INSTITUTO DOMINICANO DE INVESTIGACIONES AGROPECUARIAS Y FORESTALES

Transcripción

1 INSTITUTO DOMINICANO DE INVESTIGACIONES AGROPECUARIAS Y FORESTALES 7mo Congreso de la Sociedad Dominicana de Investigadores Agropecuarios y Forestales (SODIAF) Efectividad in vitro de 18 cepas nativas de Trichoderma spp. en el manejo de Fusarium solani, Rhizoctonia solani, Athelia rolfsii y Phytophthora capsici, patógenos de suelos bajo ambiente protegido Socorro García, Graciela Godoy Lutz, Colmar A. Serra socorrogarciap@hotmail.com PROYECTO CONIAF-UASD Bávaro, Punta Cana, República Dominicana. 10 de noviembre de 2016

2 INTRODUCCIÓN El cultivo de ají (Capsicum annuum L.) en invernaderos de la R. D., es afectado por fitopatógenos de suelos, entre los cuales están: Fusarium spp., Rhizoctonia solani, Phytophthora capsici y Athelia rolfsii. El uso continuo de fungicidas químico-sintéticos Aumento aparición resistencias, Contaminación ambiental Incremento en el costo de producción Disminución rentabilidad y Presencia residuos en cosechas (García et al, 2006).

3 INTRODUCCIÓN La utilización del manejo biológico con el hongo Trichoderma es una de las herramientas mas promovidas para el control de los fitopatógenos de suelos (Cholango 2009). Cepas de Trichoderma spp. suprimieron significativamente en platos de Petri el crecimiento micelial de Fusarium solani, Phytophthora spp., Pythium spp., Rhizoctonia spp., y Athelia rolfsii (Moya et al 2003).

4 INTRODUCCIÓN En invernadero de San José de Ocoa, Hubert (2008) reportó la presencia en agua de riego y sustratos utilizados, los hongos: Fusarium (100%), Phythophthora (50%) y Rhizoctonia (41.5%)

5 INTRODUCCIÓN En República Dominicana existen aprox. 520 hectáreas de vegetales en invernadero, dedicadas principalmente: Ajíes (70%), Tomates (10%), Pepinos (15%), Hierbas aromáticas (5%), (PROMEFRIN, 2011). En el año 2014 la producción estimada de los invernaderos fue de mil toneladas, mil se exportaron y generaron US$ 52.8 millones; el resto se comercializó internamente y generó RD$ millones (PROMEFRIN, 2014).

6 INTRODUCCIÓN El uso de Trichoderma spp. para el manejo de estos fitopatógenos, evita rechazo de exportaciones por contaminación con residuos de plaguicidas. También se podrían reducir los costos de producción (García et al. 2006). El empleo de cepas nativas de Trichoderma spp. tiende a ser mas ventajoso que las introducidas: Establecimiento de microempresas nacionales, Ahorrarían divisas, obtención de alimentos inocuos, Adaptadas al agroecosistema local.

7 OBJETIVO Determinar el efecto antagonista in vitro de 18 cepas nativas y 2 comerciales de Trichoderma spp. comparado con fungicidas comerciales uno orgánico y otro químico-sintético, sobre fitopatógenos de suelos.

8 MATERIALES Y MÉTODOS Localización del estudio: Estación Experimental del Instituto Dominicano de Investigaciones Agropecuarias y Forestales (IDIAF) en Mata Larga, San Francisco de Macorís, República Dominicana. Altitud Pluviometria anual Temperatura promedio 150 msnm 1,450 mm 26.2 C LABORATORIO DE PROTECCIÓN VEGETAL

9 MATERIALES Y MÉTODOS Microorganismos antagónicos: 18 cepas nativas y 2 comerciales (introducidas) de Trichoderma. Las nativas proceden de aislamientos en suelos, sustratos y raíces en invernaderos de las provincias: La Vega, San José de Ocoa y Espaillat. Fueron identificadas por secuenciación de la región ITS radn. Obtenidas bajo el proyecto, "Determinación de Alternativas Biológicas para el Control de Patógenos de Suelos en la Producción de Vegetales en Invernadero.

10 MATERIALES Y MÉTODOS a b c d e f Fig. 1. a)t.asperellum-1a; b) Tx-1D (no identificada); c)t. asperellum-2f; d)t. asperellum-6b; e) T. asperellum- 7A; f) T. asperellum-10a;

11 MATERIALES Y MÉTODOS g h i j k l Fig. 2. g) T. asperellum-11a; h) T. longibrachiatum-12a; i) T. harzianum-13a; j) T. harzianum-16b; k) T. harzianum-19b, l) T. asperellum-22c;

12 MATERIALES Y MÉTODOS m n o p q r Fig. 3. m) T. asperellum-25b; n) T. asperellum-27a; o) T. asperellum-28a; p) T. asperellum-31c; q) T.asperellum-36A; r) T. asperellum-37b.

13 MATERIALES Y MÉTODOS Material biológico comercial: Fig. 4. T. lignorum (Mycobac ) Fig. 5.T. harzianum (PHC PlantShield )

14 MATERIALES Y MÉTODOS Tabla 1. Fitopatógenos utilizados en los ensayos Especie Código del ensayo Lugar de procedencia Fusarium solani Fs Hermanas Mirabal Rhizoctonia solani Rs Hermanas Mirabal Athelia rolfsii Ar Hermanas Mirabal Phytophthora capsici Pc Espaillat

15 MATERIALES Y MÉTODOS a b c Fig. 6. a) F. solani; b) R. solani; c) P. capsici; d) A. rolfsii d

16 MATERIALES Y MÉTODOS Fungicidas: Aceites orgánicos (Biomaster ), a base de varios aceites de plantas: aceite de clavo (6 %), aceite de sésamo (5 %), aceite de romero (3 %) aceite de tomillo (3 %), total aceites de tipo 25B (17 %). Un fungicida químico sintético: (i.a. azoxystrobin o azoxistrobina); nombre comercial Criba 25 SC (Mahomoya Lifesciences Pvt.. Ud., India).

17 MATERIALES Y MÉTODOS Medio de cultivo Papa Dextrosa Agar (PDA) -Antibiótico (Amoxicilina) -Acido láctico (85%): 2 ml/litro 30 gotas/litro Plato Petri: 86 mm de diámetro con 10 ml de PDA Cultivo: Discos de micelios de 5 mm de diámetro Incubación: C. en la oscuridad

18 MATERIALES Y MÉTODOS A. rolfsii T. asperellum-10a Figura 7 Cultivo dual

19 MATERIALES Y MÉTODOS Tratamientos: Tabla 2. Descripción de los tratamientos en laboratorio (40 tratamientos) n Tratamientos Descripción 4 Testigos relativos de patógenos 20 Trichoderma vs. patógenos Cada patógeno cultivado frente a un disco PDA solo. Cada cepa de Trichoderma spp. enfrentada con cada patógeno. 8 8 Aceites orgánicos vs patógenos Fungicida químico-sintético vs. patógenos Cada patógeno sembrado en medio de cultivo (PDA) dos dosis de los aceites orgánicos. Cada patógeno enfrentado con el fungicida químico sintético en un disco de papel filtro, y además sembrado en PDA una dosis del fungicida químico.

20 MATERIALES Y MÉTODOS Número de ensayos El estudio se realizó en cuatros ensayos: Tabla 3. Tratamientos en los ensayos con los cuatros hongos fitopatógenos. No. Tratamientos Patógenos Cepas nativas Cepas comerciales Fungicida químico Aceites orgánicos 1 F. solani T. asperellum (13) T. harzianum (3) T. longibrachiatum (1) Trichoderma sp. (1 no id. x) T. lignorum (Mycobac 10 WP)¹ T. harzianum (PHC PlantShield 1.15 WP)² Azoxistrobina (Criba 25 EC) ³ Biomaster 4 2 R. solani " " " " 3 A. rolfsii " " " " 4 P. capsici " " " " Leyenda: ¹Laverlam, S. A., Colombia, 2 Plant Health Care, México, 3 Mahomoya lifesciences Pvt. Ud., India, 4 Global Bio Tecnologies & Trading LLC, USA

21 MATERIALES Y MÉTODOS Diseño experimental Completamente al azar (DCA) 4 repeticiones. Unidad experimental: 1 plato de Petri.

22 MATERIALES Y MÉTODOS Variables evaluadas: 1. Crecimiento micelial radial en mm. Cada 24 horas hasta 192 horas

23 MATERIALES Y MÉTODOS Antagonista Patógeno Figura 8. Crecimiento micelial radial.

24 MATERIALES Y MÉTODOS Variables evaluadas 2. Nivel de supresión (Ns) del patógeno (%) Se utilizó la fórmula de mortalidad corregida de Abbott (1925) modificada: donde : Ns (%) = (Cpt-CpT) 100 Cpt Cpt= Crecimiento del patógeno en el testigo. CpT=Crecimiento del patógeno vs. Trichoderma sp.

