Experts, acollidors i solidaris

Transcripción

1

2 Presa de mostra Nasofaringe, part posterior Aspirat nasofaringi Escovilló Cultiu SI Mitjà de transport carbó-sang de cavall (Regan-Lowe) PCR SI Sense mitjà de transport NO mànec fusta NO cotó

3 Presa de mostra PCR Cultiu

4 Cultiu Mitjà agar carbó amb 10% de sang de cavall i 40 mg/l de cefalexina. Incubat en càmera humida durant 7 dies. Identificació por tinció de Gram, oxidasa i aglutinació amb anticossos específics B.pertussis B.parapertussis B.bronchiseptica Aglutinació + Aglutinació -

5 PCR CYCLE NUMBER AMOUNT OF DNA , , , , , , , , , , ,048, ,097, ,194, ,388, ,777, ,554, ,108, ,217, ,435, ,870, ,073,741, ,400,000, ,500,000, ,550,000, ,580,000,000

6 PCR. Preparació de mostra Tiocianat de guanidina Lisi en columnes 1 hora PCR 2 hores Detecció producte amplificat Southern blot 2-3dies Electroforesi 2 hores Hibridació en placa de microtitulació 2-3 dies

7 PCR

8 PCR en temps real Capacitat per visualitzar l acumulació de productes de PCR utilitzant fluorescència. L augment de la fluorescència és proporcional a la quantitat de DNA (amplicons s). Quantificació de DNA / RNA

9 1) Denaturation (95 C) Primer 2) Hybridization (50 60 C) 3) Extension (72 C) SYBR Green Polymerase PCR en temps real Fluorescència SYBR Green Dye

10 PCR en temps real

11 PCR en temps real Extracció d àcids nucleics 3 hores PCR

12 PCR en temps real per Bordetella PCR en temps real múltiplex B.pertussis IS481 B.parapertussis IS1001 Control intern

13 Diagnòstic en urgències. Filmarray PCR múltiplex en temps real Amb extracció d àcids nucleics incorporada Treball tècnic mínim Resultats en 1 hora Influenza A, B, variant nova Parainfluenza 1, 2, 3, 4 Adenovirus VRS Metapneumovirus Coronavirus NL63, OC43, 229E, HKU1 Bocavirus Rhinovirus Bordetella pertussis Chlamydophila pneumoniae / Mycoplasma pneumoniae

14 Diagnòstic en urgències. Filmarray

15 Diagnòstic en urgències. Filmarray

16 Valoració tècnica del diagnòstic microbiològic Diagnòstic Temps Indicacions Preu Cultiu PCR en temps real B.pertussis B.parapertussis B.bronchiseptica B.pertussis B.parapertussis 3-7 dies Rutina + 3 hores Rutina +++ Filmarray B.pertussis Altres bacteris i virus 1 hora Urgències +++++

17 Quin rendiment tenim amb les tècniques diagnòstiques? Dades de 2011 Tècnica Casos Contactes Pos /total % Pos /total % Cultiu 47 / / PCR 92 / / La PCR és més sensible que el cultiu, especialment en contactes (poca quantitat de bacteri)

18 Hi ha relació entre microbiològica? Dades de Mètode Casos Confirmat Cultiu < 1 any 31 (27.4%) anys 24 (13.5%) PCR < 1 any 50 (36%) anys 65 (29.7%) La PCR i el cultiu són més sensibles en nens petits (més quantitat de bacteri) edad i confirmació 2011 No confirmat Total

19 Programa pilot vigilància tos ferina a Catalunya Període 1 any: maig maig 2005 Cas sospitós Menor de 15 anys: Tos de dos setmanes o més de duració Tos de una setmana o més, amb paroxismes tussígens, vòmits, estridor o apnea post- tussígens, vòmits, estridor o apnea post- tussígena Major de 15 anys: Tos de dues setmanes o més, con paroxismes tussígena Contacto sospitós Persona amb símptomes respiratoris que conviu amb un caso sospitós Estudi microbiològic Bordetella pertussis: PCR i cultiu Cultiu per altres bacteris PCR per: Legionella Chlamydophila pneumoniae Mycoplasma pneumoniae Influenza Adenovirus VRS

20 Hi ha relació entre l aïllament i el temps transcorregut des de el començament de la tos? Dies Cultiu positiu Negatiu Total % % % > % Total % Dies PCR positiva Negatiu Total % % % > % Total % Casos

21 Quins altres microorganismes podrien estar implicats? Microorganisme Aïllament no. H.influenzae 36* S.pneumoniae 16 M.catarrhalis 9 M.pneumoniae 3 C.pneumoniae 1 L.pneumophila 0 Virus 5 ** Aïllament % Mostres total * 1 H.influenzae serogrupo b ** 1 Influenza A, 2 adenovirus, 2 VRS

22 Què podem esperar del diagnòstic microbiològic? 55.4% B.pertussis H.influenzae S.pneumoniae M.catarrhalis Altres Negatiu

23 Què aporta el cultiu a la infecció per B.pertussis? Estudi de sensibilitat antimicrobiana Difusió disc-placa agar Regan- Lowe amb 10% de sang de cavall. Antibiòtics Eritromicina Telitromicina Aïllament Azitromicina Doxiciclina Cotrimoxazol Ac. nalidíxic Ciprofloxacina Cloranfenicol Incubació a 35ºC en cambra humida durant 10 dies Lectura a las 72 hores i 5 dies. Guies NCCLS de la soca Tipat Digestió i electroforesi en camp polsat Tècnica: projecte SALM- GENE J Clin Microbiol 1997; 35: J Clin Microbiol 2002; 40: Estudi de 211 soques de B.pertussis aïllades des de 1986 a 2004

24 Sensibilitatt antibiòtica 72 hores Sensible % no. E AZ TE NA CIP TxS C DO dies Soques Sensible % Total no E: eritromicina. AZ: azitromicina. TE: telitromicina. NA: ác. nalidíxic. CIP: ciprofloxacina. TxS: cotrimoxazol. C: cloranfenicol. DO: doxiciclina

25 Tipat per electroforesi en camp polsat Digestió del ADN amb enzims de restricció Separació dels fragments per electroforesi en camp polsat

26 Tipat per electroforesi en camp polsat

27 Resultatss del tipat H G 6% 31% 15% 0.4% 3% Clade I Clade II B 12% D 8% A 1% Clade III C 8% E 12%

28 Famílies genètiques. Taxa per anys Clade III Clade II Clade I

29 Diversitatt genètica Clade I Clades II - III Diversitat

30 Conclusions La PCR en temps real és una tècnica ràpida i sensible per el diagnòstic de la infecció per Bordetella pertussis En pacients amb risc elevat (lactants no vacunats), el diagnòstic microbiològ ic per cultiu i per PCR presenten una bona sensibilitat. L aïllament del microorganisme permet fer estudis d epidemiologia per controlar la expansió de les soques a la comunitat