1 Facultad de Ciencias Biológicas y

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1 EFECTO DE Trichoderma harzianum (Monoliaceae) SOBRE EL CRECIMIENTO DE LOS HONGOS ENTOMOPATÓGENOS Metarhizium anisopliae, Beauveria bassiana Y Paecilomyces fumosoroseus (Hyphomycetes) EN LABORATORIO Effect of Trichoderma harzianum (Monoliaceae) on growth of the entomopathogenic fungi Metarhizium anisopliae, Beauveria bassiana y Paecilomyces fumosoroseus (Hyphomycetes) under laboratory conditions Alejandra Nayeli Pérez-López 1, Roberto Lezama-Gutiérrez 1, Oscar Rebolledo- Domínguez 1, Jaime Molina-Ochoa 1, Edelmira Galindo-Velasco 2, Martín González- Ramírez 1 y Cesar Andrés Angel-Sahagún 2. 1 Facultad de Ciencias Biológicas y Agropecuarias, 2 Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad de Colima, Km 40 Autopista Colima-Manzanillo, Tecomán, Colima, CP rlezama@ucol.mx Palabras Clave: Inhibición, Hongo entomopatógeno, Antagonista, Control biológico, México Introducción El hongo Trichoderma harzianum (Monoliaceae) es una especie antagonista que vive de forma parásita junto con otros hongos en contacto directo con las raíces de plantas, suelos, medios foliares o materia orgánica; es utilizado para el control de enfermedades causadas por patógenos fúngicos del suelo en plantas; son fáciles de aislar, cultivar y presentan un crecimiento rápido, en en diversos sustratos (Harman et al., 2004). Los hongos de este género producen metabolitos antibióticos de naturaleza volátil y no volatiles; actúan como degradadores de la pared celular mediante la secreción de enzimas extracelulares como quitinasas, β- glucanasas, proteasas y celulasas, así como metabolitos secundarios, con ayuda de quimiorreceptores y el reconocimiento mediado por lectina (Ezziyyani et al., 2007; Almeida et al., 2007). Además de tener la cualidad de actuar como micoparásitos directos sobre hongos fitopatógenos (Howell, 2003). Estudios in vivo confirman que los hongos antagonistas son inofensivos a las plantas y que son más efectivos en combinación con otros micoparásitos, que cuando actúan individualmente, observándose además, un efecto sinérgico y se concluye que el utilizar dos agentes de control de manera simultánea se tiene la posibilidad de encontrar mejores efectos sobre el patógeno (Ezziyyani et al., 2007). La interacción entre agentes de control biológico de insectos y de fitopatógenos no se ha estudiado extensivamente (Krauss et al., 2004). Estos autores encuentran que el hongo Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sor., es altamente susceptible a los micoparásitos Clonostachys rosea, T. harzianum y Lecanicillium lecanii; Beauveria bassiana (Bals.) Vuill. es afectado solo por C. rosea y Paecilomyces fumosoroseus (Wize) Brown and Smith es resistente a ellos. En México se utilizan hongos entomopatógenos para el control de plagas agrícolas; también se emplea el hongo T. harzianum para el control de enfermedades de plantas, sin embargo, la posibilidad de utilizar estos dos tipos de agentes de control biológico de manera simultanea o en mezcla, no ha sido abordada; por lo anterior, en el presente trabajo se reporta el efecto del hongo T. harzianum sobre el crecimiento micelial de los hongos M. anisopliae, B. bassiana y P. fumosoroseus in Vitro. 422

2 Materiales y Método El presente trabajo se realizó en el Laboratorio de Control Biológico de la Facultad de Ciencias Biológicas y Agropecuarias (FCBA) de la Universidad de Colima. Las cepas de los hongos de T. harzianum, M. anisopliae, B. bassiana y P. fumosoroseus, forman parte de la Colección de Hongos del Laboratorio de Control Biológico de la FCBA de la Universidad de Colima (Cuadro 1). Cuadro 1. Número de cepa, lugar de aislamiento y hospedero de origen, de los hongos T. harzianum, M. anisopliae, B. bassiana y P. fumosoroseus. Cepa Lugar de aislamiento Hospedero Año M. anisopliae (Ma14) Cuauhtémoc, Colima Macrodactylus murinus Bates (Coleoptera: Scarabaeidae) 1994 B. bassiana (Bb108) Armería, Colima Rhynchophorus palmarum L. (Coleoptera: Curculionidae) 2006 P. fumosoroseus (Pfr11) Armería, Colima Bemisia tabaci (Genadius) (Homoptera: Aleyrodidae) 1994 T. harzianum Thz-8 Ahuehuepan, Guerrero Suelo de cultivo de mango 2001 Crecimiento de los hongos. Los hongos M. anisopliae, B. bassiana y P. fumosoroseus se multiplicaron en agar dextrosa Sabouraud enriquecido con el 1% de extracto de levadura y 500 ppm de cloranfenicol (Sneh, 1991), se incubó a 25± 1 C y 12 horas luz/ oscuridad durante 21 días. Las conidias se colectaron en agua destilada estéril con 0.1% de Tween 80 (Arthurs y Thomas, 2001). La cepa de T. harzianum se dejó crecer en PDA a ph 6 en cajas de Petri (Elad et al., 1983). Efecto de T. harzianum sobre el porcentaje de inhibición del crecimiento de M. anisopliae, B. bassiana y P. fumosoroseus. Para este estudio se empleo la técnica del celofán (Elad et al., 1983). Se cortaron círculos de celofán (de 90 mm de diámetro) y se esterilizaron a 15 lbs/pul2 y 120 C, durante 20 minutos. Ya estériles los se colocaron sobre el medio de PDA en cajas de Petri y sobre él, en la parte central, se colocó un disco de 5 mm de diámetro de micelio de T. harzianum; se incubó a 25 C y 12 horas luzoscuridad durante tres. Pasado ese tiempo se retiró el celofán con el hongo T. harzianum; posteriormente a grupos de cuatro cajas se les colocó en el centro discos de 0.5 cm de diámetro de micelio de M. anisopliae, B. bassiana y/o P. fumosoroseus, y se incubaron a 25 C y 12 h luz/oscuridad, durante 12 días. A un grupo de cuatro cajas con PDA se les colocó un disco de 5 mm de diámetro de micelio de T. harzianum y fue considerado testigo; También, se formaron grupos de cajas de petri con PDA, pero sin enzimas extracelulares de T. harzianum y se les colocaron en el centro discos de 5 mm de diámetro de micelio de M. anisopliae, B. bassiana y/o P. fumosoroseus, y se incubaron a 25 C y 12 h luz/oscuridad, durante 12 días (Elad et al., 1983). El experimento se realizó con siete tratamientos y cuatro repeticiones, bajo las normas del diseño completamente al azar. La variable que se consideró es el porcentaje de inhibición del crecimiento radial de la colonia de los hongos entomopatógenos por efecto de los exudados de T. harzianum. La medición del diámetro de la colonia se realizó cada 24 horas. Para evaluar el antagonismo entre T. harzianum y los tres hongos entomopatógenos en cultivos duales se utilizó el medio de PDA. Se formaron seis repeticiones por tratamiento, cada repetición consistió de una caja de petri (de 9 cm de diámetro) con medio de cultivo; un grupo de seis cajas se inocularon con un disco de 5 mm de diámetro del 423

3 hongo M. anisopliae, y lo mismo se hizo para los hongos B. bassiana y/o P. fumoroseus; el disco se colocó a un centímetro de distancia con el borde de la caja de petri y por el lado opuesto, a la misma distancia se colocó un disco de 5 mm de diámetro del hongo T. harzianum, después fue incubado a 25 C con un fotoperíodo de 12 h de luz/oscuridad, durante 12 días en incubadora. Como testigos se colocaron un disco de 5 mm de diámetro del hongo M. anisopliae, y lo mismo se hizo para los hongos B. bassiana, P. fumoroseus y T. harzianum (Elad et al., 1983). La clase de antagonismo fue evaluada con la escala propuesta por Bell et al. (1982). Con cinco niveles; en la clase 1= El antagónico (T. harzianum) sobrecrece completamente al entomopatógeno, clase 2= El antagónico sobrecrece al menos dos terceras partes al entomopatópatógeno, clase 3= El antagónico y el entomopatógeno colonizan aproximadamente la mitad de la superficie del medio y ninguno de los dos organismos dominan uno sobre el otro, clase 4= El entomopatógeno coloniza al menos dos terceras partes de la superficie del medio y aparentemente resiste la invasión del organismo antagónico y la clase 5= El entomopatógeno sobrecrece completamente a Trichoderma y ocupa totalmente la superficie del medio. También el porcentaje de inhibición se calculó mediante la siguiente ecuación: P.I.= (C-T/C) X 100, donde P.I es el porcentaje de inhibición del crecimiento radial de la colonia de los hongos entomopatógenos por T. harzianum; C = es la medida del diámetro de la colonia del hongo entomopatógeno, que creció sin el efcto de T. harzianum (testigo) y T = es el crecimiento de diámetro de la colonia del hongo entomopatógeno bajo el efecto del hongo T. harzianum (Sivakumar et al., 2000). Los datos expresados en por ciento de inhibición se transformaron en arco seno (Reyes, 1977) antes de ser sometidos a un análisis de varianza y prueba de comparación de medias por el método de Tukey (P>0.05) con el paquete de análisis estadístico SAS versión 6.12 (SAS, 1998). Resultados Inhibición del crecimiento de M. anisopliae, B. bassiana y P. fumosoroseus por el hongo T. harzianum, mediante la técnica de celofán. Se encontró que el hongo T. harzianum fue capaz de inhibir el crecimiento de las colonias de los hongos M. anisopliae, B. bassiana y P. fumosoroseus (figura 1). El análisis de varianza indicó diferencias altamente significativas entre tratamientos (F cal. = 7.99; Pr > F = ). La prueba de medias separó en dos grupos a los tratamientos, el formado por M. anisopliae que presentó un crecimiento de la colonia de 3.62 mm como más sobresaliente y los tratamientos P. fumosoroseus y B. bassiana con 2.3 y 1.6 mm fueron los menos sobresalientes. Figura 1. Crecimiento radial de la colonia de M. anisopliae, P. fumosoroseus y B. bassiana, bajo el efecto de exudados del hongo T. harzianum mediante la técnica de celofán. Inhibición del crecimiento de M. anisopliae, B. bassiana y P. fumosoroseus por 424

4 Crecimiento (mm) T. harzianum en cultivo dual. Se encontró que T. harzianum creció mas de las dos terceras partes de la caja de petri en presencia de los hongos de M. anisopliae, B. bassiana y P. fumosoroseus; sin embargo, T. harzianum no sobrecreció las colonias de los hongos entomopatógenos y observó un halo entre ambos hongos. En el caso de M. anisopliae se observó un halo de 2 mm de separación entre el antagónico y Ma; en P. fumosoroseus el halo midió 4 mm y en B. bassiana 9 mm, (figura 2). Según la escala de Bell et al. (1982), la clase de antagonismo en cultivo dual corresponde a la clase 2. El análisis de varianza indicó que diferencias altamente significativas entre tratamientos, que incluyó el crecimiento radial de la colonia de las tres especies de hongos entomopatógenos en cultivo duales y cultivos de manera individual (F cal =18.06; Pr > F = ). La prueba de medias separó a los tratamientos formados por los tres hongos entomopatógenos cultivados de manera individual y a la asociación T. harzianum y Ma, como los más sobresalientes, con un crecimiento de la colonia comprendidos entre 44.5 a 54.9 mm de diámetro, mientras que los hongos en cultivo dual crecieron entre 21.5 y mm, el hongo B. bassiana y P. fumosoroseus fueron los mas afectados por el hongo T. harzainum (figura 3). El porcentaje de inhibición del crecimiento radial de la colonia de los hongos entomopatógenos M. anisopliae, B. bassiana y P. fumosoroseus, por el hongo T. harzianum, calculado con base en la fórmula propuesta por Sivakumar et al. (2000), indicó que el hongo B. bassiana, P. fumosoroseus y M. anisopliae fueron los de mayor a menor afectados en su crecimiento con 53, 48 y 25 %, respectivamente. Figura 2. Cultivo doble de los hongos entomopatógenos, B. bassiana, P. fumosoroseus, M. anisopliae y T. harzianum. 60 Serie Ma Bb Pfr Ma+Th Pfr+Th Bb+Th TRATAMIENTOS Figura 3. Efecto del hongo T. harzianum sobre el crecimiento en milímetros de los hongos entomopatógenos M. anisopliae, B. bassiana y P. fumosoroseus, en cultivo doble. Discusión y Conclusiones Se demostró que el hongo T. harzianum tiene capacidad de inhibir el crecimiento de 425

5 los hongos M. anisopliae, B. bassiana y P. fumosoroseus, medido tanto por el método de cultivo dual y/o doble, mediante la técnica del celofán. El hongo T. harzianum creció en la caja petri en más de las dos terceras partes de la caja; lo anterior, posiblemente se deba a las diferencias en la cinética de crecimiento de T. harzainum, tal como lo reporta (Howell, 2003; Harman et al., 2004) y la de los hongos entomopatógenos M. anisopliae, B. bassiana y P. fumosoroseus, que presentan una velocidad de crecimiento más lenta, aunque también se observó que entre los entomopatógenos hay diferencias en su velocidad de crecimiento, el P. fumosoroseus creció con una mayor velocidad que M. anisopliae y B. bassiana, cuando no está bajo el efecto de los exudados de T. harzianum. Sin embargo, el hongo M. anisolpiae desarrolló mayor crecimiento respecto al de B. bassiana y P. fumosoroseus, alcanzando en promedio en cultivo dual y por la técnica de celofán, que los otros hongos; posiblemente la formación de un halo de separación entre el entomopatógenos y el T. harzianum evitó que este último no sobrecreciera sobre ninguno de los hongos entomopatógenos posiblemente T. harzianum compite de forma directa por el espacio y nutrientes, y tal vez los entomopatógenos producen enzimas que inhiben las de T. harzianum, aunque faltaría por investigarse este fenómeno. El antagonismo de Trichoderma está basado sobre diferentes mecanismos que incluyen la producción de metabolitos antifúngicos, competencia por espacio y nutrientes, micoparasitismo (Szekers et al., 2006), se conoce que las especies de Trichoderma producen cerca de 40 diferentes metabolitos que contribuyen a la acción micoparásica y/o antibiótica (Aneja et al., 2006). Las enzimas hidrolíticas son el factor más importante que contribuye a la actividad de biocontrol de las especies de Trichoderma. Es posible que T. harzianum presente estos mecanismos como fenómenos de antagonismo sobre los hongos entomopatógenos, por lo que se hacen necesarios más estudios donde se demuestre el efecto de estas enzimas hidrolíticas y otros metabolitos secundarios, así como la actividad micoparasítica que pudiera presentar T. harzianum, sobre los entomopatógenos, tal como reporta Krauss et al., (2004) con M. anisopliae, B. bassiana y P. fumosoroseus, donde también reporta diferencias en susceptibilidad hacia T. harzianum. Literatura Citada Almeida, F., F. Menezes, R. Do Nascimento, C. Ulhoa, y A. López Mycoparasitism studies of Trichoderma harzianum strains against Rhizoctonia solani: evaluation of coiling and hydrolytic enzyme production. Biotechnol. Lett. 12: Aneja, M., T. J. Gianfagna y P. K. Hebbar Trichoderma harzianum produces nonanoic acid, an inhibitor of spore germination and mycelial growth of two cacao pathogens. Physiol. Mol. Plant Pathol. 673: 1-4. Arthurs, S. y M. B. Thomas Effect of dose pre-mortem host incubation temperature and thermal behavior on host mortality, mycosis and sporulation of Metarhizium anisopliae var. acridum in Schistocera grgaria. Biocontrol Sci. Technol. 11: Bell, D. K., H. D. Wells y C. R. Markham In vitro antagonism of Trichoderma species against six fungal pathogens. Phytopathology 72 (4): Elad, Y., I. Chet, P. Boyle y Y. Henis Parasitism of Trichoderma sp on Rhizoctonia solani and Sclerotium rolfsii-scanning electron microscopy and fluoresce microscopy. Phytopathology 73: Ezziyyani, M., M. E. Requena, C. Egea-Gilabert, y M. E. Candela Biologycal control of Phytophthora root rot of pepper using Trichoderma harzianum and 426

6 Streptomyces rochei in combination. Journal Phytopathology 155: Harman, G. E., C. R. Howell, A. Viterbo, I. Chet, y M. Lorito Trichoderma species opportunistic, avirulent plant symbionts. Microbiology Nature Review 2: Howell, C. R Mechanisms employed by Trichoderma species in the biological control of plant diseases: the history and evolution of current concepts. Plant Dis. 87:4-10. Krauss, U., E. Hidalgo, C. Arroyo y S. R. Piper Interaction between the entomopathogens Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae and Paecilomyces fumosoroseus and the mycoparasites Clonostachys spp., Trichoderma harzianum and Lecanicillium lecanii. Biocontrol science and Technology 14: Reyes, C. P Bioestadística aplicada. Primera edición. Trillas, México. SAS, SAS Institut, Inc. SAS/STAT user s, release 6.12, ed. SAS Institut, Inc. Cary, North Carolina. Sneh, B Isolation of Metarhizium anisopliae from insects on an improved selective medium based on wheat germ. J. invertebr. Pathol. 58: Sivakumar, D., R. S. Wilson-W., R. L. C. Wijesundera, F. M. T. Marikar y A. Abeyesekere Antagonistic effect of Trichoderma harzainum on post harvest pathogens of rambutan Nepheliu lappaceum. Phytoparasitica 28 (3): Szekeres, A., B. Leitgeb, L. Kredics, L. Manczinger y C. VágvÖlgyi A novel image analysis-based method for the evaluation of in Vitro antagonim. J. Microbiol. Methods 65: