Macroscopic and microscopic approaches toward bacterial adhesion

Transcripción

1 Resumen El uso de modelos físico-químicos para explicar la adhesión microbiana sobre superficies ha tenido éxito para un número limitado de cepas y especies (Capítulo 1), debido en parte a la naturaleza macroscópica de los datos experimentales de que se dispone (es decir, potencial zeta y ángulos de contacto). En general, desde el punto de vista físico-químico, se han asimilado los microorganismos a partículas inertes de poliestireno. Ahora bien, los microorganismos no son partículas lisas, sino que, a diferencia de las de poliestireno, poseen ciertas estructuras finas y largas que se extienden desde su superficie hacía el liquido circundante. Sin embargo, hasta el momento, permanece sin identificarse para la mayoría de las cepas de bacterias la función específica realizada por tales estructuras en los procesos de adhesión microbiana, así como su influencia en las propiedades físico-químicas macroscópicas de las superficies celulares. En consecuencia, las medidas relevantes desde el punto de vista físico-químico de la superficie microbiana, precisan de una resolución microscópica que no puede lograrse con la mayoría de los métodos tradicionales. La introducción del Microscopio de Fuerza Atómica (AFM) y su

2 108 Macroscopic and microscopic approaches toward bacterial adhesion aplicación a las superficies biológicas ha abierto un nuevo camino para poder tener acceso a las propiedades físico-químicas microscópicas de las superficies bacterianas. Iniciamos esta tesis con la intención, a largo plazo, de desarrollar una nueva teoría que permita explicar la adhesión microbiana a superficies, la cual habrá de tener en cuenta interacciones complejas (como pueden ser la heterogeneidad en las distribución superficial de cargas o los enlaces macromoleculares) que no han sido consideradas en la teoría de DLVO. Más concretamente, los objetivos de esta tesis han sido caracterizar microscópicamente las propiedades físico-químicas de las superficies bacterianas y dilucidar si tales propiedades microscópicas pueden amalgamarse -y cómo- en propiedades macroscópicas de la superficie celular y relacionarse con la adhesión observada macroscópicamente de las bacterias a los substratos sólidos. Se ha completado la caracterización macroscópica de una colección de nueve cepas de Streptococcus mitis, de las que se disponía de su hidrofobicidad superficial, determinada mediante medidas de ángulos de contacto con agua, y su composición química superficial, por espectroscopia de rayos X de fotoelectrones (XPS), con la evaluación de su deformabilidad electroforética y su densidad de carga fija asociada a la capa de polielectrólitos de las cepas de S. mitis, generalmente portadores de largos fibrilos distribuidos de modo poco denso, utilizando el análisis de partículas deformables para las medidas de la movilidad electroforética en función de la fuerza iónica (Capítulo 2). En general, la superficie celular de S. mitis es electroforéticamente deformable, con densidad de carga fija negativa. Sin embargo, la comparación con otras cepas de bacterias que han sido descritas como deformables, indica que la teoría de Ohshima no permite obtener información sobre las características morfológicas de la superficie que provocan su deformabilidad. La razón más probable es que el flujo electroosmótico tiene lugar solo en la región más externa de las gruesas capas extracelulares. A pesar de ello, la determinación de la deformabilidad superficial es esencial para una correcta caracterización de la electrostática de la superficie celular. Para realizar los experimentos de AFM es preciso anclar con suficiente fuerza las bacterias a un sustrato, de modo que sean capaces de resistir la fricción ejercida por la punta de nitruro de silicio. Pero para caracterizar las propiedades físicoquímicas de la superficie de los microorganismos es preciso que dicha inmovilización no afecte ni a la integridad química ni estructural de la superficie celular. Existen varias estrategias, descritas en la bibliografía, para la inmovilización de bacterias. En el Capítulo 3 se presenta la comparación de la fuerzas de interacción determinadas por AFM entre Klebsiella terrigena y nitruro de silicio obtenidas empleando tres métodos comunes de inmovilización: bloqueo mecánico de las bacterias en filtros, adsorción física de bacterias cargadas negativamente sobre superficies cargadas positivamente y fijación de las bacterias con glutaraldeido a la punta de la sonda del microscopio AFM. Se ha puesto de manifiesto que métodos diferentes de preparación de las muestras conducen a fuerzas de interacción disimilares. La adsorción física de las bacterias sobre

3 Resumen 109 sustratos modificados puede provocar reordenamientos estructurales en la superficie celular, mientras que se considera que el empleo de glutaraldeido induce cambios en las propiedades físico-químicas y mecánicas de la superficie bacteriana. En general, el método de inmovilización mediante el bloqueo mecánico de bacterias individuales en filtros parece ser el más adecuado. Una vez establecido el método más idóneo para la inmovilización de las bacterias de cara a su estudio por AFM, se ha realizado un análisis detallado de las fuerzas de interacción entre la punta de nitruro de silicio de la sonda del microscopio AFM y la superficie de nueve cepas de la bacteria S. mitis. El Capítulo 4 es un primer intento de correlacionar las propiedades microscópicas y macroscópicas de la superficie bacteriana. Es interesante el hecho de haber podido relacionar las características particulares de las curvas fuerza-distancia de modo que se ha logrado obtener relaciones entre las propiedades microscópicas y macroscópicas, aunque no se haya conseguido dar una justificación completa sobre el origen de estas relaciones. En el Capítulo 5 hemos tratado de correlacionar la adhesión microscópica de las cepas de S. mitis a la punta, hidrófila y cargada negativamente, de nitruro de silicio de un AFM con su adhesión macroscópica a vidrio, hidrófilo y cargado negativamente, empleando una cámara de flujo plano-paralela. Se ha encontrado que la fuerza repulsiva observada al aproximar la sonda del AFM a la superficie de la célula se corresponde con una barrera de activación que gobierna la adhesión macroscópica inicial de los microorganismos a la superficie del vidrio. Además, se ha encontrado que la distancia máxima a la que se han detectado las fuerzas atractivas al alejar la sonda del AFM está relacionada con el área bloqueada por cada bacteria adherida, es decir, con la distancia entre bacterias adheridas. La desorción de las bacterias no ha sido posible relacionarla con la fuerza adhesiva determinada con AFM, posiblemente por las diferencias en la naturaleza de los procesos que se llevan a cabo en la cámara de flujo plano-paralela y la separación forzada en el AFM. La desorción de microbios había sido estudiada in situ en función del tiempo de residencia de los microorganismos sobre la superficie en dispositivos de flujo controlado (Meinders et al., 1994), encontrándose una disminución muy importante de la desorción de Streptococcus thermophilus después de transcurridos aproximadamente 50 s de la adhesión inicial, proponiéndose que podría estar relacionada con el fortalecimiento del enlace al aumentar el tiempo de contacto entre la bacteria y el sustrato. En el Capítulo 6, se ha corroborado microscópicamente el efecto del tiempo de contacto sobre la intensidad del enlace entre la superficie de S. thermophilus y la punta de nitruro de silicio del AFM y se ha relacionado con la dependencia de la desorción en condiciones de flujo con el tiempo de residencia de las bacterias sobre la superficie. Los experimentos de AFM han puesto de manifiesto un fortalecimiento del enlace entre la sonda y la superficie de la célula tras 100 s de contacto, tiempo del mismo orden de magnitud que el inferido del estudio de la desorción en función del tiempo de residencia sobre la superficie. Además, la comparación entre las energías de interacción obtenidas por

4 110 Macroscopic and microscopic approaches toward bacterial adhesion AFM y de la desorción macroscópica parece indicar que el fortalecimiento del enlace está debido a la adhesión de múltiples polímeros extracelulares a la superficie del sustrato. Esta generalmente aceptado que la hidrofobicidad de la superficie bacteriana, habitualmente determinada depositando gotas de agua sobre una capa de bacterias compactadas y secadas, influye en la interacción del microorganismo con su entorno. Sin embargo, el ángulo de contacto de las gotas de agua sobre esas capas de bacterias informa sobre las características de un recubrimiento desordenado de material de la superficie de las bacterias colapsadas en un cierto empaquetamiento. Aunque los resultados son útiles para interpretar las interacciones de largo alcance entre el microorganismo y la superficie del sustrato, no lo son necesariamente para la interpretación de las interacciones de corto alcance, que podrían estar controladas por las heterogeneidades estructurales y químicas de la superficie celular. En el Capítulo 7, se han estudiado las fuerzas de interacción mediante AFM de la superficie de L. acidophilus ATCC4356 y L. casei ATCC393 con y sin SLP, respectivamente, con sondas funcionalizadas, es decir terminadas con grupos hidrófobos (CH 3 ) e hidrófilos (OH), en disoluciones con fuerza iónica baja y alta. La hidrofobicidad superficial macroscópica de ambas cepas se determinó mediante ángulos de contacto, empleando disoluciones con las dos fuerzas iónicas investigadas. En general, fuerzas de interacción altas con la sonda hidrófila coinciden con valores bajos del ángulo de contacto, mientras que las células que muestran ángulos de contacto altos presentan una interacción más fuerte con la sonda hidrófoba. Asimismo, ambas cepas invierten su naturaleza hidrófoba al aumentar la fuerza iónica de 10 a 100 mm. Es interesante el que el comportamiento dinámico de la hidrofobicidad superficial de los lactobacilos sea posible medirlo no solamente macroscópicamente mediante ángulos de contacto, sino también por AFM a nivel microscópico. El comportamiento dinámico de las superficies celulares de L. acidophilus ATCC4356 y L. casei ATCC393 frente a los cambios de la fuerza iónica confiere a estos microorganismos una versatilidad que les permite adherirse a superficies hidrófobas e hidrófilas en disoluciones con baja y alta fuerza iónica, respectivamente. En general, la adhesión de los lactobacilos a sustratos sólidos no tiene lugar de acuerdo con las expectativas deducidas de la hidrofobicidad superficial. En el Capítulo 8 se ha investigado el papel que juega la hidrofobicidad superficial para dos cepas de lactobacilos con y sin capa de SLP en su adhesión a superficies de vidrio funcionalizado hidrofóbica o hidrofílicamente, en condiciones de flujo bien definidas de suspensiones con baja y alta fuerza iónica. Por similitud, se midió la interacción de los lactobacilos con sondas de AFM funcionalizadas del mismo modo. En las suspensiones de baja fuerza iónica, ambas cepas de lactobacilos presentan una adhesión inicial más alta al vidrio hidrófobo que al hidrófilo, mientras que con fuerzas iónicas altas no se ha observado una influencia clara de la hidrofobicidad superficial sobre la adhesión. Independientemente de la fuerza iónica, los experimentos de AFM indican que las fuerzas de interacción son más intensas cuando, tanto la bacteria como la sonda, son hidrófobas o hidrófilas que

5 Resumen 111 cuando tienen hidrofobicidades opuestas. Estas intensas fuerzas de adhesión no tienen reflejo en las observaciones de la adhesión macroscópica, lo que sugiere que la fuerza que actúa cuando una bacteria se pone en contacto con un sustrato afecta su modo de adhesión. Por otra parte, se ha podido correlacionar sólo cualitativamente la dependencia con la distancia de la energía de interacción total de Gibbs con la deposición y la desorción de las bacterias en la cámara de flujo plano-paralela, mientras que no se han detectado, mediante AFM, las fuerzas DLVO al aproximar las sondas funcionalizadas a la superficie de las bacterias. En la Discusión General, se han discutido las conclusiones principales obtenidas de esta tesis que son: (a) las curvas fuerza-distancia al aproximar la sonda a la superficie se corresponden con la razón con que se adhieren macroscópicamente los microorganismos a los sustratos. (b) la distancia máxima a la cual se pueden detectar las fuerzas atractivas mediante la retracción de la sonda del AFM están relacionadas con el área que bloquea una bacteria adherida sobre un sustrato, y (c) la desorción de bacterias de sustratos sólidos no muestra relación con las fuerzas adhesivas determinadas por AFM, excepto si se considera el tiempo de contacto entre las bacterias y el sustrato. Además, se presentan algunas de las limitaciones del sistema de cara a la interpretación precisa de las curvas fuerza-distancia, así como algunas perspectivas para futuros trabajos.

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