AVANCES EN EL CONTROL BIOLOGICO DE LA CENICILLA DEL CHILE Leveillula taurica EN CHIHUAHUA, MEXICO.

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1 AVANCES EN EL CONTROL BIOLOGICO DE LA CENICILLA DEL CHILE Leveillula taurica EN CHIHUAHUA, MEXICO. César Guigón-López 1, Layla Muñoz-Castellanos 2 1 Centro de Investigación en Recursos Naturales (CIRENA). Antigua Normal Rural. Salaices, Chihuahua. México. c_guigon@hotmail.com. 2 Facultad de Ciencias Químicas. UACH. Domicilio Conocido, Nuevo Campus Universitario, Chihuahua, Chih. México. Resumen La cenicilla causada por el hongo Leveillula taurica es uno de los principales problemas que enfrenta el cultivo del chile en el estado de Chihuahua. Debido a que el control químico ha demostrado elevar los costos de producción sin un control adecuado del problema, se contempla el empleo de organismos antagonistas que puedan reducir el impacto de la enfermedad sobre el cultivo y el impacto de los fungicidas químicos sintéticos sobre el medio ambiente. Durante los últimos dos ciclos agrícolas se evalúan los hongos Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae y Trichoderma asperellum. La capacidad de colonizar y establecerse sobre el follaje de las plantas es mayor para B. bassiana y T. asperellum. Sin embargo la producción de antibiosis fue mayor para M. anisoplia y T. asperellum. Se sigue evaluando esta actividad así como la producción de enzimas quitinasas y glucanasas por parte de los hongos antagonistas. En campo T. asperellum y M. anisopliae muestran un nivel de control similar al del fungicida químico sintético propiconazol. Palabras clave: Antagonismo, Capsicum annuum, Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae, Trichoderma asperellum Introducción La cenicilla es una enfermedad que afecta a los diferentes tipos chile que se cultivan en el Estado de Chihuahua y es causada por el hongo Leveillula taurica, convirtiéndose en los últimos años en uno de los principales problemas fitosanitarios (Guigón y González, 2001). Para el control de la enfermedad, comúnmente se emplean diferentes fungicidas químicos sintéticos como propiconazol, tebuconazol, kresoxim metil,

2 Azoxistrobin y fenarimol, así como compuestos de sodio y potasio (bicarbonatos y silicatos). El uso intensivo de los fungicidas químicos sintéticos genera serios incrementos en los niveles de contaminación ambiental y aunado a ello recientemente se han reportado incrementos importantes en la resistencia de L. taurica a ciertos fungicidas del grupo de las estrobilurinas. Ante este panorama, se propone una nueva estrategia que involucra el uso de biocontrol dual, es decir el empleo de microorganismos antagonistas de insectos y de microorganismos fitopatógenos (Brand et al. 2009; Ownley, 2010). B. bassiana es un hongo habitante del suelo de distribución cosmopolita. Ataca un amplio rango de insectos y ácaros (De Luca et al. 2004). Asimismo, es bien conocido el antagonismo de varias especies de Beauveria contra hongos y bacterias por lo que es recomendable su uso en programas de manejo integrado de plagas y enfermedades de diversos cultivos. El mecanismo primario por el cual actúa es la producción de metabolitos bioactivos, como las beauvericina, bassianolida y oosporeina que limitan el crecimiento de fitopatógenos (Oller et al. 2005). Asimismo, este hongo induce resistencia sistémica cuando crece endofíticamente sobre las plantas. La competencia por espacio y el micoparasitismo también se han reportado. Para diversas especies del hongo Trichoderma se ha observado patogenicidad contra insectos y nematodos, así como el biocontrol de diversos agentes fitopatógenos. Sus principales mecanismos incluyen antibiosis, micoparasitismo, competencia por nutrientes y espacio e inducción de mecanismos de resistencia en las plantas (Hartman, 2006). De M. anisopliae existe amplia información sobre su capacidad patogénica sobre insectos, no obstante se dispone de poca información sobre su actividad contra microorganismos fitopatógenos. Ha sido recomendado contra una gran diversidad de insectos fitófagos y ácaros, en muchos cultivos, y regiones diferentes (Barajas et al. 2010). Sin embargo, estudios recientes han demostrado la regulación diferencial de genes que codifican enzimas hidrolíticas, proteínas de la pared celular, toxinas, proteasas, péptidos antimicrobianos y otras moléculas que sugieren que esta especie posee la habilidad para atacar diferentes organismos (Freimoser et al. 2005). Estos estudios también demostraron similitudes entre M. anisopliae y T. reesei en cuanto a la regulación de su metabolismo. Es poca la información que existe en México sobre este tema, por lo cual el presente estudio se estableció con el OBJETIVO de determinar el potencial de tres hongos antagonistas como agentes de control biológico de la cenicilla del chile.

3 Fig. 1. Síntomas y signos de cenicilla y daños al cultivo de chile jalapeño. Materiales y Métodos Los trabajos se han desarrollado durante los años 2012 y Salvo que se indique lo contrario, la información que se presenta corresponde al Los hongos antagonistas en estudio son: Trichoderma asperellum, Beauveria bassiana y Metarhizium anisopliae. Las cepas de B. bassiana y M. anisopliae se obtuvieron en el Centro Nacional de Referencia de Control Biológico del SENASICA en Tecomán, Colima. T. asperellum cepa TC74 se obtuvo del cepario del CIRENA. En laboratorio los hongos se reprodujeron en medio de cultivo papa-dextrosa-agar o agar Sabouraud, para posteriormente producir inoculo (4 x 10 8 conidias ml -1 ) mediante fermentación en granos de arroz. En laboratorio también se evaluó la capacidad de los hongos para producir compuestos antibióticos mediante la técnica de papel celofán. Esta actividad se evaluó cuantificando la inhibición del crecimiento de los hongos fitopatógenos Phytophthora capsici y Botrytis cinerea. Asimismo, se evaluó la capacidad de extractos crudos de cultivos líquidos de los hongos antagonistas para inhibir la germinación de esporas de Alternaría alternata. Actualmente se cuantifica la producción de enzimas quitinasas y glucanasas cultivando los antagonistas en medio mínimo enriquecido con esporocarpos de Agaricus bisporus más fibra de cereal.

4 Fig. 1. Reproducción de los hongos antagonistas en granos de arroz y biopreparados evaluados. En invernadero se cuantificó la colonización endofítica de los hongos. Para ello se establecieron macetas con plantas de chile tipo jalapeño, árbol y chilaca las cuales se inocularon artificialmente con cada uno de los hongos benéficos a razón de 2 L/Ha. A los 15 y 30 días después de la inoculación se realizaron muestreos de hojas. La colonización se determinó en laboratorio, mediante la técnica de dilución en placa. Los tratamientos evaluados se integraron por las combinaciones de los tipos de chile (3) x los hongos (3). Se establecieron 5 repeticiones para cada tratamiento. Se llevó a cabo ANOVA mediante un diseño completamente al azar y separación de medias mediante Tukey (P= 0.05). En campo se establecieron parcelas experimentales en terrenos de dos productores cooperantes. Una de las parcelas se estableció con chile de árbol criollo de baja tecnología. Se establecieron dos bloques de 68 surcos de 100 m de longitud. Cada bloque se subdividió en cuatro secciones sobre la base de los tratamientos a evaluar (tres hongos y un control químico). Cada sección consistió de 17 surcos de 100 m de longitud. Otro predio se estableció con chile jalapeño de alta tecnología, con tres bloques de 94 m de longitud. En cada bloque se distribuyeron los mismos cuatro tratamientos, y la parcela experimental consistió de 17 surcos de 94 m. Los hongos se aplicaron mediante suspensión acuosa a una concentración de 4 x 10 8 conidias ml -1 y una dosis de 2 y 3 L ha -1. El control químico se aplicó según las instrucciones del fabricante. Las variables respuesta fueron incidencia de plantas enfermas y severidad de síntomas. En ambas parcelas, el manejo del cultivo fue realizado por el agricultor

5 cooperante. Se realizó ANOVA mediante un diseño en bloques al azar y separación de medias mediante Tukey (P= 0.05). Resultados y Discusión Se detectó capacidad de producir compuestos antibióticos por parte de las cepas estudiadas. Las especies T. asperellum (Ta) y M. anisopliae (Ma) mostraron los mejores resultados al inhibir de mayor forma que Beauveria bassiana (Bb) (Tukey P< 0.05) el crecimiento de Phytophthora capsici y Botrytis cinerea (Fig. 2). La germinación de esporas de A. alternata fue afectada únicamente por la acción de Ta que mostró la mayor inhibición (35%) (Tukey P <0.05), seguido de Ma (21%) y Bb (23%). Se tienen avances en este 2013, sobre la producción de enzimas hidrolíticas por parte de los antagonistas, detectándose actividad N-acetilglucosaminidasa, quitobiosidasa y endoquitinasa. También se detectó actividad β-1,3 glucanasa. El perfil enzimático se encuentra en evaluación. Fig. 2. Actividad antibiótica de los tres hongos antagonistas sobre hongos fitopatógenos. Los hongos antagonistas mostraron capacidad de colonizar el follaje de las plantas de chile (Fig. 3), la cual fue diferente (P< 0.01) entre hongos mas no entre tipo de chile.

6 Fig. 3. Evaluación de la colonización de las plantas de chile por tres hongos antagonistas. Las poblaciones de Ta y Bb fueron mayores a las de Ma (Tukey P< 0.05). Solo para Bb hubo diferencias entre tipos de chile, siendo chile jalapeño el menos colonizado. Estos datos variaron al paso de los días después de la primera aplicación (ddpa). La incidencia y severidad de la cenicilla en campo mostró diferencias por efecto de los tratamientos (P< 0.01). En chile árbol, ciclo 2012, se realizaron 3 aplicaciones de los tratamientos (Fig. 4). Para el mes de septiembre los niveles en Ta y Propiconazol (Control) fueron menores a los observados en Bb y Ma (Tukey P<0.05). Al final del cultivo (octubre) todos los tratamientos mostraron similar incidencia y severidad (P> 0.01).

7 ab b ab a Fig. 4. Panorámica de la parcela de chile de árbol y cuantificación de los niveles de cenicilla. Barras con desigual letra son estadísticamente diferentes (Tukey P= 0.05). En chile jalapeño, ciclo 2013, debido a las lluvias de verano solo fue posible evaluar parcialmente la acción de los hongos. Se realizaron solo dos aplicaciones durante el mes de junio con intervalo de 20 días (Fig. 5). A mediados de julio la severidad de la enfermedad fue mayor en Bb (P> 0.05), seguida de Ma que fue similar a Ta y por el control químico (Propiconazol y silicato de potasio). A finales de julio la enfermedad se incrementó fuertemente, continuando el mismo patrón de mayor severidad en Bb (P> 0.05).

8 c b b a Fig. 5. Panorámica de la parcela de chile jalapeño y cuantificación de los niveles de cenicilla. Barras con desigual letra son estadísticamente diferentes (Tukey P= 0.05). Los resultados del presente trabajo muestran que existen posibilidades reales para el control de la cenicilla empleando hongos antagonistas. De los microorganismos estudiados, T. asperellum y M. anisopliae son las especies más promisorias ya que mostraron atributos importantes como un buen establecimiento sobre el follaje de las plantas, actividad antibiótica y producción de enzimas capaces de degradar la pared celular de hongos fitopatógenos. A la fecha los mejores resultados se han observado en chiles criollos de tipo árbol. En jalapeño no ha sido posible completar la evaluación, sin embargo preliminarmente la severidad observada indica que serán necesarios mayores esfuerzos al integrar diversas estrategias que complementen la actividad biocontroladora de los hongos evaluados. Literatura Citada

9 Barajas, C.G., E.M. del Pozo, García, I., y A. Méndez Obtención de conidios del aislamiento Ma-002 de Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sorokin mediante una alternativa de cultivo bifásico. Rev. Protección Veg. 25 (3): Brand, M., Y. Messika, Y. Elad, D. R. David and A. Sztejnberg Spray treatments combined with climate modification for the management of Leveillula taurica in sweet pepper. Eur J Plant Pathol 124: De Luca F., M. Baldessari, C. Longa and I. Pertot Antagonistic activity of the entomopathogenous fungus Beauveria bassiana against grapevine pathogens: perspective of combined use against insects and fungi. Management of plant diseases and arthropod pests by BCAs. IOBC/wprs Bulletin Vol. 27(8): Freimoser F. M., G. Hu and R. J. St Leger Variation in gene expression patterns as the insect pathogen Metarhizium anisopliae adapts to different host cuticles or nutrient deprivation in vitro. Microbiology (2005), 151, Guigón, L. C. y P. G. González Estudio regional de las enfermedades del chile (Capsicum annuum L.) y su comportamiento temporal en el sur de Chihuahua, México. Revista Mexicana de Fitopatología 19 (1): Harman, G Overview of Mechanisms and Uses of Trichoderma spp. Phytopathology 96, Oller, J. L., M. Iranzo, S. Mormeneo, E. Oliver, J. M. Cuerva and J. E. Oltra Bassianolone: an antimicrobial precursor of cephalosporolides E and F from the entomoparasitic fungus Beauveria bassiana. Org. Biomol. Chem. 3: Ownley, B. H., K. D. Gwinn and F. E. Vega Endophytic fungal entomopathogens with activity against plant pathogens: Ecology and evolution. BioControl 55: