Implantes dentales de carga inmediata con superficies osteo-inductivas y sellado bio RD

Transcripción

1 Implantes dentales de carga inmediata con superficies osteo-inductivas y sellado bio RD INFORME TÉCNICO CERTIFICACIÓN FINAL Junio 2012

2 Immediat-Os: Certificación Parcial Índice Introducción... 3 Actividad 1: Diseño del cuello del implante por MEF... 4 Actividad 2: Superficies de titanio rugosas... 9 Actividad 3: Obtención de un recubrimiento de Niobio Actividad 4: Obtención de una superficie Bioactiva Actividad 5: Recubrimiento de Oxido de Zinc Actividad 6: Aplicación de los recubrimientos en implantes dentales Actividad 7: Caracterización in-vitro

3 Introducción El proyecto Immediat-Os se presentó en su diseño original con 7 actividades, cada una de las cuales había sido pensada para conseguir de manera eficiente los objetivos planteados. A medida que el proyecto fue avanzando se pudo constatar que la gran mayoría de las tareas programadas han sido efectivas y han permitido avanzar hacia el producto buscado. A pesar de esto, en una cantidad menor de tareas se ha detectado la necesidad de modificar algunos o varios aspectos de las mismas por no considerarse ya la manera óptima de proceder. La fecha teórica de inicio del proyecto estaba marcada a mediados de 2009, pero debido a retrasos de gestión no se ha comenzado oficialmente hasta enero de Por este motivo y por otros temas técnicos se ha solicitado la postergación del final del proyecto. Dicha postergación ha sido aprobada por ACC10 por lo que el calendario final de actividades ha quedado marcado según se indica en la siguiente gráfica: Tasca Elaboració de Bentch Market 1.2 Proposta d'un nou disseny 1.3 Obtenció del model 3D del nou disseny, de l'implant actual i de la secció òssia. 1.4 Preparació del models per FEM. 1.5 Càlcul i anàlisis de resultats 2.1 Obtenció de superfícies rugoses 2.2 Caracterització física de les superfícies 2.3 Caracterització biològica de les superficies in vitro 3.1 Obtenció de recobriments de niobi mitjançant la tècnica PVD d arc catòdic 3.2 Caracterització física del recobriment. 3.3 Caracterització química del recobriment. 3.4 Caracterització biològica del recobriment in vitro. 4.1 Aplicació d un tractament termoquímic als recobriments de niobi. 4.2 Caracterització física del recobriment. 4.3 Caracterització química del recobriment. 4.4 Caracterització biològica del recobriment in vitro. 5.1 Obtenció de recobriments de ZnO per projecció tèrmica 5.2 Caracterització física 5.3 Caracterització química del recobriment. 5.4 Caracterització biològica del recobriment in vitro. 6.1 Aplicació dels recobriemnts als implants dentals 6.2 Caracterització física de l implant. 6.3 Caracterització química de l implant. 6.4 Caracterització biològica de l implant in vitro. 7.1 Validación del implante in-vitro. Expresión genética y proteica Actividades finalizadas en la I justificación (parcial) Actividades finalizadas en la II justificación (final) 3

4 Actividad 1: Diseño del cuello del implante por MEF Participantes Líder: CTM Empresas: Klockner Centros: - Objetivos El objetivo de esta actividad es la simulación por elementos finitos del diseño de un nuevo implante dental. Según los requisitos del líder del proyecto y la información obtenida de un Benchmarking se elabora un diseño nuevo del conjunto Pilar-Tornillo-Implante. Este diseño permitirá la colocación del implante en un sitio con poco espacio o poco material óseo. Se determinan las cargas que soporta el hueso para asegurar que la carga transmitida por las paredes del implante no sea demasiado elevada y colapse el riego sanguíneo del hueso provocando la necrosis del mismo. La simulación también permite determinar la distribución de cargas mecánicas en las diferentes piezas que forman el conjunto del implante dental además del implante propiamente dicho (pilar y tornillo). Una vez obtenido un diseño óptimo desde el punto de vista biomecánico, la empresa Klockner producirá un cierto número de implantes para realizar las actividades 6 y 7. La actividad 1 es responsabilidad de CTM y de los diseñadores y mecánicos de Klockner. Las tareas que se derivan de ésta son: 1.1 Elaboración de un Benchmarking de los diferentes diseños geométricos existentes en el mercado. 1.2 Propuesta de un diseño nuevo basado en el Benchmarking y los requisitos del líder del proyecto. 1.3 Obtención de un modelo 3D del diseño propuesto, del implante actual y de la sección ósea donde se colocará el implante. 1.4 Preparación para el cálculo por MEF: 1.5 Cálculo y análisis de resultados. (Programa: ABAQUS) Cronograma Tasca Elaboració de Bench Market 1.2 Proposta d'un nou disseny 1.3 Obtenció del model 3D del nou disseny, de l'implant actual i de la secció òssia 1.4 Preparació de models per FEM. 1.5 Càlcul i anàlisis de resultats 4

5 Resultados 1.1 Elaboración de Benchmarking Como preparación para el diseño del nuevo implante, previamente se ha realizado una búsqueda de productos similares en el mercado de referencia (benchmarking). Se ha redactado la información de los líderes del mercado de implantes dentales, Astra Tech Dental, Biomet 3i, Klockner, Nobel Biocare y Straumann, y se ha revisado la información accesible de cada uno de sus modelos. 1.2 Propuesta de un nuevo diseño Se han realizado diferentes propuestas geométricas del conjunto que forma el implante. Cada uno de los modelos propuestos se ha simulado, mediante el método de los elementos finitos, de manera que se han podido comprobar los puntos débiles de cada uno de los componentes. Se han realizado un total de 11 iteraciones del diseño hasta obtener el modelo geométrico final. Se ha realizado un estudio comparativo de la rigidez de cada uno de los modelos geométricos propuestos respecto al modelo original en el cual se observa una menor rigidez en el comportamiento del nuevo implante (V11). 1.3 Obtención del modelo 3D del nuevo diseño, del implante actual y de la sección ósea Para esta actividad se ha obtenido, a su vez, la geometría de una sección ósea, donde se coloca el implante. Los distintos modelos geométricos en los que se ha trabajado se han diseñado mediante el programa CAD comercial CATIA. Luego se ha mallado cada modelo (elementos tetraédricos sólidos de cuatro nodos) y preparado para el cálculo por elementos finitos mediante el software ABAQUS. 1.4 Preparación de modelos para FEM Para el desarrollo de los modelos por FEM (Métodos de Elementos Finitos, por sus siglas en inglés) son necesarios los siguientes pasos: Asignación de las propiedades de los materiales Se aplicaron las propiedades mecánicas de los componentes de implante y de la sección ósea (dividida en hueso cortical y hueso trabecular) a las correspondientes mallas. Interacciones entre superficies Se establecieron las siguientes interacciones de superficies de contacto: - Superficie interna de la sección ósea con superficie externa del implante. - Superficie interna del implante con superficie externa del pilar, en la zona cónica. - Superficie interna del implante con superficie externa del tornillo, en la zona roscada. - Superficie interna del pilar con superficie externa del tornillo, en la zona de la cabeza. 5

6 Para todas las interacciones se ha utilizado un coeficiente de rozamiento obtenido a partir de un ajuste realizado entre la simulación y los ensayos. Aplicación de las condiciones de contorno y cargas Para la simulación del comportamiento del ensamblaje es imprescindible definir bien las condiciones de contorno. Para ello ha sido necesario realizar varios ensayos previos a la simulación. El software de simulación trabaja con fuerzas y desplazamientos, por lo que, para la primera etapa del cálculo (etapa de precarga de tornillo), se ha establecido una carga axial de montaje correspondiente a 30N cm, así como un desplazamiento resultante de dicho proceso de montaje. Se han realizado ensayos de laboratorio para validar algunas de las variables virtuales utilizadas de clara importancia en el comportamiento del conjunto, como es el coeficiente de rozamiento entre superficies de contacto. Los ensayos realizados son los siguientes: - Medición del desplazamiento del pilar durante el montaje. - Medición de la fuerza axial necesaria para comprimir el pilar contra el implante. Con estos ensayos se ha determinado que el desplazamiento del pilar está relacionado con una fuerza de 2895 ± 842N/mm. Esto significa que el desplazamiento de 123μm, perteneciente a la etapa de montaje con 30N cm, se corresponde con una fuerza axial de 356 ± 103N. Condiciones de contorno Las condiciones de contorno son las mismas para todos los modelos, ya sea en el montaje sobre el hueso o sobre la resina de incrustación. Éstas son: - Simetría en el plano 12: Al trabajar con la mitad del modelo geométrico, ha sido necesario incorporar una condición de contorno de simetría que impide los desplazamientos en la dirección perpendicular a dicho plano. - Empotramiento exterior: Tanto el hueso como el cilindro de resina se han empotrado en su superficie exterior. Esto impide los desplazamientos en todas las direcciones. Cargas Los cálculos realizados se dividen en dos etapas, etapa de precarga y etapa de carga masticatoria. Los valores de carga aplicados a cada una de las etapas son los siguientes: - Etapa de precarga: La carga aplicada sobre el tornillo es la misma para ambos modelos, ya sea el montaje sobre el hueso o sobre la resina de incrustación. A pesar de que inicialmente se trabajó con una precarga de 350N para cumplir con el protocolo actual establecido por la empresa, debido a los cambios de resistencia del nuevo modelo se ha optado por reducir la precarga a 140N, valor ajustado al inicio de plastificación del implante del modelo V11. De esta forma es posible comparar el estado mecánico de los 2 modelos de estudio en régimen elástico. - Etapa de carga masticatoria: En esta etapa se aplica la carga masticatoria sobre la superficie superior del pilar. Ésta tiene un valor de 120N y se aplica con 30 de inclinación respecto la vertical del implante. 6

7 1.5 Cálculo y análisis de resultados Simulación de la resistencia mecánica del conjunto según ISO 14801:2007 Se ha estudiado detalladamente la evolución de la tensión alcanzada por el implante con la aplicación de la precarga de 140N del tornillo. Las tensiones de tracción se encuentran en el aro superior del implante para ambos modelos. Respecto al modelo original, el implante V11 empieza a plastificar para una carga 43% menor. Tras la aplicación de la carga de 120N a 30 la simulación muestra claramente la disminución de rigidez del modelo V11 respecto al modelo original, debido a la menor sección resistente. Este hecho se traduce en un significativamente mayor desplazamiento horizontal, lo que conlleva a una mayor tensión en la zona de contacto entre el pilar y el implante para estos mismos componentes. En esta segunda etapa, la tensión añadida al conjunto tras la carga masticatoria es mucho mayor en el caso del nuevo diseño. Simulación del comportamiento en servicio sobre la sección ósea El nuevo diseño de implante es menos rígido por lo que, para una misma carga, la obertura resultante del cuello del implante es mayor. Ésta se transmite, de la misma manera, al hueso, obteniendo éste un mayor desplazamiento radial. Las tensiones en el hueso, para el caso del nuevo diseño, son 2.5 veces mayores que en el modelo original. Diseños avanzados del implante dental para una mejora del re-diseño propuesto Se han realizado tres nuevas propuestas de diseño con la finalidad de encontrar un nuevo modelo geométrico que, siguiendo con la misma filosofía de cambios definidos en los requerimientos iníciales, tenga una rigidez parecida a la del modelo original. En estos modelos se han modificado algunas características como el diámetro del tornillo extractor o el diámetro exterior del implante. A continuación se detallan las características de los tres modelos propuestos. Propuesta A: Implante de diámetro 3.0mm con el tornillo más estrecho, obteniendo paredes 0.05mm más gruesas respecto al V11. Propuesta B: Implante de diámetro 3.3mm con el tornillo sin modificar respecto el V11, obteniendo paredes 0.075mm más anchas respecto el V11. Propuesta C: Combinación de las dos propuestas anteriores. Implante de diámetro 3.3mm y con tornillo más estrecho, obteniendo paredes 0.125mm más anchas respecto el V11. Estos nuevos diseños se han calculado mediante un modelo simplificado, sin el efecto del contorno de resina o de hueso, sino empotrando la parte inferior del implante y aplicando una carga axial sobre el tornillo, al igual que en las primeras simulaciones mostradas. Se puede concluir que: 7

8 Disminuir el diámetro del tornillo ayuda a aumentar la rigidez del conjunto, debido a que este componente tiene una rigidez intrínseca, por sección, mucho más elevada. Esta disminución permite aumentar la sección resistente de los demás componentes. La propuesta C tiene una rigidez prácticamente igual al modelo original, aún teniendo un diámetro 0.2mm inferior. Este modelo es el propuesto como rediseño en este proyecto. Figura 1.1: Mallado del conjunto utilizado en la simulación. Entregables Tal como previsto se ha elaborado la memoria final de esta actividad de acuerdo con su finalización al final de

9 Actividad 2: Superficies de titanio rugosas Participantes Líder: BIBITE Empresas: Klockner Centros: - Objetivos El objetivo de esta actividad es la investigación, el desarrollo y la caracterización de superficies de titanio con diferentes grados de rugosidad, conseguida mediante la técnica del shot blasting y/o un ataque ácido. Las tareas que se derivarán de esta actividad son: 2.1 Obtención de superficies rugosas 2.2 Caracterización física de las superficies 2.3 Caracterización biológica de las superficies in vitro Cronograma 2.1 Obtenció de superfícies rugoses Tasca Caracterització física de les superfícies 2.3 Caracterització biològica de les superficies in vitro Resultados 2.1 Obtención de superficies rugosas Obtencion de superficies con una tipología de rugosidad Los discos de Ti c.p. grado III con 8 mm de diámetro y 2 mm de grosor fueron tratados con los siguientes tratamientos: Ti: Ti c.p. mecanizado Al 2 O 3 : Ti c.p. granallado con partículas de alúmina (Al 2 O 3 ) de µm. SiC: Ti c.p. granallado con partículas de carburo de silicio (SiC) de µm. ZrO 2 : Ti c.p. granallado con partículas de óxido de circonio y silicio (ZrO 2 SiO) de las cuales un 50% son de µm y un 50% de µm. React1: Ti c.p. mecanizado y ataque ácido con HF 2% y H %. React2: Ti c.p. mecanizado y ataque ácido con HNO 3 9%, HCl 3,7% y HF 2%. React3: Ti c.p. mecanizado y ataque ácido con HNO 3 30% y NH 4 HF 2 3,5%. 9

10 Obtención de superficies con doble tipología de rugosidad Con el fin de observar la evolución de la composición química de las superficies granalladas con Al 2 O 3 y SiC, se han realizado ataques ácidos durante 120 segundos con los tres reactivos en las diferentes superficies rugosas. 2.2 Caracterización física de las superficies Superficies con una tipología de rugosidad Las superficies fueron estudiadas mediante microscopía electrónica de barrido (SEM) (6400, Jeol, Japan) para estudiar cualitativamente el efecto de los diferentes tratamientos superficiales. La rugosidad superficial fue caracterizada mediante microscopia interferométrica de luz blanca (Optical Profiling System, Wyko NT9800, Veeco). La observación de las superficies manifiesta que las partículas de ZrO 2 SiO dejan cráteres redondeados y un elevado número de partículas incrustadas en la superficie. El incremento de rugosidad es significativo respecto a las condiciones obtenidas en las granalladas con Al 2 O 3 y SiC, se aprecia una rugosidad escarpa con una densidad de picos y valles elevada. Tal y como se podía observar en las imágenes obtenidas en el SEM, se aprecia que las superficies granalladas con Al 2 O 3 presentan mayor rugosidad. Superficies con doble tipología de rugosidad Para ambas naturalezas de partículas de granallado se observan tendencias similares en el ataque ácido. A tiempos cortos, se observa como las zonas más angulosas y reactivas se atacan primero, se redondean los picos y se forman cavidades esféricas, dando lugar a la doble tipología de rugosidad: combinación de formas angulosas y cavidades y formas redondeadas. La cantidad de partículas de granallado incrustadas se reduce a mayores tiempos de ataque. Entre 120 y 240 segundos, se observa ataque en los límites de grano, hecho que reduciría las propiedades mecánicas del material en servicio. A 240 segundos de ataque, se observa una única tipología de la rugosidad, en la cual los picos y valles abruptos desaparecen y se obtienen picos y valles redondeadas. Tal y como se puede observar en las imágenes obtenidas en el SEM, las superficies granallados con Al 2 O 3 y SiC mantienen valores de rugosidad (Sa) en el mismo orden de magnitud. 10

11 2.3 Caracterización biológica de las superficies in vitro Ensayo biológico in vitro de superficies con una tipología de rugosidad No se observan efectos citotóxicos de las diferentes superficies ya que no se observan alteraciones en la adhesión y en la proliferación. Las diferencias en la proliferación y diferenciación a tiempos largos de cultivo se podrían deber al hecho de un incremento de la superficie real y carga superficial que aumenta la adsorción de proteínas del medio. Los resultados de producción de fosfatasa alcalina demuestran que las superficies granalladas presentan un incremento en la expresión a catorce días de dicha proteína de inicio de la biomineralización. Si se comparan los resultados entre discos granallados con Al 2 O 3 y SiC, aunque las diferencias no son estadísticamente significativas, la actividad de la fosfatasa alcalina es superior en los osteoblastos sobre discos granallados con carburo de silicio. Ensayo biológico in vitro de superficies con doble tipología de rugosidad Las condiciones estudiadas fueron las siguientes: Ti: Ti c.p. mecanizado. Al 2 O 3 : Ti c.p. granallado con partículas de Al 2 O 3 de µm. AlE30: Superficies Al 2 O 3 y ataque reactivo 3 durante 30 segundos. AlE120: Superficies Al 2 O 3 y ataque reactivo 3 durante 120 segundos. SiC: Ti c.p. granallado con partículas de SiC de µm. SiE30: Superficies SiC y ataque reactivo 3 durante 30 segundos. SiE120: Superficies SiC y ataque reactivo 3 durante 120 segundos. Los resultados de adhesión a 4 horas demuestran que para todos los grupos estudiados la adhesión inicial es igual o superior al titanio liso. Las superficies granalladas con alúmina atacadas durante 30 segundos presentan un incremento significativo en el número de células. Los resultados de diferenciación muestran que las superficies granalladas presentan mayor expresión de fosfatasa alcalina que las lisas. Las superficies granalladas y atacadas ácidamente presentan incrementos en la actividad de ALP. Las superficies granalladas con alúmina y ataque ácido con el reactivo 3 durante 30 segundos son las que mejor respuesta biológica in vitro presentan. 11

12 Figura 2.2. Imagen general de las células SaOs-2 adheridas a 4 horas sobre las diferentes superficies de titanio rugoso. Todas las condiciones presentan mayor nivel de señal que el titanio liso. Además, se incluye una imagen de la morfología celular que es similar para todas las superficies de estudio. Entregables Se ha elaborado la memoria final de esta actividad en acuerdo con su finalización a finales de

13 Actividad 3: Obtención de un recubrimiento de Niobio Participantes Líder: TTC Empresas: KLOCKNER, COMAS Centros: CTM, BIBITE, CPT Objetivos El objetivo de esta actividad consiste en la preparación de recubrimientos de niobio sobre la superficie rugosa optimizada de titanio. El niobio es uno de los elementos químicos más osteointegradores que se conocen y, por lo tanto, es de esperar una mejora considerable en la migración celular y en la formación ósea con respecto al titanio puro. Debido a que este recubrimiento ha de respetar la rugosidad intrínseca conseguida en la Actividad 2 mediante los procesos de granallado, el grosor de los recubrimientos ha de ser de orden micrométrico. Desde este punto de vista, la técnica que se ha utilizado en este proyecto es la deposición física en fase vapor (PVD, Physical Vapor Deposition) de arco catódico. Su versatilidad y menor coste económico en comparación con otras técnicas de recubrimiento, la configuran como una técnica fácilmente extrapolable a escala industrial. Las distintas tareas en las que se divide esta actividad son las siguientes: 3.1 Obtención de recubrimientos de niobio mediante la técnica de PVD de arco catódico. 3.2 Caracterización física del recubrimiento. 3.3 Caracterización química del recubrimiento. 3.4 Caracterización biológica del recubrimiento in vitro. Cronograma Tasca Obtenció de recobriments de niobi mitjançant la tècnica PVD d arc catòdic 3.3 Caracterització física del recobriment. 3.4 Caracterització química del recobriment. 3.5 Caracterització biològica del recobriment in vitro. 13

14 Resultados 3.1 Obtención de recubrimientos de niobio mediante la técnica PVD de arco catódico Se obtuvieron recubrimientos homogéneos de unas 3 micras de grosor utilizando las siguientes condiciones experimentales: - Tiempo de depósito: 2:30 horas. - Voltaje bias del substrato: 0-50 V. - Temperatura de depósito: temperatura ambiente. - Presión: 4x10-4 mbar. - Distancia muestra - boca del filtro: 12 cm. Los resultados más significativos obtenidos de este estudio se pueden resumir en los siguientes puntos: Se encontraron diferentes condiciones de proceso en las que el recubrimiento presenta un ritmo de crecimiento de 0.5 micras/hora: (a) Temperatura de crecimiento lo más baja posible. (b) Valores bajos del voltaje del bias, o valores más elevados si se utiliza modo pulsado con un ciclo de trabajo bajo. (c) Presión del orden de 10-2 Pa. Se consiguió solucionar el problema de la delaminación del recubrimiento sobre muestras pulidas mediante los siguientes procesos: (a) Aplicación de un bombardeo iónico previo al crecimiento de la capa. (b) Una alternativa más efectiva para la eliminación de las tensiones compresivas del recubrimiento y, por lo tanto, para conseguir una buena adherencia ha consistido en el crecimiento de una capa intermedia de anclaje con composición gradiente de titanio-niobio. Se consiguieron diferentes morfologías de crecimiento del recubrimiento en función del voltaje bias aplicado a la muestra. Figura Montaje de los substratos de titanio en el reactor PVD PFCA-450 del CTM 14

15 En TTC se exploraron diferentes condiciones de proceso con el objetivo de obtener recubrimientos bien adheridos, de grosor y morfología adecuados para la aplicación contemplada en este proyecto. Los mejores resultados fueron obtenidos utilizando los parámetros del proceso 15. Proceso Vacío máx. (mbar) Temperatura ( C) I Evaporación (A) V control crecimiento 15 1x10-4 ambiente 80 baja 3.2 Caracterización física del recubrimiento CARACTERIZACIÓN MORFOLÓGICA La morfología superficial de los recubrimientos fue estudiada mediante microscopía electrónica de barrido (SEM, Zeiss Ultraplus) y microscopía óptica confocal (PLµ2300, Sensofar). Figura Imágenes de microscopía óptica confocal correspondientes a un substrato de titanio pulido, un recubrimiento de Ti53Nb47 y un recubrimiento de Nb puro. PROPIEDADES MECÁNICAS Las propiedades mecánicas (dureza y módulo de Young) de los recubrimientos fueron determinadas mediante la técnica de nanoindentación. Se utilizó un equipo de nanoindentación Nano Indenter XP de MTS. La dureza y módulo elástico de los recubrimientos de niobio obtenidos en CTM oscila entre GPa y GPa, respectivamente. Mientras el módulo elástico de los recubrimientos de niobio es muy similar al del material másico (cátodo de niobio), la dureza es superior en un factor 3. Este hecho, podría deberse al estado de tensiones compresivas al 15

16 que se encuentra sometido el recubrimiento, que podría dar lugar a valores de dureza mayores. En recubrimientos de niobio procesados por TTC, el recubrimiento presenta valores muy elevados de dureza (23-30 GPa) y de módulo de Young ( GPa). Este hecho podría deberse nuevamente al elevado estado de tensiones compresivas al que está sometido el recubrimiento, aunque no se descarta la posibilidad de haber obtenido una fase distorsionada del niobio o la formación parcial de nitruro de niobio como consecuencia de alguna fuga de nitrógeno en el reactor de PVD. El micro-rayado sobre un recubrimiento de niobio-titanio rico en niobio (Ti 11 Nb 89 ) de 1.3 micras de grosor procesado por el CTM demuestra que el material presenta una deformación dúctil. En el caso del recubrimiento no se observan fenómenos de desconche ni delaminación significativos. Los recubrimientos presentan una resistencia al micro-rayado similar a la del titanio sin recubrir. 3.3 Caracterización química del recubrimiento Espectroscopía de Rayos X por Dispersión de Energía Las condiciones experimentales para la medida de la concentración relativa de los diferentes elementos químicos presentes en la superficie del material así como su evolución en función de la profundidad de decapado fueron las siguientes: Se analizaron las siguientes muestras: - Muestra I-a: Recubrimiento de Ti/Nb sobre substrato de titanio grado 2 sin granallar. Tiempo de recubrimiento 4 horas. - Muestra II-a: Recubrimiento de Ti/Nb sobre substrato de titanio grado 2 sin granallar. Tiempo de recubrimiento 2 horas. En la espectroscopia se demuestra que tan sólo existe la presencia de líneas de emisión procedentes del titanio y el niobio, hecho que descarta la presencia de impurezas. Adicionalmente, se estudió la estructura cristalográfica de los recubrimientos mediante difracción de rayos X (DRX). El difractograma del recubrimiento de Ti 57 Nb 43 es compatible con la presencia de 2 fases cristalinas: - Fase hcp (hexagonal close packed,p6 3 /mmc) α-ti correspondiente al substrato de titanio. - Fase bcc (body centered phase,im3m) compatible con Nb y β-ti (el parámetro de celda de Nb es Å y el de β-ti es Å), que correspondería al recubrimiento. Atendiendo al diagrama de fases reportado por Y. Zhang et al. (Calphad 25(2) (2001) , es posible que se haya formado una fase sólida de β-ti-nb con parámetro de celda de Å y un dominio cristalino de nm. 16

17 Resistencia a la corrosión Las condiciones seleccionadas para realizar una primera caracterización de la resistencia a la corrosión son: - Recubrimiento de niobio obtenido por TTC (ref. TTC). - Recubrimiento biomimético obtenido por CTM (ref. CTM 72). - Recubrimiento reproduce la rugosidad original obtenido por CTM (ref. CTM 73). - Titanio granallado y pasivado en HCl 0,6 M obtenido por BIBITE (ref. Ti). Esta condición es la seleccionada como control del estudio, aunque cada técnica puede tener su control interno. El potencial se encuentra entre -130 y -300 mv para todas las series estudiadas, los recubrimientos CTM 72 y 73 presentan potenciales en valores ligeramente menos nobles. No se aprecian tendencias significativas en el comportamiento a circuito abierto. Bajo las condiciones de trabajo y las condiciones actuales de los tres recubrimientos de niobio respecto al titanio granallado control, se puede concluir que: Los recubrimientos de niobio presentaron una ligera disminución del potencial de corrosión. Se espera mejorar la resistencia a la corrosión al mejorar la estabilidad del recubrimiento. 3.4 Caracterización biológica del recubrimiento in vitro Las condiciones seleccionadas para realizar una primera caracterización in vitro son las mismas enumeradas en el inciso anterior. Los resultados de proliferación y citotoxicidad no presentan diferencias respecto el titanio granallado control. En cambio, el número de células de la condición TTC es inferior, aunque no alcanza el 20%, por lo que junto con los resultados de citotoxicidad no se consideran efectos citotóxicos para esta condición ni para las condiciones CTM 72 y 73. Bajo las condiciones de trabajo y para los tres recubrimientos de niobio respecto al titanio granallado control, se puede concluir que: Todas las muestras presentan un nivel de proliferación adecuado. No se detectan efectos citotóxicos. Entregables Se ha elaborado la memoria final de esta actividad en acuerdo con su finalización a finales de

18 Actividad 4: Obtención de una superficie Bioactiva Participantes Líder: BIBITE Empresas: KLOCKNER Centros: BIBITE Objetivos Investigación y desarrollo de una superficie bioactiva de niobato sódico a partir de un tratamiento termoquímico con NaOH concentrado. Calendario 4.1 Aplicación de un tratamiento termoquímico al recubrimiento de Nb 4.2 Caracterización física del recubrimiento 4.3 Caracterización química del recubrimiento. 4.4 Caracterización biológica del recubrimiento in vitro Tarea Desarrollo TAREA 4.1. Aplicación de un tratamiento termoquímico a los recubrimientos de niobio Introducción En la bibliografía se pueden encontrar diversos trabajos de Kokubo et al., Aparicio et al., etc. en los que se determinan los parámetros (temperaturas, tiempos, concentraciones) ideales para obtener una superficie de niobato, titanato bioactivos. El proceso consiste en: En la anterior generación de recubrimientos de niobio se consiguió obtener niobato de sodio reduciendo la concentración de NaOH. Con los nuevos recubrimientos se intentó la misma estrategia pero no se consiguió estabilizar el hidrogel de niobato. De manera que en el actual estudio se seguirá la estrategia de variar la temperatura y tiempos de tratamiento en la primera etapa de tratamiento químico. El objetivo de este estudio es la obtención de un recubrimiento bioactivo, niobato, de las muestras de titanio con recubrimiento de niobio. 18

19 Materiales y métodos Se utilizan muestras de probeta plana de titanio con las diferentes condiciones de recubrimiento de niobio planteadas. El tratamiento termoquímico aplicado consiste en 3 etapas: 1. Tratamiento químico El tratamiento original consiste en inmersión con una solución de NaOH 5M durante 24h a 60ºC. En este estudio se ha valorado la modificación de los siguientes parámetros: Concentración de la solución de NaOH: 0.1; 0.5; 1; y 5M Temperatura de inmersión: temperatura ambiente (R.T.) y 60 ºC Tiempo de inmersión: 12h y 24h 2. Lavado/Aclarado 3. Tratamiento térmico Se ha efectuado un diseño de experimentos (DOE) para discernir el mejor tratamiento. El resultado se ha valorado a través de la morfología de la capa obtenida por microscopía electrónica de barrido, SEM, y la cuantificación química por espectrometría de energía de dispersión de rayos X, EDS. Resultados y discusión La Tabla 4.1 muestra el diseño de experimentos efectuado y el resumen de los resultados obtenidos para cada una de las caracterizaciones. Concentración NaOH (M) Temperatura (ºC) Tiempo (h) Resultado 5 R.T R.T R.T R.T Tabla 4.1. Diseño de experimento del tratamiento químico de bioactividad sobre superficies de titanio recubiertas de niobio. El resultado en rojo indica una no obtención de la capa bioactiva, en amarillo indica que en algunos casos se ha obtenido y en verde se indica el tratamiento con obtención de niobato. 19

20 Se observa que los tratamientos que han dado mayor estabilidad son las siguientes combinaciones: Solución de NaOH 0.5 M a 60 ºC durante 12 h. Solución de NaOH 0.1 M a 60 ºC durante 24 h. Solución de NaOH 0.1 M a 60 ºC durante 12 h. En las Figuras 4.1, 4.2 y 4.3 se muestran los resultados obtenidos de la capa bioactiva con una concentración química de 0.5 M. Se observa que la topografía del recubrimiento se conserva y el hidrogel permanece sobre la superficie, pero las agujas formadas son de menor tamaño (Figura 4.2). También se observan grietas en algunos recubrimientos, Figura 4.3, de manera que se ha descartado esta concentración de NaOH por no dar a la capa unas condiciones óptimas. Figura 4.1 Imágenes de SEM de las superficies de niobato obtenidas con el tratamiento de bioactividad (0.5 M, RT, 12h). La formación del hidrogel de niobato sódico se forma parcialmente en algunas zonas de la superficie. Barra: 10 y 1 µm, respectivamente. Figura 4.2 Imágenes de SEM de las superficies de niobato obtenidas con el tratamiento de bioactividad (0.5 M, RT, 12h). Las agujas formadas del hidrogel de niobato sódico son de menor tamaño. Barra: 1 µm. 20

21 Figura 4.3 Imágenes de SEM de las superficies de niobato obtenidas con el tratamiento de bioactividad (0.5 M, 60ºC, 12h). La estructura del gel no es óptima ya que aparecen grietas. Barra: 60 y 10 µm, respectivamente. Las Figuras 4.4, 4.5 y 4.6 muestran algunas imágenes de microscopía con la condición de concentración 0.1 M de NaOH. El tratamiento reproduce adecuadamente la topografía de la superficie (Figura 4.4), aunque se observa como parte del recubrimiento se solubiliza (Figura 4.5). En la Figura 4.6 se observan las agujas del niobato. Figura 4.4 Imágenes de SEM de las superficies de niobato obtenidas con el tratamiento de bioactividad (0.1 M, 60 ºC, 12h). Se observa como el tratamiento conserva la topografía del recubrimiento y el hidrogel permanece sobre la superficie. Barra: 10 µm. 21

22 Figura 4.5 Imágenes de SEM de las superficies de niobato obtenidas con el tratamiento de bioactividad (0.1 M, 60 ºC, 12h). Se observa como parte del recubrimiento y del hidrogel se solubiliza. Barra: 10 µm. Figura 4.6 Imágenes de SEM de las superficies de niobato obtenidas con el tratamiento de bioactividad (0.1 M, 60 ºC, 24h). Barra: 6 µm. 22

23 La Figura 4.7 muestra la composición química obtenida mediante EDS de los hidrogeles de niobato formados por las agujas que se han observado en las imágenes SEM anteriores. Principalmente se detecta Ti del sustrato, Al de las partículas de granallado, Nb del recubrimiento y del niobato sódico y Na del niobato sódico. Figura 4.7 Imagen de un EDS tipo obtenido de un hidrogel de niobato. Conclusiones Bajo las condiciones de trabajo y las condiciones actuales de los tres recubrimientos de niobio respecto al titanio granallado control, se puede concluir que: Se puede obtener niobato de sodio pero con baja reproducibilidad del tratamiento. En la mayoría de condiciones de tratamiento se produce la solubilización del gel o menor tasa de reacción. Bajo la condición con mayor estabilidad y repetitividad (NaOH 0,1 M y 60ºC) se ensayará la bioactividad aunque la estructura superficial no sea la óptima. 23

24 Actividad 5: Recubrimiento de Oxido de Zinc Participantes Líder: CPT Empresas: KLOCKNER, COMAS Centros: CTM, BIBITE Objetivos El objetivo principal de esta actividad es el desarrollo de materiales de titanio con un recubrimiento de ZnO y su caracterización física, química y biológica. Las tareas que se derivarán de esta actividad son: 5.1 Obtención de recubrimientos de ZnO por proyección térmica 5.2 Caracterización física 5.3 Caracterización química del recubrimiento 5.4 Caracterización biológica del recubrimiento in vitro Cronograma 5.1 Obtención de recubrimientos de ZnO por proyección térmica 5.2 Caracterización física 5.3 Caracterización química del recubrimiento. 5.4 Caracterización biológica del recubrimiento in vitro Tasca Resultados 5.1 Obtención de recubrimientos de ZnO por proyección térmica CPT Distancia de proyección Se han evaluado condiciones de Baja energía y de Alta energía para la obtención de recubrimientos y se han ensayado 4 distancias de proyección para cada una de las condiciones. Los recubrimientos muestran sensibilidad en el color a las condiciones de alta o baja energía. Los recubrimientos obtenidos con plasmas más energéticos dan recubrimientos gris/amarillo, mientras que los obtenidos con plasma de menor energía generan recubrimientos mas blancos (un factor buscado). Se estudió a su vez que la eficiencia del proceso en las condiciones de baja energía es más sensible a la distancia de proyección (inversamente proporcional) y se concluyó que una distancia óptima de proyección es aproximadamente 60 milímetros. 24

25 Alta Energía Baja Energía Figura 5.1: Probetas en las que se ha proyectado ZnO a diferentes energías. Número de ciclos El crecimiento de la capa es directamente proporcional al número de ciclos de recubrimiento aplicados, tanto en condiciones de baja como de alta energía. Optimización de parámetros de proyección A pesar de ser su eficiencia más sensible a la distancia de proyección, dado que las condiciones de baja energía dan recubrimientos con color más blanco, se ha profundizado en su optimización, con condiciones todavía menos energéticas. Para proveer una mayor transferencia térmica al polvo con condiciones de alta y de baja energía, se ha trabajado sobre los parámetros de los gases, intensidad y ángulo de inyección del polvo. En general la microestructura de los recubrimientos de baja energía presenta más zonas fundidas que las ensayadas previamente. Estas condiciones son más cercanas a las de los equipos industriales utilizados por TMComas, que inyectan el polvo en el interior de la cámara de ionización. TM Comas Los equipos de proyección Plasma de TMComas son diferentes de los del CPT (los caudales de gases no son los mismos y la inyección del polvo es interna). Dada la naturaleza del material proyectado, se han ensayado condiciones especiales, con potencias relativamente bajas. La parametrización se llevó a cabo sobre probetas Standard CPT de Ti grado 5 (la deposición se ha demostrado independiente del sustrato), y con operación semiautomática de la antorcha. En general, las estructuras corresponden a condiciones de alta energía, con estructura fundida con sólo algunas zonas bimodales. Los ensayos llevados a cabo en BIBITE 25

26 demuestran que este tipo de estructura tiene características biológicas adecuadas. Las propiedades mecánicas son también mejores. 5.2 Caracterización física Adherencia Se realizan ensayos según norma ASTM C633 para determinar la adherencia (ensayo a tracción) del recubrimiento sobre el sustrato. Los recubrimientos de alta energía tienen mayor cohesión entre las partículas (que llegan completamente fundidas y solidifican). En los recubrimientos de baja energía una parte de las partículas llega sin fundir y la cohesión entre partículas es más irregular, dando lugar al mecanismo de rotura mixta. En este momento se están estudiando de manera intensiva las condiciones y gruesos de aplicación óptimas. Rugosidad superficial Con cuatro de las condiciones optimizadas de mejor rendimiento, se preparan muestras sobre superficies preparadas con el arenado característico de la rosca del implante (condiciones de fábrica). Los gruesos obtenidos con las nuevas probetas son parecidos al grueso obtenido sobre probetas con acabado superficial obtenido en CPT. Por lo tanto el acabado superficial típico del implante es adecuado para aplicar el recubrimiento de ZnO por proyección Plasma. La estructura obtenida es muy parecida a las probetas de las que se han hecho ensayos in vitro, lo cual hace pensar que las nuevas condiciones también serán adecuadas. 5.3 Caracterización química del recubrimiento Análisis de fases mediante difracción de RAYOS X (DRX) El análisis de fases mediante DRX muestra la presencia de ZnO de estructura hexagonal (wurzita) y con elevada cristalinidad. La fase wurzita es la única fase presente en todos los difractogramas de RX de los recubrimientos obtenidos, independientemente de las condiciones de proyección. Análisis elemental y distribución de fases Mediante EDS se han obtenido los espectros elementales de los varios recubrimientos. Sólo se detecta la presencia de Zn y O además de C en superficie. Los mapas de distribución elemental de los recubrimientos, en sección transversal confirman que el Zn y el O se distribuyen de manera homogénea en todo el recubrimiento. Acabado superficial Los recubrimientos de proyección térmica son siempre rugosos, debido al mecanismo de formación por agregación de partículas discretas. Existen ciertas diferencias entre los recubrimientos obtenidos en alta energía y baja energía. Los recubrimientos obtenidos en condiciones de alta energía presentan una morfología más suave, con zonas donde el 26

27 material ha fundido completamente. Por otro lado, en los recubrimientos obtenidos en condiciones de baja energía, es posible encontrar una texturización micro de los aglomerados y también nano, puesto que las partículas no han llegado a fundirse. Es posible que esta diferente morfología tenga efectos en el comportamiento biológico, a pesar de que no se ha demostrado citotóxicidad. 5.4 Caracterización biológica del recubrimiento in vitro Los resultados de esta tarea se detallan en la actividad 7. Entregables Tal como previsto se ha elaborado la memoria final de esta actividad de acuerdo con su finalización al final de

28 Actividad 6: Aplicación de los recubrimientos en implantes dentales Participantes Líder: KLOCKNER Empresas: KLOCKNER, COMAS, CARRERAS Centros: CTM, BIBITE, CPT Objetivos El objetivo principal de esta actividad es probar la viabilidad de aplicar los recubrimientos estudiados en el producto final. Las tareas que se derivarán de esta actividad son: 6.1 Aplicación de los recubrimientos estudiados a los implantes dentales 6.2 Caracterización física de los implantes. 6.3 Caracterización química de los implantes. 6.4 Caracterización biológica de los implantes in vitro. Cronograma Tareas Aplicación de los recubrimientos estudiados a los implantes dentales 6.2 Caracterización física de los implantes 6.3 Caracterización química de los implantes 6.4 Caracterización biológica de los implantes in vitro. Desarrollo Para transferir la tecnología estudiada en probetas planas a una geometría tridimensional más compleja como son los implantes dentales, se han diseñado por un lado una serie de utillajes que faciliten la posterior industrialización, como así también se ha definido un posible protocolo que define el recorrido de los implantes en todo el proceso. En los siguientes párrafos se resumen los diseños finales obtenidos para cada fase: Diseño y fabricación de un pin transportador. Dada la importancia de evitar, en la medida de lo posible, el contacto y manipulación del implante y de mejorar la trazabilidad en su producción, cada implante se colocará en un pin que servirá para transportarlo y manipularlo durante todo el proceso de recubrimiento. 28

29 Dicho pin transportador se ha fabricado de dos componentes: una base de acero para facilitar la posibilidad de manipulación magnética y la sección superior de titaneo para ajustar al implante evitando problemas de contaminación (figura 6.1) Figura 6.1 Plano de fabricación del pin transportador de implantes. Utillaje para el proceso de recubrimiento de Nb por PVD. El diseño consiste en un plato en donde se encajan 10 pins transportadores con sus implantes correspondientes. Este plato actúa como satélite que rota sobre su eje dentro de la cámara de PVD. Además se ha diseñado un tipo de engranaje de tal forma que permita una tercera rotación en el eje de cada implante para que el espesor del recubrimiento sea homogéneo (figura 6.1). Con un diámetro del plato giratorio de 200mm en el que caben 10 implantes por plato y la posibilidad colocar 30 platos en la cámara, esto significaría una producción de 300 implantes en cada batch. Figura 6.2 Diseño (izquierda) y fabricación final (derecha) del utillaje para el recubrimiento por PVD. Notar que en el diseño inicial se propuso el encaje de 12 implantes por plato que fue luego reducido a 10 para evitar la posibilidad de apantallamiento. 29

30 Utillaje para el proceso de recubrimiento del implante de ZnO por PT. Esta fase del proceso se ha concebido de tal manera que, mediante un sistema de correa se realice el giro de los 12 implantes colocados en línea (figura 6.3a). Los implantes se fijan a través de un eje que cuenta con un imán donde se une con la sección de acero del pin transportador (figura 6.3b) Figura 6.3 a(izq.) Plano de fabricación del sistema de polea y correa que se utiliza para el giro de los implantes. 6.3 b (der.) Plano de fabricación del eje en donde se fija cada uno de los implantes a través de una unión magnética. Por otro lado, para cubrir la sección de la rosca del implante que no debe ser recubierto por el ZnO, se utilizan técnicas de apantallamiento (figura 6.4) Figura 6.4 Imagen de un implante colocado en la línea de proyección (izq.). Placa apantallamiento utilizada (cen). Imagen del proceso de proyección térmica sobre implantes (der). 30

31 Immediat-Os: Certificación FInal Resultados: Recubrimiento de ZnO sobre el cuello del implante mediante Proyección Térmica. En las figuras 6.5 se puede observar el recubrimiento de ZnO logrado sobre toda la superficie del cuello del implante. El recubrimiento resulta continuo y homogéneo y se presenta como una capa de espesor con variaciones muy pequeñas. a b Capa de ZnO c d Figura 6.5 imagen de una sección transversal del cuello del implante en donde se puede observar el recubrimiento de ZnO sobre el total de la superficie mediante microscopia óptica (a) y mediante microscopia electrónica de barrido (c). Detalle en donde se observa la continuidad del espesor de dicha capa mediante microscopia óptica (b) y mediante microscopia electrónica de barrido (d) Recubrimiento de Nb sobre la rosca del implante mediante PVD. Tal como se trabajó en las actividades previas con probeta plana, se realizaron sobre los implantes dos tipos de recubrimiento: Ti + Nb: recubrimento de 80 nm de Ti y 1,2 µm de Nb. Ti + TiNb + Nb: recubrimento de 115nm de Ti + 340nm de TiNb + 1,2µm de Nb. 31

32 En las figuras 6.6 y 6.7 se puede observar el recubrimiento de Nb sobre la totalidad del cuerpo (rosca) del implante. Al igual que lo presentado para el cuello del implante, el recubrimiento de Nb resulta continuo y homogéneo y se presenta como una capa de espesor prácticamente constante. Sin recubrir Recubierto Figura 6.6 Implante dental de Klockner antes de ser recubierto con Nb (izq.) y luego del recubrimiento. Se puede observar a nivel macroscópico un recubrimiento homogéneo que añade un nivel de brillo al implante. Capa de Nb a b Figura 6.7 imagen de una sección transversal del cuerpo del implante en donde se puede observar el recubrimiento de Nb sobre el total de la superficie mediante microscopia electrónica (a). Detalle en donde se observa la continuidad del espesor de dicha capa (b). A partir de las pruebas realizadas se ha demostrado la viabilidad de industrializar el proceso de recubrimiento de Nb sobre implantes dentales. 32

33 Actividad 7: Caracterización in-vitro Participantes Líder: BIBITE Empresas: KLOCKNER; TTC; TMC Centros: CTM, BIBITE Objetivos Caracterización biológica con el fin evaluar las nuevas superficies y procesos de los nuevos implantes respecto a las tecnologías anteriores Las tareas que se derivarán de esta actividad son: 7.1 Caracterización biológica de los implantes in-vitro Cronograma Tareas Caracterización biológica de los implantes in-vitro Desarrollo El factor fundamental que determina el éxito de un implante dental es que sea posible alcanzar la osteointegración. Ello está directamente vinculado con la biocompatibilidad, la cual a su vez se relaciona con sus adecuadas propiedades mecánicas y alta resistencia a la corrosión, entre otras propiedades. En la presente tarea se evalúan la influencia de los diversos recubrimientos de niobio sobre la respuesta biológica in vitro en una línea celular osteoblástica. La cadena de sucesos celulares lógica en la interacción con un biomaterial consiste en la adhesión, proliferación y diferenciación celular a partir de la cual se espera una generación de tejido óseo. 33

34 Materiales Superficies Los parámetros y tiempos estudiados se especifican en la Tabla 7.1. Tabla 7.2. Tiempos de estudio de adhesión, proliferación y diferenciación celular. 4 horas 7 días 14 días Adhesión y morfología celular X Proliferación celular X X X Diferenciación celular X X X Las condiciones seleccionadas, en diámetro 6 mm, para realizar la caracterización in vitro son: Recubrimiento de niobio obtenido por TTC (ref. TTC). Recubrimiento biomimético obtenido por CTM (ref. CTM 72). Recubrimiento reproduce la rugosidad original obtenido por CTM (ref. CTM 73). Titanio granallado y pasivado en HCl 0,6 M obtenido por BIBITE (ref. Ti). Esta condición es la seleccionada como control del estudio, aunque cada técnica puede tener su control interno. Titanio (ref. ti) muestra control Niobio sobre titanio (ref. nb) muestras de titanio recubiertas con Niobio, con capa de anclaje de titanio Titanato ( ref. tit) muestras de titanio a las que se le ha realizado el tratamiento con hidróxido de sodio. Niobato (ref. nbt) muestras de niobio en las que se le ha realizado el tratamiento con hidróxido de sodio. Las muestras se esterilizaron con etanol 70% durante 20 minutos, se lavaron con PBS y se incubaron con medio completo en placas de 48 pocillos justo antes de la siembra celular. Se utilizaron células sembradas directamente en el pocillo (plástico) como control de los experimentos. 34

35 Células La línea celular de osteosarcoma humano SaOs-2 se obtuvo de la American Type Culture Collection. Las células SaOS-2 se cultivó en medio McCoy s 5A (Sigma) a 37ºC a un 5% CO2/95% aire atmosférico y un 100% humedad relativa. El medio se suplementó con un con 50 µg/ml de Penicilina (antibiótico), 50 U/ml de Estreptomicina (antibiótico), 2 nm de L- glutamina (aminoácido esencial) i 15% de suero bovino fetal (aporta nutrientes y factores de crecimiento celular). Para los experimentos, las células se recolectaron cuando alcanzaron un 70-90% de confluencia, mediante Tripsina/EDTA, después se centrifugaron y resuspendieron en medio con suero para inactivar la Tripsina. Se sembraron células en cada muestra en una placa de 48 pocillos. Pasadas 4 horas de adhesión, se retiraron las muestras a analizar para ese tiempo y se añadió medio osteogénico (medio completo suplementado con 50 µg/ml de ácido ascórbico, 10 mm β-glicerofosfato y 100 mm dexametasona) cada dos días hasta los 7 y 14 días. Métodos Adhesión celular Cuatro horas después de la siembra, las muestras se lavaron con PBS y se fijaron con paraformaldehido (PFA) al 4% en PBS durante 20 minutos. Se lavaron las muestras con PBS- Glicina (a 20 mm; se añade para disminuir la autofluorescencia del PFA) y se permeabilizaron las membranas con triton X-100 al 0.05% en PBS durante 15 minutos. Después de lavar las muestras con PBS-Glicina, se bloquearon durante 30 minutos con albúmina bovina sérica (BSA) al 1% en PBS. Se tiñeron los filamentos de actina (cito esqueleto celular) con una solución de PBS con faloidina 1:300 marcada con TRITC (coloración roja). Los núcleos se tiñeron con DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole, 1 µg/ml), una substancia con alta afinidad por el DNA que da color azul cuando se excita con luz ultravioleta. Se adquirieron 15 imágenes por cada triplicado de cada muestra con un microscopio de fluorescencia E600 (Nikon) y se trataron con el programa Cell F (Olympus). Las áreas celulares se cuantificaron utilizando el software Image J ( Proliferación celular El número de células adheridas a 4 horas, así como el número de células que han proliferado durante 7 y 14 días se cuantificó mediante el uso del kit Cytotoxicity Detection Kit LDH (Roche Applied Science). Este kit se basa en la medida de la actividad metabólica, mediante la cuantificación de la actividad de lactato deshidrogenasa (LDH), una enzima que oxida el lactato (presente en el kit) a piruvato. Esta oxidación requiere la reducción de la coenzima NAD+ a NADH, paso que permite la posterior reducción de las sales de tetrazolio (presentes 35

36 en el kit) a sales de formazán, que dan un cambio en la coloración. Este cambio se puede medir mediante espectrofotometría a 492 nm. Después de cada tiempo de cultivo, se lavaron las células para eliminar las muertas y se lisaron con el tampón M-PER (Thermo-Scientific). Se recogió el lisado y se congeló a -80ºC hasta su uso. Se mezclaron 100 µl (de diferentes diluciones, según el tiempo de cultivo. Estas condiciones se testaron previamente) con 100 µl del reactivo del kit y se incubó durante 15 minutos a temperatura ambiente. Finalmente, se añadió una solución STOP y se midieron las absorbancias. Se realizó una dilución seriada de números de células conocidas para extrapolar los valores de absorbancia y así obtener el número de células en cada superficie. Los valores obtenidos de células se dividieron por el área de cada muestra para obtener una densidad celular y poder comparar los resultados con los del control. Diferenciación celular Se analizaron los niveles de fosfatasa alcalina (ALP) a lo largo del cultivo celular. La ALP es un marcador temprano de diferenciación, previo al proceso de mineralización. Su aumento, pues, está relacionado con una estimulación de la diferenciación. El kit (SensoLyte pnpp Alkaline Phosphatase Assay Kit *Colorimetric*; de AnaSpec) lleva pnpp (pnitrophenyl Phospate), un sustrato de la ALP que es defosforilado a un producto que da coloración amarilla y se puede medir a 405nm. A partir del mismo lisado obtenido para la proliferación, se mezcló 50 µl (de diferentes diluciones, testadas previamente) con 50 µl de reactivo del kit. Se incubó a 37ºC durante 35 minutos y se midieron las absorbancias. Se realizó una recta patrón con diferentes concentraciones de ALP purificada, proporcionada por el kit. A partir de ella se extrapoló la absorbancia para conseguir la cantidad de ALP, que se dividió por cada número de células obtenido en la proliferación, para dar así la cantidad de ALP por célula y por tiempo de incubación. Análisis estadístico Los resultados numéricos están representados como la media ± el error estándar de la media. Las diferencias estadísticas se analizaron mediante un test ANOVA seguido de un post tratamiento mediante el test de Tukey s, utilizando un nivel de significancia de p < Resultados y discusión Adhesión celular 36

37 En la Figura 7.1 se puede observar la extensión de las células encima de las superficies analizadas. Se puede ver que las células presentan una morfología redondeada característica del contacto inicial, con algunas células estiradas, iniciando una adhesión fuerte con el sustrato. Se observa un mayor número de células con morfología ortogonal en el plástico, superficie donde se sienten más cómodas, aunque también se observan algunas en las otras superficies. Figura 7.8. Imágenes de la adhesión celular (4h) por microscopía de fluorescencia sobre las superficies: A) plástico, B) titanio, c) niobio, d) titanato y, e) niobato. En rojo se observa el citoesqueleto de actina y en azul el núcleo de las células. Se observa también una distribución celular bastante homogénea en todas las muestras. Se intuye una menor extensión en las muestras de titanato y niobato, así como en la de titanio, respecto al plástico y el niobato que se confirma con la cuantificación de las áreas (Figura 7.2). Se puede deducir que las superficies de niobio y el plástico como control positivo se encuentran en un estado más avanzado de la adhesión celular. 37