11 knúmero de publicación: kint. Cl. 7 : C12N 5/06

Transcripción

1 k 19 OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPAÑA 11 knúmero de publicación: kint. Cl. 7 : C12N /06 C12N 7/00 //A61K 39/12 12 k TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA T3 86 knúmero de solicitud europea: k Fecha de presentación: k Número de publicación de la solicitud: k Fecha de publicación de la solicitud: k 4 Título: Línea celular de ovario bovino (FROv) para la multiplicación de virus. kprioridad: DE k Titular/es: Aventis Behring Gesellschaft mit beschränkter Haftung Postfach Marburg, DE k 4 Fecha de la publicación de la mención BOPI: k 72 Inventor/es: Bernhardt, Dieter k 4 Fecha de la publicación del folleto de patente: k 74 Agente: Tavira Montes-Jovellar, Antonio ES T3 Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas). Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, Madrid

2 ES T3 DESCRIPCION Línea celular de ovario bovino (FROv) para la multiplicación de virus La invención se refiere a una línea celular de ovario bovino (FROv), a un procedimiento para su preparación y a su uso para la multiplicación de virus. Para la producción de proteínas y antígenos virales se requieren células vivas. De acuerdo con el estado del conocimiento se utilizan para esto cepas de células diploides o líneas celulares permanentes, siempre que resulten adecuadas para la producción de las proteínas o antígenos virales deseados. Asimismo, es sabido que, en general, las cepas celulares diploides son más sensibles a la mayor parte de los tipos de virusquelaslíneas celulares permanentes, por lo que para la multiplicación de una serie de tipos de virus son especialmente adecuadas. Las líneas celulares permanentes, sin embargo, presentan frente a las cepas celulares diploides la ventaja de poseer un crecimiento ilimitado, es decir, están inmortalizadas. En amplios intervalos de pasaje, estas líneas celulares permanentes tienen propiedades constantes en relación con la multiplicación de células y antígenos, dado que en ellas no se produce la diferenciación celular que tiene lugar en las cepas celulares. Además del período de vida limitado (número de pasajes) de las cepas celulares diploides, existe otro inconveniente importante, cual es que los órganos que se requieren para la obtención de cepas celulares diploides no siempre están disponibles en cantidades suficientes y en el momento necesario. Adicionalmente, el material de partida, los órganos, puede estar contaminado de forma latente (virus, microplasmas, bacterias), motivo por el que no se garantiza una producción de antígenos reproducible de manera óptima. Por estos múltiples problemas, se comprende el esfuerzo de utilizar líneas celulares permanentes para la producción de virus, antígenos virales, así como su detección (titulaciones). Asimismo, se han establecido ya líneas celulares permanentes procedentes de ganado bovino, tales como por ejemplo, MDBK, DBK, Aubeck (células renales bovinas) o células de las glándulas suprarrenales bovinas. El inconveniente de estas líneas celulares es, sin embargo, que sólo permiten la multiplicación de unos pocos tipos de virus, tales como IBR-, PI 3,BAVdelTipo1ó 2, o que, en parte, están contaminadas con agentes extraños y por lo tanto no se les puede aprovechar de manera óptima para la producción comercial de antígenos. Objeto de la invención es una linea celular permanente a partir de ovarios bovinos fetales, en la cual, sorprendentemente, se puede Multiplicar una pluralidad dé tipos de virus tales como adenovirus bovinos (BAV): tipo 1, 3, 4,, 6, 7, 8; virus de la parainfluenza (PI): tipo 3; virus sincitial respiratorio bovino (BRSV); virus herpes bovino: tipo 1, 4; virus herpes equino: tipo 1; virus de la enfermedad de la mucosa: cepa Ug9; parvovirus bovino: cepa Haden. Esta línea celular resulta adecuada tanto para la producción de antígenos virales como para la detección dé virus. Establecimiento de la línea celular de ovarios bovinos fetales (FROv) Inicio 4 0 En el matadero de Marburg, con fecha , se extrajeron los ovarios, bajo condiciones estériles, de un feto de aproximadamente 7 meses de edad de una vaca de coloración negra. Los ovarios se trituraron y se disgregaron las células individuales a TA con tripsina. Tras finalizar el tratamiento con tripsina, se centrifugó la suspensión celular, se volvió a suspender (lavar) el sedimento celular en Medio Esencial Mínimo de Eagle (EMEM) y se volvió a centrifugar. Cultivo de células El sedimento celular lavado y centrifugado se recogió en EMEM + SBF al % + antibióticos Neomicina (base pura) 0,262 g/l Estreptomicina (base pura) 0,26 g/l y Penicilina 0,1212 g/l; (NSP) en relación 1:0 y se sembró en frascos T0 (Compañía Greiner, Art. n 690 1). Cultivo celular hasta el pasaje 3 Las células FROv se cultivaron hasta el pasaje 3 en EMEM + SBF al % + NSP. Después del 2

3 ES T3 crecimiento en densidad, los cultivos se transformaron en 1: (aprox. 4-6 días). Durante los pasajes celulares, el cultivo se modificó desde un tipo mixto de células (fibroblastos, células poligonales) a un tipo de células poligonales más uniforme. Cultivo celular tras el pasaje 3 Las células FROv se continuaron cultivando en pasajes de tres formas diferentes (ramas A, B y C): La rama A de las células FROv se cultivó con EMEM + SBF al % + (NSP) hasta el pasaje 6.El índice de división fue de 1: hasta 1:7. El pasaje se depositó bajoelnúmero de depósito DSM ACC1 en la DSM - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares) GmbH, Mascheroder Weg 1 B, 30 Braunschweig. A partir del pasaje 6 se efectuó el ensayo de identidad de especie por medio de un patrón de isoenzimas. Resultado: Especie bovina. La rama B se multiplicó a partir del pasaje 3 con EMEM + SBF al 2, % + suero equino al 2, % + NSP. En los pasajes 4 y1 se congelaron las células FROv en líquido. En este momento, las células FROv de la rama B se encuentran en el pasaje.elíndice de división ascendió a 1: hasta 1:. La rama C de las células FROv se estableció a partir del pasaje 1 de la rama B, tras el almacenamiento de las células en N, líquido. Tras descongelar la suspensión celular, se cultivaron las células durante cuatro pasajes. Del pasaje se estableció unmaterialdecélulas maestro (MCS). Para ello, la suspensión celular se ajustó a1,8x 6 células/ml y se envasó en ampollas de teflón de 1,0 ml, almacenándolas en NZ líquido. En el MCS se analizó la esterilidad y la ausencia de microplasmas yvirusextraños. Resultado: el MCS es estéril y está libre de microplasmas y virus extraños. 8días después de la congelación del 4CS se extrajo una ampolla desde el N2 líquido, se descongeló ysesembró en una placa de cultivo de ml de la Compañía Greiner, Art. n , en medio de cultivo y se cultivó para posteriores pasajes a 37 C. El cultivo de las células FftOv en la rama C se realizó en EMEM + SBF al 2, % + suero equino al 2, % + NSP. El cultivo de las células FROv aquí indicado se ofrece a modo de ejemplo. También es posible el cultivo de células en otros medios experimentados (tales como DMEM, TCM199) y con diferentes sueros (suero de ternero, suero de ternero recién nacido, suero de oveja) entre 1 y %. Comprobación de la multiplicación viral en células FROv (rama B) 4 A partir del pasaje 69,seensayó la sensibilidad de la línea celular FROv, rama B, frente a los siguientes tipos de virus: Adenovirus bovinos: Tipo 1, 3, 4,, 6, 7, 8 0 Virus de la parainfluenza: Tipo 3 Virus sincitial respiratorio bovino (BRSV) Virus herpes bovino: Tipo 1, 4 Virus herpes equino: Tipo 1 Virus de la enfermedad de la mucosa (MDV): Cepa Ug9 Parvovirus bovino: Cepa Haden 3

4 ES T3 Ejemplo 1 Cultivos celulares FROv crecidos en densidad (frascos T0, Cía. Greiner) se cambiaron a EMEM + NSP con el fin de separar el medio de cultivo que contenía suero. A continuación, se infectaron los cultivos con los citados tipos de virus en medios exentos de suero. Con Parvovirus bovino, la infección se produjo ya después de un crecimiento del cultivo de 70-80%. A modo de controles, se utilizaron tres cultivos no infectados en este ensayo de infección. Después de 3- días, los cultivos infectados mostraron, en función del tipo de virus, un efecto citopatógeno, específico del virus. En la células FROv había tenido lugar una multiplicación viral. Por el contrario, los cultivos de control, no infectados, mostraron césped de células cerrado e inalterado. Ejemplo Para comprobar la síntesis de virus de la línea celular FROv en los diferentes pasajes, se infectaron con la cepa Ug9 de BVD los pasajes de las células FROv señalados en la Tabla siguiente. En la infección se procedió de la misma forma que en el Ejemplo 1. Los resultados aparecen en la Tabla siguiente. Multiplicación de la Ug9 de BVD en la línea celular FROv en distintos pasajes Pasaje de las células Cosecha de virus en Título de virus en FROv días después de la células FRLu 4/ml de infección la cosecha de virus x ) 6.1 ) valor medio geométrico 4 0 Con fines comparativos, se analizó la multiplicación de la cepa Ug9 de BVD en células diploides FRLu4, estableciéndose de esta forma los datos que aparecen a continuación: Pasaje de las células Cosecha de virus en Título de virus en FRLu días después de la log en células FRLu infección 4/ml de la cosecha de virus 4, , 8 6,7,6 4,3 11 3,8 11,6 x,9 4

5 ES T3 Resumen de resultados: Tal codo se desprende de los resultados en las dos Tablas, la cantidad de antígeno BVb producido (infectividad) en ambos sistemas celulares es comparable. Ejemplo 3 Con el objetivo de analizar la sensibilidad viral de las células FROv, se titularon comparativamente cosechas de virus BVD cepa Ug9 en células FRLu 4 y en células FROv. La determinación del título de infectividad se efectuó como doble titulación. Titulación comparativa de BVD-Ug9 en células FROv y FRLu Cosecha de virus Título en log/ml en Título en log/ml en células FROv células FRLu 4 1,3,6 2 6,3 6, 3,8,7 4,6,8,0,6 6,3,3 7 6,0 6,7 8,4,4 9,1,3,1,1 11,6,8 12,3,6 13,,3 14,1,6 1,2,8 16 1,3 1,7 x,2,4 Resumen: Como muestran estos ensayos comparativos, en la detección del virus- BVD, la célula FRLu-4 sólo es insignificantemente más sensible que la línea celular FROv. 4 0

6 ES T3 REIVINDICACIONES 1. Línea celular permanente de ovarios bovinos fetales, con las propiedades, incluida la sensibilidad viral, de la línea celular depositada bajo el número DSM ACC01 en la Deutsche Sammlung für Mikroorganismen (DSM = Colección Alemana de Microorganismos). 2. Línea celular según la reivindicación 1, depositada en la DSM bajo el número DSM ACC Línea celular según la reivindicación 1, con las características de crecimiento de la línea celular según la reivindicación Línea celular según la reivindicación 1, caracterizada porque sobre la misma se pueden multiplicar adenovirus bovinos (BAV) Tipo 1, 3, 4,, 6, 7; 8, virus de la parainfluenza (PI) Tipo 3, Virus sincitial respiratorio bovino (BRSV), virus herpes bovinos Tipo 1, 4, virus herpes equino tipo 1, virus de la enfermedad Cepa Ug9 o el parvovirus bovino, cepa Haden.. Uso de una línea celular según la reivindicación 1 para producción de antígenos virales NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva del art del Convenio de Patentes Europeas (CPE) y a la Disposición Transitoria del RD 2424/1986, de de octubre, relativo a la aplicación del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a España y solicitadas antes del , no producirán ningún efecto en España en la medida en que confieran protección a productos químicos y farmacéuticos como tales. Esta información no prejuzga que la patente esté onoincluída en la mencionada reserva. 6