Imaging Taste Responses in the Fly Brain Reveals a Functional Map of Taste Category and Behaviour

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Bernardo Álvarez Espejo
hace 5 años
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1 Imaging Taste Responses in the Fly Brain Reveals a Functional Map of Taste Category and Behaviour Sunanda Marella, Walter Fischler, Priscilla Kong, Sam Asgarian, Erroll Rueckert and Kristin Scott.

2 Introducción Drosophila censa el entorno químico mediante cerdas en la probóscide, órganos bucales internos, patas, alas y el órgano ovipositor. Las cerdas se componen de 2 a 4 neuronas gustativas, una neurona mecanosensorial y células de soporte. Neuronas gustativas del órgano ovipositor, patas y alas proyectan sus axones al ganglio torácino, mientras que las de la probóscide y los órganos bucales internos los proyectan al ganglio subesofágico (SOG), a través del nervio labial.

3 Introducción La detección del gusto está mediada por receptores de la familia GR, conformada por distintos sub-poblaciones: por ejemplo Gr5a y Gr66a. Saben que Gr5a y Gr66a son necesarios para llevar a cabo comportamientos de atracción o rechazo, entonces se preguntan: Dichos receptores son selectivos en la detección de ligandos? Su activación es suficiente para generar un comportamiento específico?

4 Métodos Monitorean en vivo la respuesta a distintos sabores de poblaciones definidas de células utilizando el indicador de calcio G-CaMP, expresado a través del sistema GAL4/UAS. Estimulan la probóscide con una pipeta que contiene los distintos compuestos.

5 Enfoque para monitorear la actividad inducida por el sabor en el cerebro SOG Probóscide

6 Neuronas que expresan Gr5a o Gr66a proyectan segregadamente en el SOG.

7 Neuronas que expresan Gr5a o Gr66a proyectan segregadamente en el SOG. Las proyecciones de las neuronas que expresan Gr5a no cruzan la línea media del SOG y son más anteriores. Las proyecciones de las neuronas que expresan Gr66a forman un anillo en la parte media del SOG.

8 Células gustativas responden selectivamente a los ligandos Distribución espacial de la respuesta es diferente frente a un sabor amargo y uno dulce.

9 Células gustativas responden selectivamente a los ligandos Distribución espacial de la respuesta es diferente frente a un sabor amargo y uno dulce. Análisis individual de cambio de fluorescencia en neuronas que expresan Gr5a y Gr66a.

Células gustativas responden selectivamente a los ligandos Distribución espacial de la respuesta es diferente frente a un sabor amargo y uno dulce.

10 Células gustativas responden selectivamente a los ligandos Distribución espacial de la respuesta es diferente frente a un sabor amargo y uno dulce. Análisis individual de cambio de fluorescencia en neuronas que expresan Gr5a y Gr66a. Actividad conjunta de ambos tipos de neuronas. Gr5a responde selectivamente a sabores dulces y Gr66a a sabores amargos. Existencia de un mapa espacial de la actividad del sabor en SOG.

11 Cuán sensible es el método G-CaMP? Incremento en la fluorescencia en neuronas que expresan: Gr5a en un rango de mm de sucrosa y threalosa. Gr66a en un rango de mm de cafeína y 0,1-10 mm de denatonio.

12 En ambos casos observamos una no linealidad entre el cambio en la fluorescencia y la concentración de ligando. Cooperatividad entre el sensor y calcio. No linealidad en eventos de transducción de señal. El método G-CaMP funciona en concentraciones biológicamente relevantes.

13 Continuando con los perfiles de respuesta Exponen las moscas (10 por genotipo, por sabor) a un panel de 24 sustancias, mientras monitorean la actividad por cambios en la fluorescencia en las neuronas de proyección. Usan agua como control.

14 Continuando con los perfiles de respuesta Exponen las moscas (10 por genotipo, por sabor) a un panel de 24 sustancias, mientras monitorean la actividad por cambios en la fluorescencia en las neuronas de proyección. Usan agua como control. Gr5a sólo responde a los compuestos dulces. Gr66a sólo responde a los compuestos amargos. Los perfiles de respuesta de ambas poblaciones celulares no se superponen mayormente.

15 La actividad de las células gustativas se correlaciona con el comportamiento Ensayos de elección entre agar (sustancia neutra) y agar + sustancia a testear. Moscas WT pasan más tiempo en el cuadrante con 100 mm de sucrosa ATRACCIÓN

16 El índice de preferencia (PI) es una medida de atracción o rechazo, donde: PI= 1 PI= 0 PI= % atracción Neutral 100% rechazo. Existe correlación entre sustancias que activan cada receptor y el comportamiento asociado.

17 A nivel de actividad celular se observa que a 1 M NaCl responden ambas poblaciones pero se observa un comportamiento de rechazo. A 10 mm sólo responde Gr5a. En otros experimentos (no mostrados) se observó comportamiento de atracción, aunque aquí no obtienen diferencias significativas.

18 Proponen: Artefactos no específicos por aplicación de 1M de NaCl. La activación de la población Gr5a sola genera atracción, pero si se activan ambas poblaciones, la respuesta de rechazo de Gr66a anula la de Gr5a.

19 Respuesta en sub-poblaciones de células que expresan Gr66a. Saben que existe co-expresión de Gr66a con otros subtipos del mismo receptor: Gr47a y Gr32a.

20 Respuesta en sub-poblaciones de células que expresan Gr66a. (% F/F) Saben que existe co-expresión de Gr66a con otros subtipos del mismo receptor: Gr47a y Gr32a. Ambas poblaciones responden por igual a la mayoría de los compuestos, excepto a azadiractina: se observa reducción en la respuesta de Gr47a.

21 Proponen: Ambos sub-tipos reconocen los mismos compuestos. Poseen diferencias en el reconocimiento de algún compuesto que no fue testeado en este experimento. La activación no está siendo detectada por el método de G-CaMP. La diversidad molecular aparente surge de patrones de expresión transgénica que no recapitulan los patrones de expresión génica endógena.

Activación inducible de neuronas gustativas genera comportamientos asociados VR1 es un canal catiónico de mamíferos que se activa en presencia de capsaicina, componente del

22 Activación inducible de neuronas gustativas genera comportamientos asociados VR1 es un canal catiónico de mamíferos que se activa en presencia de capsaicina, componente del chile picante. Genera comportamiento de rechazo. Expresan VR1E600K en distintas poblaciones, generando: Gr5a-Gal4, UAS-VR1E600K, UAS-GCaMP Gr66a-Gal4, UAS-VR1E600K, UAS-GCaMP

23 Activación inducible de neuronas gustativas genera comportamientos asociados Para corroborar que la expresión transgénica de VR1 es correcta, marcan neuronas gustativas con inmunohistoquímica, usando anticuerpo anti VR1 en probóscide y en SOG.

24 Activación inducible de neuronas gustativas genera comportamientos asociados Para comprobar que VR1 sea activable por capsaicina, presentan 10µM de dicha sustancia y observan cambios en la fluorescencia de las proyecciones (SOG).

25 Activación inducible de neuronas gustativas genera comportamientos asociados Estimulan los distintos transgénicos de VR1 con capsaicina en distintas concentraciones y comparan contra los respectivos controles (transgénicos sin VR1).

26 Activación inducible de neuronas gustativas genera comportamientos asociados Testean efecto comportamental de capsaicina sobre los transgénicos y sobre WT (sin VR1). WT no tiene preferencias: Capsaicina es neutral. Gr5a-VR1 genera atracción entre µM. Gr66a-VR1 genera rechazo entre µM. La activación particular de células que expresan Gr5a es suficiente para generar atracción y que expresan Gr66a lo es para generar rechazo.

27 Discusión Demuestran que las células gustativas reconocen selectivamente diferentes modalidades de sabor, de modo que existe una segregación funcional de las cualidades gustativas en la periferia y en el primer relevo en el cerebro. La activación de estas diferentes neuronas del gusto es suficiente para provocar diferentes comportamientos (atracción o rechazo). En el ganglio sub-esofágico hay un mapa organotópico del gusto. Dentro de la probóscide existen dos diferentes poblaciones de neuronas gustativas que se definen por su expresión del receptor Gr5a o Gr66a. Células Gr5a son necesarias para el comportamiento de atracción hacia compuestos azucarados y Gr66a para evitar compuestos amargos.

28 Discusión En el sistema olfatorio hay un código de activación combinatorio glomerular para la discriminación de los olores. En cambio, las diferentes modalidades de sabor se codifican por la activación de poblaciones neuronales segregadas, lo cual podría complicar la discriminación entre compuestos de la misma modalidad. Tres modelos diferentes se han sugerido para saber cómo es la información del gusto codificado en el cerebro: modelo de líneas mixtas y el modelo de codificación temporal y el modelo de labeled-line: Las células detectan diferentes ligandos de sabor, y esta información permanece segregado a medida que se transmite al cerebro, de modo que los diferentes gustos se distinguen por activación de celdas no superpuestas.

29 GRACIAS!

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