25 MATERIALES Y MÉTODOS Análisis Estadístico Se realizó análisis de varianza no paramétrica Kruskal-Wallis, p. 5 %, al no cumplir con los supuestos y análisis de contrastes ortogonales, (programa estadístico Infostat 2013, Univ. Nac. Cordoba, Argentina).

26 RESULTADOS Fig. 9. Porcentaje supresión crecimiento micelial de F. solani en presencia de los diferentes tratamientos en un periodo de 24 a 192 horas. 192 h 69.8 cdefgh 76.3 h 72.9 efgh 70.8 defgh 67.3 abcdef 74.0 efgh 75.3 fgh 67.2 bcdefgh 66.2 abcde 73.1 efgh 76.4 gh 67.3 cdefgh 76.3 h 68.5 bcdefg 69.7 cdefgh 72.9 efgh 59.4 abcde 71.0 defgh 69.6 cdefgh 21.3 a 26.7 ab 60.7 abcd 32.3 ab 52.7 abc CV 9.54 p= ***

27 RESULTADOS a b c Fig. 10. Cultivo dual entre T. asperellum- 28A (a) y F. solani (b); Testigo= F. solani (c) a las 192 horas

28 RESULTADOS Fig. 11. Cepas de Trichoderma spp. vs. Fusarium solani

29 RESULTADOS Tabla 9. Análisis de contrastes sobre el porcentaje de supresión del crecimiento micelial de F. solani en presencia de los diferentes tratamientosa las 48, 72 y 192 horas. # Contrastes (Gupo 1 vs. Gr. 2) Tratamientos (Gr. 1 vs. Gr. 2) Significancia (P=) 48 h 72 h 192 h 1 Trichoderma spp. vs. Fungicidas comerciales T1-18, 24 vs. T21-23 <0.0001*** <0.0001*** <0.0001*** Promedios % T. asperellum vs. Fungicidas comerciales T1, 3-7, vs T21-23 <0.0001*** <0.0001*** <0.0001*** Promedios % T. harzianum vs. Fungicidas comerciales T9-11, 24 vs. T21-23 <0.0001*** <0.0001*** <0.0001*** Promedios % T. asperellum vs. T. harzianum T1, 3-7, vs. T9-11, 24 <0.0001*** *** ns Promedios % P: nivel de probabilidad; ***= altamente significativo (P<0.001); ns= no significativo.

30 RESULTADOS a Fig. 12. Porcentaje supresión crecimiento micelial de R. solani en presencia de los diferentes tratamientos en un périodo de 24 hasta 192 hora 192 h 75.6 defgh 78.1 gh 71.1 abcde 75.6 efgh 74.7 defgh 74.4 bcdefgh 76.4 fgh 75.2 defgh 71.5 abcde 74.8 defgh 74.4 cdefgh 74.7 defgh 77.2 fgh 74.0 bcdefg 70.3 abcd 78.0 gh 69.5 abcde 73.0 abcdef 78.0 h 51.2 abc a 78.8 fgh 35.3 a 48.8 ab CV 4.16 p= ***

31 RESULTADOS a b c Fig. 13. Cultivo Dual entre T. asperellum-1a (a) y R. solani (b); Testigo = R. solani (c) a las 192 horas

32 RESULTADOS Fig. 14. Cepas de Trichoderma spp. vs. Rhizoctonia solani

33 RESULTADOS Tabla 7. Análisis de contrastes sobre el porcentaje de supresión del crecimiento micelial de R. solani en presencia de los diferentes tratamientos a las 48, 72 y 192 horas # Contrastes (Grupo 1 vs. Gr. 2) 1 Trichodermaspp. vs. Fungicidas comerciales Tratamientos (Grupo 1 vs. Gr. 2) T1-18, 24 vs. T21-23 Significancia (p=) 48 h 72 h 192 h <0.0001*** <0.0001*** <0.0001*** Promedios% T. asperellum vs. Fungicidas comerciales T1, 3-7, vs. T21-23 <0.0001*** <0.0001*** <0.0001*** Promedios% T. harzianum vs. Fungicidas comerciales T9-11, 24 vs. T21-23 <0.0001*** <0.0001*** <0.0001*** Promedios % T. asperellum vs. T. harzianum T1, 3-7, vs. T9-11, ns ns * Promedios% P: nivel de probabilidad; ***= altamente significativo (P<0.001); ns= no significativo.

34 RESULTADOS Fig. 15. Porcentaje supresión crecimiento micelial de A. rolfsii en presencia de los diferentes tratamientos en un periodo de 24 a 192 horas. 192 h 71.7 abcdef 67.3 abcd 73.7 cdefgh 79.3 ghi 70.1 abcde 77.7 fghi 76.1 efghi 81.3 hi 73.3 bcdefg 73.7 cdefgh 75.3 defghi 72.9 bcdefg 76.5 efghi 72.1 abcdef 76.1 efghi 77.7 fghi 52.2 abc 73.3 bcdefg 38.5 abc -1.2 a 9.5 ab 95.2 i 85.7 fghi 100. i CV 8.18 p= ***

35 RESULTADOS a b c Fig. 16. Cultivo Dual entre T. asperellum-22c (a) y A. rolfsii (b); Testigo= A. rolfsii (c) a las 192 horas.

36 RESULTADOS Fig. 17. Cepas de Trichoderma spp. vs. A. rolfsii

37 Tabla 8. Análisis de contrastes sobre el porcentaje de supresión del crecimiento micelial de A. Rolfsii en presencia de los diferentes tratamientos a las 48, 72 y 192 horas. # RESULTADOS Contrastes (Grupo 1 vs. Gr. 2) Tratamientos (Grupo 1 vs. Gr. 2) Significancia (p=) 48 h 72 h 192 h 1 Trichodermaspp. vs. Fungicidas comerciales T1-18, 24 vs. T21-23 <0.0001*** <0.0001*** <0.0001*** 2 T.asperellum vs. Fungicidas comerciales Promedios% T1, 3-7, vs. T21-23 <0.0001*** <0.0001*** <0.0001*** 3 T. harzianum vs. Fungicidas comerciales Promedios% T9-11, 24 vs. T21-23 <0.0001*** <0.0001*** <0.0001*** 4 T. asperellum vs. T. harzianum Promedios% T1, 3-7, 12-18vs.T9-11, 24 <0.0001*** <0.0001*** <0.0043** Promedios% P: nivel de probabilidad; *** o **= significancia alta o moderada (P<0.001 o <0.01); ns= no significativo.

38 RESULTADOS Fig. 18. Porcentaje supresión crecimiento micelial de P. capsici en presencia de los diferentes tratamientos en un periodo de 24 a 192 horas 192 h 77.7 cdefgh 77.1 cdefg 73.0 abcd 80.7 ghi 71.3 abc 79.5 fghi 74.8 abcdef 80.1 ghi 74.7 abcdefg 76.5 cdefg 76.6 bcdefg 74.8 abcdef 77.7 cdefgh 74.2 abcdef 75.5 abcdefg 79.5 efghi 78.9 defghi 74.6 abcde 80.7 ghi 53.7 ab 41.5 a 88.9 hi 100. i 100. i CV 3.39 p= ***

39 RESULTADOS a b c Fig. 19. Cultivo Dual entre T. longibrachiatum-12a (a) y P. capsici (b); Testigo P. capsici (c) a las 192 horas.

40 RESULTADOS Fig. 20. Cepas de Trichoderma spp. vs. P. capsici

41 Tabla 9. Análisis de contraste sobre el porcentajede supresión del crecimiento micelial de P. capsici en presencia de los diferentes tratamientos a las 48, 72 y 192 horas # RESULTADOS Contrastes (Grupo 1 vs. Gr. 2) Tratamientos (Grupo 1 vs. Gr. 2) Significancia (P=) 48 h 72 h 192 h 1 Trichoderma spp. vs. Fungicidas comerciales T1-18, 24 vs. T21-23 <0.0001*** <0.0001*** <0.0001*** Promedios% T. asperellum vs. Fungicidas comerciales T1, 3-7, vs T21-23 <0.0001*** <0.0001*** <0.0001*** Promedios% T. harzianum vs. Fungicidas comerciales T9-11, 24 vs. T21-23 <0.0001*** <0.0001*** <0.0001*** Promedios % T. asperellum vs. T. harzianum T1, 3-7, 12-18vs.T9-11, * * ns Promedios % P: nivel de probabilidad; *** o *= significancia alta o leve (P<0.001 o <0.05); ns= no significativo

42 RESULTADOS Fig. 21. T- comercial PHC PlantSchield (T. harzianum) vs. fitopatogenos

43 RESULTADOS Fig. 22. T-comercial Mycobac ( T. lignorum) vs. Fitopatogenos

44 RESULTADOS Tabla 10. Cepas de Trichoderma spp. según el nivel de antagonismo contra los fitopatógenos. Nivel de Antagonismo Fitopatógeno F. solani R. solani A. rolfsii P. capsici Nulo 0 Unid. % Unid. % Unid. % Unid. % Bajo Moderado Alto Muy alto Total

45 CONCLUSIONES Las cepas nativas de Trichoderma spp. resultaron efectivas in vitro contra los fitopatógenos F. solani, R. solani, A. rolfsii y P. capsici, mostrando niveles de supresión desde moderado a alto. Las cepas nativas y comerciales de Trichoderma spp. mostraron mayor efecto antagónico que los fungicidas comerciales orgánicos y químico-sintéticos sobre los fitopatógenos. Las cepas nativas de Trichoderma spp. presentaron mayor efecto antagónico sobre los fitopatógenos que las cepas comerciales T. harzianum y T. lignorum; En los análisis de contraste, los grupos que mejores resultaron contra F. solani y R. solani fueron Trichoderma spp., T. asperellum y T. harzianum a las 192 horas. En cambio los fungicidas comerciales (azoxistrobina y aceites vegetales) fue el grupo que mayor eficiencia presentó contra A. rolfsii y P. capsici.

46 RECOMENDACIONES Realizar experimentos probando la eficiencia de los aislados de Trichoderma frente a los fitopatógenos F. solani, R. solani, A. rolfsii y P. capsici a nivel de invernadero y campo. Evaluar las mismas y otras cepas nativas de Trichoderma spp., in vitro y bajo condiciones de ambiente protegido, para el control de hongos fitopatógenos de suelo.

47 AGRADECIMIENTOS A Dios ante todo por haberme dado la fortaleza y perseverancia necesarias para poder alcanzar esta meta y llegar a feliz termino. Consejo Nacional de Investigaciones Agropecuarias y Forestales (CONIAF). A mis asesores Dr. Colmar Serra y la Dra. Graciela Godoy de Lutz. Al Ing. Elpidio Avilés por haberme permitido realizar esta investigación dentro del proyecto del cual era líder financiado por el CONIAF, gracias. A la Universidad Autónoma de Santo Domingo (UASD). Al Instituto Dominicano de Investigaciones Agropecuarias y Forestales (IDIAF). A todos los profesores. A todos mis compañeros de maestría.

48 REFERENCIAS García, R; Riera, R; Zambrano, C; Gutiérrez, L Desarrollo de un fungicida biológico a base de una cepa de Trichoderma harzianum proveniente de la Región Andina Venezolana. Fitosanidad. 10(2): p García, S., Moya, JD., Núñez, P., Andújar, F., Avilés, E Efectividad in vitro de cepas de Trichoderma spp. en la supresión del crecimiento micelial fitopatogenos de suelos. 6to. Congreso SODIAF. Resúmenes. Juan Dolio, San Pedro de Macorís. República Dominicana. p.18. García P. S., Moya J.D., Avilés E., Andújar F., Núñez P.A Efectividad de Trichoderma spp. sobre el crecimiento micelial de fitopatógenos de suelo en plato Petri. Sociedad Dominicana de Investigadores Agropecuarios y Forestales, Revista APF, 4(2). Hubert, R Diagnostico de manejo e identificación de microorganismos patógenos presentes en el cultivo de ají (Capsicum annuum L.) bajo invernadero en San José de Ocoa, República Dominicana. Tesis para optar por el título de Máster en Ciencias Manejo Integrado de Plagas. Universidad Autónoma de Santo Domingo (UASD). 70 p. Moya, J.D.; García, S.; González, J.L Efecto de Trichoderma spp. en el crecimiento micelial de hongos fitopatógenos de suelo en platos de Petri. XLIX reunión anual del Programa Cooperativo Centroamericano para el Mejoramiento de Cultivos y Animales (PCCMCA), desde 27 abril al 3 mayo, Resúmenes, p. 68. La Ceiba, Honduras. Samuels, G Trichoderma: a guide to identification and biology. United States Department of Agriculture.Agricultural Research Service.Systematic Botany and Mycology Laboratory.Beltsville, USA. 40 p.

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