VII Congreso SEAE Zaragoza 2006 Nº 107

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1 INTERACCIONES ENTRE TRICHODERMA PERS. Y LOS HONGOS TUBER MELANOSPORUM VITT. Y EL CONTAMINANTE DE VIVEROS SPHAEROSPORELLA BRUNNEA (ALB. Y SCHWEIN.) SVRČEK Y KUBIČKA S. Sánchez (*), J. Barriuso (*), C. Palazón (**) (*) Escuela Politécnica Superior (EPSH) Universidad de Zaragoza. Ctra. Cuarte s/n Huesca, España; @ unizar.es, barriuso@unizar.es (**) Centro de Investigación y Tecnología Agroalimentaria (CITA) Gobierno de Aragón. Apartado 727, Zaragoza, España; cpalazón@aragon.es RESUMEN Trichoderma Pers. es un género de hongos que están presentes en la mayoría de los suelos y son objeto de múltiples trabajos sobre control biológico de enfermedades causadas por hongos telúricos y aéreos debido a sus propiedades antagonistas. Sphaerosporella brunnea (Alb. y Schwein.) Svrček y Kubička, es un ascomiceto formador de ectomicorrizas que coloniza rápidamente las raíces de los árboles y causa muchos problemas en los viveros dedicados a la producción de encina micorrizada con Tuber melanosporum Vitt. En este trabajo se ha pretendido evaluar las posibilidades del empleo de hongos del género Trichoderma para controlar la aparición e incidencia de Sphaerosporella brunnea, comprobando además los efectos que dicho género causa sobre el establecimiento de Tuber melanosporum en las raíces de las plantas de vivero. A partir de una colección de aislados de Trichoderma spp. procedentes de suelos truferos se seleccionaron dos de ellos, pertenecientes a la especie T. harzianum y con distinto poder competidor para ser probados frente al hongo Sphaerosporella brunnea. El primer ensayo consistió en la inoculación conjunta de encinas de vivero con T. melanosporum y T. harzianum, concluyéndose que Trichoderma no influye negativamente en la micorrización de la plantas de encina por Tuber melanosporum. En segundo lugar, se enfrentaron in vitro los dos aislados de T. harzianum contra Dichobotrys brunnea Hennebert (anamorfo de S. brunnea), comprobando que ambos se comportaban como antagonistas del hongo contaminante. Parece por tanto que el empleo de Trichoderma puede ser positivo para paliar los efectos negativos de S. brunnea. Palabras clave: trufa negra, micorrización, micorriza marrón de los invernaderos, lucha biológica INTRODUCCIÓN Trichoderma Pers. es un género de hongos que están presentes en la mayoría de los suelos y son objeto de múltiples trabajos sobre control biológico de enfermedades causadas por hongos telúricos y aéreos debido a sus propiedades antagonistas frente a ellos (Monte y García Acha, 1991; Lorito et al., 1996). Sphaerosporella brunnea Sverčk y Kubička es un ascomiceto que forma ectomicorrizas en las fases tempranas del desarrollo de las plantas y con mucha rapidez, por lo que su presencia resulta problemática en viveros de producción de árboles micorrizados con determinadas especies de hongos, como es el caso de la producción de encinas micorrizadas con Tuber melanosporum Vitt (Danielson, 1984; García-Montero et al., 1997). La lucha química contra este hongo es efectiva pero provoca una disminución de la presencia de T. melanosporum en la raíz (Lacal, 2000, Palazón et al., 2005), por lo

2 que en este trabajo se estudió la posibilidad de emplear hongos del género Trichoderma como agentes de control biológico. Para ello se analizaron las interacciones in vitro entre el anamorfo de S. brunnea (Dichobotrys brunnea Hennebert) y dos aislados de T. harzianum, así como el efecto de la incorporación de los mismos sobre el establecimiento de micorrizas de T. melanosporum en las raíces de las encinas (Cartié et al., 1996 a y b, Cartié et al., 1999). MATERIAL Y MÉTODOS Material fúngico Los dos aislados de Trichoderma harzianum empleados (T1 y T50) procedieron de los quemados de dos encinas, una en Bolea (Huesca) el T1 y otra en Litago (Zaragoza) el T50. Se aislaron mediante siembra del suelo según el método descrito por Sánchez (2001) en medio selectivo TSM (Trichoderma Selective Médium) (Askew y Laing, 1993) y se mantuvieron en medio PDA (Patata Dextrosa Agar), para su identificación posterior y se emplearon tanto en los enfrentamientos en placa como en las inoculaciones realizadas en vivero. T1 y T50 fueron seleccionados del conjunto de aislados obtenidos a partir de las muestras de suelos truferos por sus velocidades de crecimiento y esporulación, más altas en el caso de T50. Ambos proceden de suelos con altos phs característico de los suelos truferos (en torno a 8) ya que los hongos del género Trichoderma se encuentran en menor medida en estos suelos que en los ácidos (Miranda et al., 1996). El aislado de Dichobotrys brunnea empleado procedió de los invernaderos del CITA (Zaragoza). Se mantuvo en crecimiento en medio PDA. La trufa con la que se inocularon las plantas procedió de la comarca del Somontano del Moncayo (Zaragoza). Los carpóforos fueron limpiados cuidadosamente (cepillando la superficie y esterilizándola con alcohol), secados a temperatura ambiente y triturados en molino de bolas hasta obtener un polvo de trufa de grano fino. Material vegetal Se emplearon encinas de 6-8 hojas verdaderas producidas a partir de bellotas recogidas de la encina centenaria de Radiquero (Huesca), mediante siembra en lecho de perlita, recubierto con vermiculita nº 3 en contenedores de 600cc. Enfrentamientos en placa Se colocaron discos de 5mm de micelio de Dichobotrys brunnea a 2,5cm del borde de placas de Petri de 9cm con medio PDA y a los 18 días se colocaron a igual distancia otros de Trichoderma. Los discos miceliares procedieron de cultivos jóvenes. Se incubaron a 24 ºC en oscuridad. Se realizaron cuatro repeticiones del enfrentamiento por cada uno de los aislados de Trichoderma harzianum y dos testigos de cada hongo. Mediciones del antagonismo a distancia: 1.- Menor distancia entre ambas colonias en la zona de inhibición (ZI) (Vaidya et al., 2004). 2.- Porcentaje de inhibición sobre el control: que se calcula empleando la fórmula (Girlanda et al., 1995): 100 x [(R-r)/R]

3 Siendo R, el radio alcanzado por Dichobotrys brunnea en la placa testigo en dirección hacia el centro de la placa; y r, el alcanzado por el mismo hongo en la misma dirección en el cocultivo. Análisis de las interacciones en contacto (Girlanda et al., 1995): 1.- Crecimiento de una colonia sobre otra. 2.- Colonización de las hifas de un hongo por las del otro. 3.- Disminución de masa miceliar de algún hongo. 4.- Alteraciones miceliares de uno u otro hongo. Inoculaciones El método de micorrización fue el de inmersión de las raíces de las plantas en una solución de alginato sódico al 0,75%, que facilita la adherencia de las esporas a la raíz, seguida del espolvoreo de la trufa (3 gramos de trufa por planta, siempre referidos a pesos de trufa fresca), antes de su deshidratación, a lo largo del aparato radical de las plantas, antes de su trasplante al contenedor. Los dos aislados de Trichoderma harzianum se inocularon 7 días después que Tuber. Las placas de ambas cepas se vaciaron, medio de cultivo incluido, en un vaso de precipitados con agua estéril, y se trituraron con un homogeneizador de vástago para no destruir las esporas, acto seguido se filtró el contenido del vaso con una gasa estéril, recogiendo así una suspensión de esporas de Trichoderma cuya concentración se calculó empleando una cámara Neubauer. Acto seguido se inocularon mediante riego de los contenedores de las plantas con 20 ml de varias suspensiones seriadas de esporas en agua estéril, obtenidas a partir de la antes mencionada de concentración conocida. Fueron: C1: 1120 esporas/ml, C2: esporas/ml y C3: esporas/ml. El ensayo constó de 10 variables con 10 plantas por cada una: Plantas micorrizadas con T. melanosporum e inoculadas con T1 y T50 a las 3 concentraciones, 60 plantas. Testigos: micorrizados y no inoculados con Trichoderma. 10 plantas. no micorrizados e inoculados con T1 y T50 en concentración media (C2), 20 plantas. no micorrizados y no inoculados con Trichoderma, 10 plantas. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Enfrentamientos en placa Medida de la zona de inhibición (ZI): Existe zona de inhibición entre las colonias de ambos hongos, para las dos cepas de Trichoderma harzianum y en todas las repeticiones, lo cual prueba la liberación al medio de sustancias antibióticas por parte de uno o de los dos hongos (Girlanda et al., 1995). La longitud media de la zona de inhibición en las cuatro repeticiones de los dos tipos de enfrentamiento resultó muy similar, alrededor de 4,3 mm, según se observa en el Cuadro 1.

4 Cuadro 1. Medidas de la menor distancia entre colonias en la zona de inhibición en mm. Enfrentamientos Medidas de ZI en cada repetición del enfrentamiento Media T1 - D. brunnea ,25 T50 D. brunnea 2, ,37 En los enfrentamientos efectuados con el aislado T50 la zona de interacción se coloreó de morado debido a la precipitación de metabolitos secundarios producidos por la colonia de T50, hecho que no se produjo en el caso de T1, lo cual parece indicar que la cepa T50 produce un mayor número de sustancias antibióticas que la T1. La composición química de estos precipitados podría ser objeto de estudios posteriores. Porcentaje de inhibición sobre el control: En el Cuadro 2 se observa que ambas cepas de Trichoderma harzianum ejercen cierta inhibición del crecimiento de Dichobotrys brunnea en comparación con el control y que apenas existe diferencia entre los porcentajes de inhibición de las dos. Cuadro 2. Cálculo del porcentaje de inhibición sobre el control. Enfrentamientos r (cm) R (cm) % inhibición sobre el control T1 - D. brunnea 3,49 5,5 36,56 T50 D. brunnea 3,41 5,5 38,02 R: tamaño medio alcanzado por los dos controles de Dichobotrys brunnea en dirección al centro de la placa; r: tamaño medio alcanzado por las colonias de D. brunnea en las cuatro repeticiones del enfrentamiento con las dos cepas de Trichoderma. El hecho de que exista zona de inhibición y porcentaje positivo de inhibición sobre el control, prueba que las dos cepas de Trichoderma harzianum son antagonistas de Dichobotrys brunnea, en cuanto a antibiosis (inhibición a distancia) se refiere, aunque no se han apreciado diferencias significativas entre ellas. Análisis de las interacciones en contacto: Ambos aislados crecieron y esporularon sobre la colonia de Dichobotrys brunnea, aunque la cepa T50 lo hizo con mayor abundancia y rapidez que la T1, y también con mayor frecuencia: con la T1 sólo sucedió en la mitad de las repeticiones, con la T50 en todas ellas. Debido a que el crecimiento de una colonia sobre otra, o de ambas a la vez, sin que exista ningún tipo de penetración de las hifas de una en la otra, es poco frecuente (Girlanda et al., 1995), podemos asegurar que los dos aislados de Trichoderma harzianum son capaces de micoparasitar, en mayor o menor grado, a Dichobotrys brunnea. El comienzo del crecimiento de las colonias de ambas aislados de Trichoderma sobre las del hongo competidor sucedió aproximadamente a los 7 días de la colocación de sus discos miceliares en las placas. Existe una evidente disminución del tamaño de la colonia de Dichobotrys brunnea, más acusada en las placas de T50 que en las de T1, lo cual se debe a que ambos se han alimentado de este último. Los dos aislados formaron esporas antes que sus testigos, señal del mecanismo de alerta que desencadena la presencia de un competidor. Esta aceleración de la

5 reproducción es un mecanismo que se observa con mucha frecuencia en este tipo de ensayos y se supone beneficioso para el hongo pero debe hacerse a expensas de un menor desarrollo vegetativo (Cooke y Whipps, 1993). Todos estos datos nos permiten concluir que Trichoderma harzianum T1 y T50, además de a distancia, son antagonistas de Dichobotrys brunnea en contacto, ya que crecieron sobre él y provocaron la disminución de su masa miceliar (Girlanda et al., 1995), aunque el T50 es mucho más agresivo que el T1 y además crece con mayor rapidez, por lo tanto es mejor competidor. Las diferentes cepas de Trichoderma presentes en la naturaleza poseen muy variados efectos inhibitorios sobre otros hongos (Hadar et al., 1979), lo cual es muy deseable en nuestro caso ya que nuestra intención es comprobar la posibilidad de evitar los problemas creados por Sphaerosporella brunnea (teleomorfo de Dichobotrys brunnea) en los viveros, sin perjudicar a la trufa. Como desconocemos el efecto de Trichoderma sobre Tuber melanospourm, fue esencial que las dos cepas que iban a ser inoculadas tuvieran diferentes propiedades. Ambas debían ser antagonistas de Dichobotrys brunnea, pero una menos agresiva, para evitar un posible efecto negativo sobre Tuber o sobre los hongos que propician la formación de sus micorrizas, y la otra más agresiva por si no ejerciese efecto negativo sobre Tuber. En nuestro caso, T1 y T50 respectivamente. La técnica de enfrentamiento en placa ha sido muy criticada, ya que las diferencias en la concentración, disponibilidad y distribución de los nutrientes en comparación con los sustratos naturales son muy grandes, de todas formas este método es muy efectivo para conocer el potencial antagonista de un hongo dado sobre otro en condiciones nutricionales y ambientales conocidas y para obtener información detallada sobre las interacciones que suceden a nivel de hifa individual (Girlanda et al., 1995). Inoculaciones Como se observa en los Cuadros 3 y 4, los porcentajes de micorrización por Tuber melanosporum de las raíces de las encinas en ausencia y en presencia de Trichoderma son similares, aunque se produce un porcentaje el doble de grande en cuanto a mortalidad de encinas en el segundo caso, lo cual se debe al efecto sinérgico producido por la inoculación conjunta de los dos hongos, ya que aunque los hongos del género Trichoderma no forman micorrizas, realizan colonizaciones muy fuertes y duraderas de la rizosfera (Harman et al., 2004). Cuadro 3. Medias del porcentaje de micorrización y de mortalidad a los 8 meses de la inoculación con T. melanosporum. Concentración de Cepa T1 Cepa T50 inóculo Media %T.m %mortalidad Media %T.m %mortalidad 1120 esporas/ml esporas/ml , esporas/ml Cuadro 4. Medias del porcentaje de micorrización y de mortalidad a los 8 meses de la inoculación con T. melanosporum en los testigos. Media %T.m %mortalidad Micorrizados y no inoculados con Trichoderma No micorrizados e inoculados con T1 0 0

6 Trichoderma a esp/ml T No micorrizados y no inoculados con Trichoderma 0 0

7 CONCLUSIONES 1.- Los aislados seleccionados, T1 y T50, desarrollaron una gran capacidad antagonista frente a Dichobotrys brunnea (anamorfo de Sphaerosporella brunnea, hongo contaminante de viveros de producción de encina micorrizada con Tuber melanosporum) ya que inhibieron su crecimiento a distancia y crecieron sobre sus colonias micoparasitándolas en apenas una semana. 2.- El aislado T50 resultó tener mayor poder antagonista contra Dichobotrys brunnea que el T1, por su mayor velocidad de crecimiento, por esporular con mayor abundancia sobre la colonia de D. brunnea y por poseer, aparentemente, una mayor capacidad de antibiosis. 3.- La presencia de los dos aislados no influyó negativamente sobre el porcentaje de micorrización de las raíces por Tuber melanosporum, aunque dobló incrementó el porcentaje de mortalidad de las encinas. BIBLIOGRAFÍA Askew, D.J., y Laing, M.D., An adapted selective médium for the quantitative isolation of Trichoderma species. Plant Pathology 42, pp: Cartié G., Palazón C., Barriuso J., Delgado I., 1996 a. Un nuevo método de inoculación de Quercus ilex L. por Tuber melanosporum Vitt., Montes, 46, Cartié G., Palazón C., Delgado I., Barriuso J., 1996 b. Influencia de los substratos y geles utilizados en la micorrización de Q. ilex por Tuber melanosporum Vitt. Información Técnica Económica Agraria, 92 V(2), Cartié G., Palazón C., Delgado I., Barriuso J., Influencia del método de inoculación, del tipo de substrato y de la procedencia de la trufa, en la micorrización de Quercus ilex L. por Tuber melanosporum Vitt., y en la supervivencia de las plantas. Actas V International Congress Science and Cultivation of Truffle, Cooke, R.C., y Whipps, J.M., Ecophysiology of fungi. Blackwell scientific publications. Danielson, R.M., Ectomycorrhiza formation by the operculate discomycete Sphaerosporella brunnea (Pezizales). Mycologia, 76 (3), pp: García Montero, L. G., Galán, R., Massimo, G., Manjón, J. L., Díez, J Sphaerosporella brunnea ( Alb. et Schwein) Svrcek et Kubicka, un discomicete con incidencia en la truficultura e interés forestal. Revista Catalana de micología, vol. 20, pp: Barcelona. Girlanda, M., Varese, G.C., Luppi-Mosca, A.M., In vitro interactions between saprotrophic microfungi and ectomycorrhizal symbionts. Allionia 33, pp: Hadar, Y., Chet, I., Henis, Y., Biological control of Rhizoctonia solani damping-off with wheat bran culture of Trichoderma harzianum. Phytopathology 69, pp: Harman, GE, Howell, C.R., Viterbo, A., Chet, I., Lorito, M Trichoderma speciesopportunistic, avirulent plant symbionts. Nat Rev Microbiol. 2 (1), pp: (abstract) Lacal, G., Estudios básicos para el control de Sphaerosporella brunnea (A. and S. ex Fr.) en los viveros de producción de encina (Quercus ilex L.) micorrizada con trufa negra (Tuber melanosporum Vitt.). Trabajo fin de carrera, ITA, Universidad de Zaragoza (EPSH). Inédito. Lorito, M., Woo, S.L., D ambrosio, M.D., Harman, G.E., Hayes, C.K., Kubicek, C.P. Y Scala, F., Synergistic interaction between cell wall degrading enzimes and membrane affecting compounds. Molec. Plant-Microbe Interact. 9, pp:

8 Miranda, I., Martínez, B., Paula, S.D., Application of a method of the response surface to optimization of the growth and sporulation of Trichoderma sp. Revista de protección vegetal. Vol 11 (2), pp: Monte, E., y García-Acha, I., Control biológico, micopesticidas. En: Temas de Microbiología. Vol IV. pp: Palazón C., Barriuso J. Delgado I., Lucha química contra el contaminante Sphaerosporella brunnea (Alb. et Schwein.) Svrcek. et Kubicka, responsable de la micorriza marrón de los invernaderos de producción de planta micorrizada con trufa negra (Tuber melanosporum Vitt.). 4º Congreso Forestal Español. Sociedad Española de Ciencias Forestales. Libro de resúmenes, p.253. Publicación completa en CD, Zaragoza, septiembre de Sánchez, S., Estudio del establecimiento de cepas de biocontrol de Trichoderma sobre suelos dedicados a la producción de planta y fruto de fresón. Efecto sobre la producción de planta de vivero. Trabajo fin de carrera, ITA, Universidad de Salamanca. Inédito. Vaidya, M., Shanmugam, V., Gulati, A., Evaluation of bio-control agents against Fusarium isolates infecting carnation and gladiolus. Ann. Pl. Protec. Sci. 12 (2), pp: