Fingerprinting 1. Se analizara solo un tipo. Un marcador dominante que hace algunos años fue muy utilizado RAPD (AFLP). 2. Ir a Carpeta Fingerprinting. Buscar archivo Prueba 1. 3. Abrirlo y observar cómo se encuentran los datos y la información que en él se encuentra. 4. Luego ir a carpeta RAPDDIST y abrir el ejecutable RAPDDIST que trabaja en formato DOS bajo el sistema de programación FORTRAN. 5. El programa le mostrará una ventana DOS donde le pregunta el nombre del archivo a meter introducir el nombre RAPDDIST.DAT, luego le preguntara el nombre del archivo de salida, que será RAPDDIST.OUT. A continuación verá un cuadro con la siguiente información. 6. Cambiar a realizar el cálculo de frecuencias génicas con la corrección de Lynch and Milligan, colocando primero una L y luego indicándole al programa que sí. 7. Luego PROCEED y luego Y 8. Observe el archivo de salida que se llamará RAPDDIST.OUT. 9. Ahora, regrese a la carpeta fingerprinting y abra la carpeta RAPDFST. 10. En esa carpeta encontrará el ejecutable RAPDFST, al abrirlo encontrará de nuevo un ventana en DOS. 11. Ingrese el nombre del archivo RAPDFST.DAT y del archivo de salida RAPDFST.OUT tal como lo realizó con anterioridad. Observe la información del archivo de salida. 12. Ahora realice ambos análisis para la matriz prueba1.
13. Discuta el significado de los resultados que observa. 14. Existen otros programas como TFPGA (aloenzimas, AFLP, RAPD, calcula valores de semejanza genética y Test de mantel), GDA, Hickory (cálculos de FST en dominantes y condominantes enfoque bayesiano), entre otros. TFPGA GDA
Secuencias y alineación Bioedit, PhyDE (Phylogenetic Data Editor) Entrar al siguiente sitio: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/ 1. En el espacio en blanco colocar el término de su búsqueda. Por ejemplo, ITS2 CUCURBITA PEPO 2. Saldrá una ventana, escoger Nucleótido. Ver cuantas secuencias indica que encontró. Entrar en esa opción y revisar cada secuencia que muestra.
3. Ahora en lugar de poner palabras de búsqueda, poner el número de Acceso: (Accession number) AF013344.1 4. Que observa? Puede indicar la información que se obtuvo. 5. En la parte superior izquierda hay una opción que dice FASTA. Hacer un click sobre ella. 6. Abrir un archivo de notepad. Marcar el texto que aparece en internet para la secuencia y pegarlo en el archivo notepad. Debe quedar de la siguiente forma. >gi 3220133 gb AF013344.1 Cucurbita pepo clone 1 internal transcribed spacer 2, complete sequence ATCGCTGCCCCCACATGCAACACCCACTCGAGTTTGTTGCATTTGCGGGGGCACATGTTGGCCTCCCGTG TGCACCGTCGCATGGATGGCTTAAAATTGAGTCCTCGGCATCTGTTGTCGTGACACTACGGTGGTTGATT CAACCTCGGTACTGCGTCTCGACCTCAGCTTGCGTGCCTCCTCTTTGTGAGCGAGGCAAGGATCTCTTAT TTTGACCCTTTGAACATTGTCCCCAAAGACGATGCTCTCGAC 7. Luego en archivo dar guardar como y colocar de nombre Cucurbita pepo. 8. Regresar de nueva a la página de búsqueda o realizar una nueva búsqueda. Colocar Amanita ITS2, verán muchas secuencias y todas diferentes. Buscaremos con números de acceso específicos. Unir con secuencias en archivo en carpeta Amanita. AY278766 AY278764 AY278767 AF085490 AY325836 AY325829 AF124701 AY320380 AY312987 AJ419191 9. Bajar y colocar en Notepad la información de cada secuencia. Agregar estas secuencias con las ya existentes en el Folder amanita. 10. Ahora buscaremos otro marcador molecular. Buscaremos un mitocondrial. Colocar CANIS LUPUS Aggarwal y escoger 10 secuencias que digan específicamente ribosomal RNA gene, partial sequence; mitocondrial.. 11. Abrir las secuencias de amanita en Bioedit: (http://www.mbio.ncsu.edu/bioedit/bioedit.html)
12. Observar si puede encontrar algún patrón. 13. Abrir el siguiente sitio: http://www.ebi.ac.uk/tools/services/web_clustalw2/toolform.ebi De Clustal W. Este es un programa on-line que realize alineaciones automaticas. 14. Cambiar a la opción ADN. En Chose file buscar el sitio donde se guardo la secuencia y agregarla, darle buscar.
15. Esperar un tiempo hasta que salga la ventana con el alineamiento 16. Observe, las secuencias y los bloques que forman. Puede observar algún patrón? 17. Qué puede indicarnos, los bloques de secuencias similares y los espacios sin secuencias? Grabar el archivo 18. Ahora veremos las secuencias de ADN mitocondrial de Cannis. 19. Observar las secuencias y sus patrones. necesita de mucho proceso de alineación? 20. A qué cree que puede deberse esto? Análisis filogenéticos y estadísticos genéticos. Estadísticos genéticos (DNAsp, Dnaman, Arlequin). 1. Entrar a la carpeta de DNAsp y hacer click sobre el icono dnasp4. 2. Luego file, open data y en la misma carpeta escoger COII_Apes. Aparecerá una ventana con información darle Ok. 3. En la ventana principal vera en la pestaña algunos iconos, le da a la i y obtendrá la misma ventana inicial con información del archivo que acaba de abrir. 4. Le da al icono actg y obtendrá una visualización de sus secuencias señalando las diferencias.
5. Las tijeras que abren un cuadro para quitar secuencias. 6. Los cuadritos donde se pueden formar grupos en las secuencias o ver los existentes 7. El filograma que da un análisis rápido de la diversidad haplotipica. 8. Luego en Data escoger código genético, ahí mismo se puede escoger en que posición empezar a leer el marco de lectura, que secuencias incluir y cuales excluir y como considerar los gaps. 9. En analysis, se podrán ver toda una serie de análisis importantes para entender las secuencias. 10. En polymorphic sites, le dará información de los singletons cambios de uno, dos o tres diferencias y los sitios parsimoniosos. 11. En DNA polymorphism encontrará información general de la diversidad en las secuencias. 12. DNA diversity between population, da información acerca de la diferencia nucleotidica entre grupos previamente formados 13. Recombination, da información de las posiciones nucleotidicas donde se considera que puede existir recombinación 14. D de Tajima y Fu & li test de neutralidad, sirve para darnos una idea de la neutralidad del marcador y su posibles acontecimientos demográficos. Si significativo puede indicar selección. 15. Generate, haplotype diversity, nos indicará cuantos y quienes conforman cada haplotipo. 16. Ahora tome sus secuencias alineadas de hongos o de Canis y analícelas. 17. En File, escoger Save/export data as y escoger NEXUX format Análisis filogenéticos. (PAUP DOS, Winclada, TNT, Mr.Bayes) PAUP 1. Haber pasado previamente el archivo de secuencias a un formato nexus. 2. Click en consola de Paup para trabajar en modo DOS. 3. Execute prueba1.nex; 4. Para meter información en un archivo log start file = practice.log; 5. Si se desea detener log stop;
6. Para resumir datos. Cstatus; Para obtener información taxa, tstatus; 7. Para búsqueda de arboles en Neighbor Joinning. Set criterion = distance; Dset distance = k2p; Showdist; Nj; 8. Al finalizar de teclear esto, debera producirse un árbol. 9. Si se desea árbol en parsimonia. Set criterion= parsimony 10. Hsearch addseq= random 11. Showtrees; par aver los arboles producidos. Winclada 1. Ir a la carpeta de Winclada y apachar sobre el Icono que parece un arboli Amarillo. 2. Luego escoger File, Open File y buscar y escoger el archivo. Funciona con archivos nexus producidos por otros programas. 3. Ir a analyze y escoger el método de búsqueda que mas se adecue a los datos. Heuristico, rachet, exhaustivo. 4. Observe el árbol producido. En los iconos de la parte superior, escoger los dos primeros para observar la homoplasias y limpieza de los datos.
Observar los valores de longitud del árbol L, Índice de consistencia (CI) y de homoplasia. Analice e interprete los resultados.