tardío (Figura 4d). A las 18 horas post-infección encontramos a Salmonella en un compartimiento lisosomal con una mayor expresión de Lamp1, que no observamos en la VNS (Figura 4e). Arf6 es un marcador de vesículas que reciclan a membrana celular. Detectamos su expresión en la VCS a 1 hora post-infección, pero esta expresión no difiere de la expresión basal observada en vesículas provenientes de células sin activar, sin infectar (Figura 4f); y en tiempos posteriores no detectamos su expresión en la VCS. 2. Los precursores de linfocitos B de médula ósea se encuentran infectados con Salmonella typhimurium. Anteriormente describimos que las células B de médula ósea se infectan con Salmonella typhimurium (Figura 2). No conocemos si la bacteria llega en forma libre a médula ósea y posteriormente infecta a las células, o bien si es acarreada a médula ósea por linfocitos B o macrófagos infectados procedentes de bazo. De cualquier manera sabemos que hay células infectadas en médula ósea, estas células pueden morir por apoptosis inducida por Salmonella y de esta manera liberarse e infectar otras células. La médula ósea es el principal órgano hematopoyético en el adulto, de manera que la bacteria que se encuentra en médula ósea podría infectar precursores de células y repercutir en su desarrollo. Por esta razón buscamos si los precursores de linfocitos B de médula ósea se encuentran infectados con Salmonella. Identificamos en médula ósea de ratones BALB/c sin infectar las poblaciones de cada precursor de célula B (23), como se muestra en la Figura 5. Las células 21

33 B220+CD43+CD19- corresponden a la población Pre pro B (1.8%); las células B220+CD43+CD19+ corresponden a la población Pro B (2.5%); las células B220+CD43- CD19+IgM -/lo corresponden a la población Pre B (11.4%); y las células B220+CD43- CD19+IgM hi corresponden a la población de células B inmaduras (4.5%). Figura 5. Identificación de precursores de células B. Células de médula ósea de ratón Balb/c se tiñeron con anticuerpos dirigidos contra B220, CD43, CD19 e IgM. A partir de la región B220+CD43+, las células CD19- se consideran Pre pro B y las CD19+ Pro B. A partir de la región B220+CD43-, las células CD19+IgM -/lo se consideran Pre B y las CD19+IgM hi se consideran B inmaduras. De acuerdo con estos parámetros, identificamos cada población en células de médula ósea, provenientes de ratones BALB/c infectados con Salmonella typhimurium, a diferentes tiempos post-infección para conocer si su proporción se afecta por la infección. Además purificamos células de las poblaciones correspondientes a cada precursor de linfocitos B, las lisamos y las sembramos en agar SS (Salmonella-Shigella) para saber si se encuentran infectadas con Salmonella. Analizamos a las células Pre pro B (Figura 6a), que son los precursores más tempranos y observamos que al inicio de la infección con Salmonella su número disminuye, posteriormente se recuperan a los 15 días post-infección, pero vuelven a disminuir en tiempos tardíos post-infección (Figura 6a, izquierda). Las células Pre pro B se 22

34 encuentran infectadas (Figura 6a, derecha), y a los 3 días post-infección la cantidad de UFCs es muy elevada, mayor que en los linfocitos B totales de médula ósea (Figura 2c). a b c Figura 6. Los precursores de linfocitos B se infectan con Salmonella. Precursores de células B de médula ósea de ratones no infectados (NI), y de ratones infectados a 3, 5, 15, 30 y 60 días postinfección se cuantificaron (gráfica izquierda) y se lisaron para obtener el número de UFCs de Salmonella (gráfica derecha), para a) células Pre pro B, b) células Pre B, y c) células B Inmaduras. Se muestra la media + Desviación estándar. 23

35 En cuanto a las células Pro B, encontramos que en médula ósea de ratones infectados su porcentaje disminuye considerablemente (Figura 7), desde la infección temprana (Figura 7a) y esta disminución no se recupera en tiempos posteriores (Figura 7b). De manera que no fue posible recuperar suficientes células purificadas para cuantificar UFCs de Salmonella en tiempos tardíos post-infección. Sin embargo, a los 5 días postinfección encontramos que esta población está infectada (Figura 8). Posiblemente no encontramos esta población en tiempos posteriores ya sea porque estas células están madurando rápidamente, como sugiere el incremento de células B inmaduras en la Figura 6c, o porque mueren por muerte inducida por Salmonella. Es necesario indagar más a fondo si alguna de estas posibilidades es cierta. a b Figura 7. El porcentaje de células Pro B disminuye en ratones infectados con Salmonella. Células de médula ósea de BALB/c infectados con Salmonella a) al día 5 post-infección y b) al día 15 postinfección. Panel izquierdo: gráfica de puntos donde se seleccionó la población de células B220+CD43+ (R18). Panel derecho: a partir de R18, se muestran en un histograma las poblaciones CD19- (R21) y CD19+ (R20); la última corresponde a las células Pro B. 24

36 Figura 8. Las células Pro B y B näive se infectan con Salmonella. A partir de médula ósea de ratones Balb/c a 5 días post-infección con Salmonella, se purificaron células Pro B y células B näive. Se lisaron para obtener el número de UFCs de Salmonella. Se muestra la media + Desviación estándar. Las células Pre B se encuentran infectadas, aunque a un nivel menor que las Pre pro B (Figura 6b), y el número de células disminuye de manera no significativa a los 3 días post-infección y se recupera rápidamente en los días posteriores. Al igual que los demás precursores, las células B inmaduras se infectan desde el día 3, las UFCs recuperadas incrementan al día 4 post-infección y se mantiene la infección hasta el día 60 (Figura 6c), también observamos que el número de estas células incrementa con la infección, esto podría sugerir que la infección podría estar acelerando el proceso de maduración de las células B. Dentro de la población de células B inmaduras (B220+ CD43- CD19+ IgM hi ) podemos encontrar también linfocitos B näive, por lo tanto buscamos si esta población en médula ósea se encuentra infectada. Observamos que de hecho los linfocitos B näive en médula ósea están infectados (Figura 8). Este resultado podría sugerir que la bacteria es transportada por estas células posiblemente del bazo a la médula ósea, aunque es necesario realizar otros ensayos para concluir con solidez esta especulación. Una vez que los linfocitos B se activan, éstos se diferencían a células plasmáticas, las cuales se encargan de producir anticuerpos. Una forma de conocer si la infección con Salmonella afecta la función efectora de los linfocitos B, es midiendo si las células B infectadas pueden diferenciarse a células productoras de anticuerpo. Así que purificamos células plasmáticas de médula ósea, pues sabemos que los plasmocitos migran a médula ósea, para conocer si se encuentran infectadas. Recuperamos altos números de colonias de Salmonella a partir de las células plasmáticas desde el inicio de la infección, hasta días 25

37 tardíos (Figura 9). No sabemos con certeza a partir de este resultado si los linfocitos B infectados se convierten en células plasmáticas, o bien si las células plasmáticas ya diferenciadas se infectan con Salmonella. Para averiguarlo es necesario responder el siguiente objetivo. Figura 9. Las células plasmáticas se encuentran infectadas con Salmonella. A partir de células de médula ósea de ratones no infectados (NI), y de ratones infectados a 3, 5, 15, 30 y 60 días post-infección se cuantificaron las células plasmáticas (gráfica izquierda), se purificaron y se lisaron para obtener el número de UFCs de Salmonella (gráfica derecha). Se muestra la media + Desviación estándar. 3. Los linfocitos B infectados con Salmonella son capaces de diferenciarse hacia células plasmáticas. No sabemos si los linfocitos B infectados con Salmonella tienen la capacidad de diferenciarse a células plasmáticas, o bien si la presencia de la bacteria interfiere con la biología de la célula, incapacitando su función efectora de producción de anticuerpos. Para conocer cuál de las dos posibilidades es cierta, activamos células B infectadas con Salmonella para inducir su diferenciación hacia células plasmáticas. Como se describe en material y métodos, se infectaron linfocitos B de bazo con Salmonella-GFP y se purificaron los linfocitos B infectados (GFP+) por citometría de flujo. Se cultivaron las células en presencia de LPS ó!-igm+!-cd40+il-4+il-21; como control se cultivaron células en medio sin estímulo. Simultáneamente estimulamos linfocitos B provenientes del cultivo con la bacteria, pero que no se infectaron (GFP-, purificados por citometría de flujo; se comprobó la ausencia de bacteria por UFCs). Después de 3 días de 26

38 activación se cosecharon las células y se cuantificaron las células plasmáticas por su expresión de CD138. En la Figura 10 observamos que antes de su activación hay un porcentaje basal de células plasmáticas, que es igual para las células infectadas y no infectadas (5%). Después de 3 días de activación, en ausencia de estímulo las células infectadas se diferencían a células plasmáticas, de manera que encontramos que el 15% de las células son CD138+; no pasa lo mismo con las células no infectadas (8%). Cuando estimulamos a las células con LPS, encontramos que la proporción de células plasmáticas es de 18% para ambos casos, células infectadas y sin infectar, esto es un incremento discreto para las primeras, pero un incremento sustancial para las últimas. El estímulo de!-igm+!-cd40+il-4+il-21 induce en los linfocitos B infectados un incremento de hasta el 24% en su diferenciación a células plasmáticas, mientras que en los linfocitos no infectados (17.5%) no se observan diferencias con respecto al estímulo con LPS. Figura 10. Los linfocitos B infectados con Salmonella se diferencían a células plasmáticas. Se grafica el porcentaje de células plasmáticas (CD138+) al tiempo 0 después de la purificación de células (T0 S/A), después de 3 días de cultivo sin estímulo (3 Días post-activación S/A), después de 3 días de activación con LPS (3 Días post-activación LPS), y después de 3 días de activación con!-igm+!-cd40+il-4+il-21 (3 Días post-activación!-igm); para linfocitos B sin infectar (barras negras) y linfocitos B infectados con Salmonella (barras blancas). Se muestra la media + Desviación Estándar de 2 experimentos realizados por duplicado. 27

39 4. Los linfocitos B infectados con Salmonella no inducen una respuesta citotóxica por parte de los linfocitos T CD8. Los linfocitos B son células presentadoras de antígeno profesionales (APC), además de los macrófagos y las células dendríticas. En los macrófagos se ha descrito su capacidad para procesar y presentar antígenos de Salmonella de manera cruzada, es decir, en moléculas de MHC-I, para su detección por parte de los linfocitos T citotóxicos (26). En linfocitos B, aunque se ha descrito que tienen la capacidad de hacer presentación cruzada de antígenos (27), no sabemos si es capaz de presentar antígenos de Salmonella en moléculas de MHC-I. Esta ocasión quisimos saber si ex vivo linfocitos B infectados con Salmonella tenían la capacidad de presentar antígenos de Salmonella en moléculas de MHC-I. Para esto cultivamos linfocitos T CD8 provenientes de ratones infectados con Salmonella, con linfocitos B infectados con Salmonella, como se describe en Material y Métodos. Figura 11. Los linfocitos B infectados con Salmonella no inducen una respuesta por linfocitos T CD8. Se grafica el porcentaje de células T CD8 que expresan CD107a (barras grises) y las que expresan CD107a y CD69 (barras negras). Células T CD8 purificadas se trataron por 6 horas en presencia de los siguientes estímulos. Control: se cultivaron con medio solamente. B Sin Infectar: se cocultivaron con linfocitos B sin infectar. B No Infectados: se cocultivaron con linfocitos B que estuvieron en presencia de Salmonella, pero no se infectaron (GFP-). B Infectados: se cocultivaron con linfocitos B infectados con Salmonella (GFP+). PMA/ionomicina: se activaron con PMA y ionomicina. Cada barra representa la media + Desviación Estándar. 28

40 Detectamos la activación y consecuente degranulación de linfocitos T CD8 por la expresión superficial de CD107a (25), además corroboramos su activación por la presencia de CD69. En la Figura 11 observamos que menos del 2% de los linfocitos T CD8 en reposo expresan CD107a. Cuando estas células se cultivan con linfocitos B en reposo sin infectar, observamos que hay un incremento en las células que expresan este marcador (6%). Sin embargo, cuando cultivamos a los linfocitos T citotóxicos con linfocitos B que estuvieron en contacto con la bacteria pero que no se encuentran infectados, no observamos un cambio en el porcentaje de células que expresan CD107a (6%). No observamos un incremento en las células T CD8 activadas, detectadas por la presencia de CD69, y que se degranulan (menos del 1%), ni en el porcentaje de las células que se degranulan (6% CD107a+) cuando se cultivan en presencia de linfocitos B infectados con Salmonella, lo que nos dice indirectamente que los linfocitos B que se infectan con Salmonella son incapaces de presentar antígenos de esta bacteria en moléculas de MHC-I. Al comparar con el control positivo, donde activamos linfocitos T CD8 con PMA y ionomicina, observamos en éstos que el porcentaje de células que se degranulan son 17 y las que además expresan CD69 son 8%. De manera que los linfocitos B no tienen la capacidad de inducir una respuesta citotóxica por parte de los linfocitos T CD8. 29

41 Discusión. Previamente demostramos que los linfocitos B se infectan con Salmonella (20). Este hallazgo nos llevó a preguntarnos los efectos que la infección tendría sobre la función biológica de estas células. En primer lugar analizamos el compartimiento que ocupa Salmonella dentro de los linfocitos B. Encontramos que las células no sólo no controlan la infección con Salmonella, sino además por el incremento en las UFCs podemos inferir que la bacteria se está replicando dentro de las vesículas que la contienen. Al analizar la expresión de marcadores endocíticos en las vacuolas provenientes de estas células, observamos que en linfocitos B Salmonella se encuentra en un compartimiento tardío lisosomal, rico en moléculas de MHC-II. La presencia de estas moléculas sugiere que Salmonella está siguiendo el tráfico convencional que llevan las vacuolas que contienen antígenos exógenos (28). Al comparar con la vacuola que contiene a Salmonella en macrófagos, observamos que en éstos hay una remodelación de dicha vacuola, la cual permanece en un compartimiento tardío no lisosomal, rico en moléculas de MHC-I y que recicla a membrana plasmática (19). En macrófagos se lleva a cabo una vía alterna de procesamiento en la cual se secretan antígenos de Salmonella y éstos se unen a moléculas de MHC-I vacías en la superficie de las células (18), posiblemente esta vacuola que recicla a membrana plasmática es la responsable de que se lleve a cabo esta vía de procesamiento. Anteriormente describimos que los linfocitos B A20 no llevan a cabo esta vía de procesamiento (20), suponemos que esto es porque en éstas células no se remodela la vacuola que contiene a Salmonella y sigue el tráfico que conlleva a su presentación por moléculas de MHC-II, esto concuerda con la elevada expresión de moléculas de MHC-II que encontramos en estas vesículas. Por ser Salmonella un patógeno intracelular, es necesario que se establezca una respuesta citotóxica en contra de las células infectadas para lograr un eficiente control y eliminación de la infección (12, 26, 29). Para esto es necesario que las células T CD8 identifiquen y reconozcan a las células infectadas y esto sólo se puede lograr si dicha célula infectada tiene la capacidad de mostrar en las moléculas de MHC-I antígenos provenientes de Salmonella (29). Nos cuestionamos si las células B de ratón tienen la capacidad de 30

42 presentar antígenos de Salmonella en moléculas de MHC-I. Aunque tenemos el antecedente que in vitro no llevan a cabo la vía alterna de procesamiento que describimos para macrófagos (18), se han descrito otras vías de procesamiento que conllevan a la presentación de antígenos exógenos por moléculas de MHC-I (16), además se ha reportado que los linfocitos B pueden realizar la presentación cruzada de antígenos de Micobacterium tuberculosis fusionados a la proteína de choque térmico HSP70, en moléculas de MHC-I (27). No sabemos si los linfocitos B infectados con Salmonella pueden utilizar algunas de las vías de presentación cruzada descritas anteriormente (16), que finalmente llevan a la presentación de antígenos por MHC-I para ser reconocidas por los linfocitos T citotóxicos. Por esta razón infectamos con Salmonella linfocitos B y los cultivamos con linfocitos T CD8 provenientes de ratones infectados. Medimos la activación de los linfocitos T por la expresión de CD69, y su degranulación por la expresión de CD107a en su superficie (25). No observamos una respuesta por parte de las células T citotóxicas cuando se cultivaron con linfocitos B infectados, esto sugiere que los linfocitos B no presentan antígenos de Salmonella en moléculas de MHC-I, o bien pudieran no estar induciendo la activación de las células T por una deficiente expresión de moléculas de coestimulación. La capacidad de respuesta de estas células T CD8 es adecuada puesto que se activaron con los estímulos de PMA y ionomicina que las llevaron a degranularse. Si lo mismo ocurre in vivo, es decir, si los linfocitos B infectados con Salmonella no presentan antígenos de esta bacteria en MHC- I, entonces no pueden ser detectados por los linfocitos T CD8, por lo tanto no serían detectadas estas células infectadas, permitiendo que la bacteria sobreviva y posiblemente se replique dentro de este nicho. De hecho sabemos que Salmonella permanece en los linfocitos B por largos periodos de tiempo, cuantificamos bacteria tanto en linfocitos B de bazo como de médula ósea hasta los 60 días post-infección, más aún detectamos la presencia de la bacteria en estas células de ratones infectados hasta 150 días post-infección (datos no mostrados). La ausencia de su reconocimiento por los linfocitos T citotóxicos puede explicar la permanencia de la bacteria en las células B de manera crónica. En este punto haría falta identificar la expresión de moléculas de coestimulación en linfocitos B infectados (6, 30), así como la vía de procesamiento de Salmonella que utilizan estas células in vivo. 31

43 La médula ósea es un órgano hematopoyético, pero ya no es considerada solamente como tal, sino también como un órgano linfoide secundario, al cual arriban linfocitos B que se activaron después de su interacción con las células T en centros germinales y llegan a médula ósea a terminar su diferenciación hacia células plasmáticas productoras de anticuerpos (31, 32, 33, 34). Más aún se ha descrito que linfocitos T activados y de memoria migran a médula ósea y son capaces de responder contra antígenos provenientes de sangre y tener una respuesta efectora en este órgano (35). Hay reportes que indican que la médula ósea se infecta con Salmonella typhi durante la fiebre tifoidea en humanos (36, 37, 38). De hecho, el mielocultivo es más sensible que el hemocultivo para detectar la infección con Salmonella typhi, a pesar del tiempo de enfermedad o el tratamiento con antibióticos (36, 39). De acuerdo con estos reportes, nosotros describimos que en la infección in vivo en ratón encontramos Salmonella typhimurium en linfocitos B tanto de bazo como de médula ósea (19). La presencia de linfocitos B infectados con Salmonella en médula ósea puede llevar a la infección y destrucción de células progenitoras (40). Las células madre hematopoyéticas son resistentes a la infección bacteriana porque no tienen los receptores y mecanismos de internalización para la adquisición de bacteria; sin embrago, las células parcialmente diferenciadas, incluyendo progenitores linfoides poseen estos mecanismos y pueden infectarse (40). De acuerdo con esto encontramos a todos los progenitores de células B infectados con Salmonella. El primer estadio de maduración que analizamos fue de células pre-pro-b. Esta población parece ser más vulnerable a la infección con Salmonella que los demás precursores. Al inicio de la infección encontramos una dramática disminución en el número de estas células, seguida de la recuperación de los números en días posteriores. Esta disminución inicial puede deberse a muerte de las células inducida por Salmonella, y la recuperación de esta población puede ser un efecto compensatorio donde se favorece la ontogenia de células B. La población de las células pro-b, el siguiente estadio de maduración, se pierde con la infección, de manera que no fue posible seguir una cinética de infección en estas células. La pérdida de esta población pudiera deberse a la inducción de su maduración, esta suposición se apoya además en el hecho de que en el último estadio de maduración, que corresponde a las células B inmaduras, observamos un incremento del 32

44 200% en el número de éstas. Este sustancial incremento de células inmaduras concuerda con un incremento de 2 logaritmos en la carga bacteriana proveniente de estas células. Pensamos que si Salmonella indujera muerte celular en estos progenitores, observaríamos también una disminución en las células B inmaduras, más aún cuando hay una aparente multiplicación de la bacteria. Esto nos lleva a sugerir que en estas poblaciones Salmonella pudiera no estar induciendo muerte, sino una aceleración de la maduración. En este contexto, se ha reportado que la señalización a través del receptor tipo Toll (TLR) 4 en precursores tempranos de células B promueve la maduración de células B (41). De acuerdo con esta evidencia, los precursores de células B de ratones infectados pueden estarse diferenciando en respuesta al estímulo mitogénico (LPS), y el incremento que observamos en el número de células B inmaduras podría entonces resultar de proliferación dependiente de TLR-4. Como describimos anteriormente, la médula ósea, además de progenitores de células B, contiene linfocitos B näive que migraron de bazo (42). También encontramos a estas células infectadas con Salmonella. Sabemos que los linfocitos B de bazo se infectan con Salmonella, éstos podrían viajar a médula ósea transportando la bacteria y por consiguiente ser los responsables de su diseminación causando la infección que observamos en los precursores analizados. La activación de los linfocitos B lleva al desarrollo de células productoras de anticuerpo, también llamadas células plasmáticas (31, 33). Cuando se activan los linfocitos B y comienzan su diferenciación en el centro germinal de los folículos linfoides secundarios, pueden migrar a médula ósea, donde perfeccionan su diferenciación hacia células plasmáticas (31, 34). Encontramos células plasmáticas infectadas con Salmonella en médula ósea así como en bazo. Al inducir su diferenciación, comprobamos que los linfocitos B infectados con Salmonella son capaces de convertirse en células plasmáticas. Sorprendentemente la bacteria no interfiere con la función efectora de los linfocitos B. Sugerimos que el mecanismo de invasión podría ser el siguiente. En bazo se infectan los linfocitos B con Salmonella, algunos de estos linfocitos B migran a médula ósea como células B näive y diseminan la infección en este órgano causando que la bacteria invada progenitores de células B causando de manera colateral su pronta maduración y desarrollo; por otro lado, otras células B de bazo infectadas con Salmonella 33

45 se activan, comienzan su proceso de diferenciación y migran a médula ósea donde terminan de transformarse en células plasmáticas. Falta abordar la capacidad de estas células plasmáticas infectadas de producir anticuerpos. Una interrogante que queda es el mecanismo mediante el cual el linfocito B internaliza a Salmonella. Con respecto a este punto, recientemente Souwer et al. (43) reportaron que linfocitos B de humano internalizan a Salmonella a través de su receptor de célula B (BCR). Sin embargo estos datos deben tomarse con cautela debido a que el modelo que estos autores utilizan no se asemeja a la infección natural. Utilizan una línea celular de linfocitos B humanos, los cuales se cultivan en presencia de Salmonella typhimurium opsonizada con un anticuerpo tetramérico que consta de dos especificidades, una reconoce IgM y la otra antígenos de la bacteria. Como la fracción!-igm se une al BCR de los linfocitos B y esto conlleva a la internalización de Salmonella, los autores concluyen que se requiere el reconocimiento de la bacteria por el BCR para posteriormente endocitarla. Pero estos datos no demuestran que sólo las clonas de linfocitos B específicas para antígenos de Salmonella se infecten con esta bacteria. Nosotros no negamos que los linfocitos B que tienen un BCR específico para Salmonella utilicen este mecanismo para internalizarla, no obstante pensamos que la bacteria es capaz de infectar clonas de linfocitos B no específicas para Salmonella a través de otro mecanismo. En nuestro grupo hemos observado que en linfocitos B Salmonella induce su internalización a través de macropinocitosis (datos no publicados), de la misma manera que lo hace en macrófagos, este mecanismo es independiente del BCR y aunque no hemos investigados si este evento ocurre en los precursores de células B, pensamos que podría explicar la internalización de la bacteria en células inmaduras que aún no expresan BCR. En este trabajo encontramos que Salmonella inhibe su presentación en moléculas de MHC-I por un lado, y por el otro no afecta el efecto biológico del linfocito B. Esto puede facultar a la bacteria para pasar desapercibida por el sistema inmunológico, permitiendo la función normal de su célula blanco y así sobrevivir por largos periodos de tiempo dentro de su huésped. 34

46 Conclusión. El linfocito B es un nicho de sobrevivencia de Salmonella. Dentro de éste la bacteria permanece en una vacuola que no se remodela y tiene características de fagolisosoma tardío, rico en moléculas de MHC-II. El linfocito B es incapaz de inducir una respuesta por parte de las células T citotóxicas, de manera que Salmonella permanece imperceptible al sistema inmunológico. Además los precursores de linfocitos B de médula ósea se infectan con Salmonella y son inducidos a madurar. La función efectora de los linfocitos B no se ve afectada por la infección, pues son capaces de convertirse en células plasmáticas. 35

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53 ARTICLE IN PRESS Microbial Pathogenesis xxx (2009) 1 5 Contents lists available at ScienceDirect Microbial Pathogenesis journal homepage: www. elsevier.com/locate/micpath Short communication B cell precursors are targets for Salmonella infection Denisse Castro-Eguiluz a,d, Rosana Pelayo b, Victor Rosales-Garcia f, Roberto Rosales-Reyes c,e, Celia Alpuche-Aranda c, Vianney Ortiz-Navarrete a, * a Departamento de Biomedicina Molecular, Centro de Investigación y de Estudios Avanzados (CINVESTAV), México, D.F., Mexico b Unidad de Investigación Médica en Enfermedades Oncológicas, Centro Médico Nacional Siglo XXI, Mexico, D.F., Mexico c Departamento de Medicina Experimental, Facultad de Medicina UNAM-HGM, México, D.F., Mexico d Departamento de Inmunología, Escuela Nacional de Ciencias Biológicas, IPN, México, D.F., Mexico e Unidad de Investigación en Enfermedades Oncológicas, Hospital Infantil de México Federico Gómez. México, D.F., Mexico f Unidad de Citometría Flujo, Centro de Investigación y de Estudios Avanzados (CINVESTAV), México, D.F., Mexico a r t i c l e i n f o abstract Article history: Received 24 February 2009 Received in revised form 7 April 2009 Accepted 9 April 2009 Available online xxx We previously reported that, in mice, B cells are a reservoir for bacteria during Salmonella infection. Here, we show that, within the bone marrow, B cells and their precursors are targeted for infection by Salmonella enterica serovar typhimurium. Our data suggest that B cells within the bone marrow may be a bacterial niche during chronic Salmonella infection. Ó 2009 Elsevier Ltd. All rights reserved. Keywords: Salmonella B cells Bone marrow Progenitors 1. Introduction The bone marrow is no longer considered simply a hematopoietic organ, but also a secondary-like lymphoid organ. Activated B cells migrate to this vital compartment following T cell interactions within germinal centers and terminally differentiate to antibodysecreting plasma cells [1,2]. Moreover, memory and activated T cells are known to migrate to the bone marrow, where T cell priming against blood borne antigens can take place [3]. Recent findings indicate that the bone marrow becomes infected by Salmonella typhi during typhoid fever. In fact, bone marrow cultures are more sensitive to detecting Salmonella infection than blood cultures regardless of the duration of illness and antibiotic treatment [4,5]. We have previously shown that splenic B cells are invaded during in vivo murine infection [6], making it highly likely that Salmonella-infected B cells may also be found in the bone marrow. * Correspondence to: V. Ortiz-Navarrete, Departamento de Biomedicina Molecular, Centro de Investigación y de Estudios Avanzados (CINVESTAV), Av. IPN No. 2508, Colonia San Pedro Zacatenco, Delegación Gustavo A. Madero, México, D.F. C.P , Mexico. Tel.: þ ; fax: þ address: vortiz@cinvestav.mx (V. Ortiz-Navarrete). 2. Results and discussion To determine the persistence of Salmonella within B cells, Balb/c mice were infected with Salmonella typhimurium. At 3, 5, 15, 30, and 60 days post-infection, splenic B cells and monocytes were purified, lysed with 10% Triton X-100, and plaqued in SS agar to quantify viable bacteria. The extent of Salmonella that was recovered from B cells was comparable to that from monocytes (Fig. 1A). In fact, an infection lasting 60 days was observed in both cell populations. Analysis of longer time points following infection was not performed due to the high mortality index seen by day 60. As part of its infection process, invasive Salmonella has been reported to induce apoptosis in macrophages, allowing the pathogen to avoid the bactericidal mechanisms that macrophages so efficiently perform [7]. Measurement of the total number of B cells in the spleen of infected mice at the same post-infection time points showed no substantial differences between infected and non-infected animals (Fig. 1B), suggesting that cell death due to Salmonella infection is either too little to detect or that population dynamics is fast in this particular model. To investigate whether infected B cells may be found in the bone marrow, we infected Balb/c mice with GFP-expressing Salmonella. Within the total bone marrow, infected CD19 þ B cells constituted 1.25%, infected CD11b þ myeloid cells made up 1.73%, /$ see front matter Ó 2009 Elsevier Ltd. All rights reserved. doi: /j.micpath Please cite this article in press as: Castro-Eguiluz D, et al., B cell precursors are targets for Salmonella infection, Microbial Pathogenesis (2009), doi: /j.micpath